馬夢男 高欣欣 劉春龍 張舟 王夢凡（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

近年來由于抗生素、激素、免疫抑制藥的不恰當(dāng)使用導(dǎo)致人體免疫力低下抗真菌感染能力大大減弱，致使侵襲性曲霉?。╥nvasive aspergillosis，IA）的患病率和病死率逐年增長。其中中性粒細(xì)胞缺乏、器官移植及血液病/惡性腫瘤、慢性阻塞性肺病、免疫缺陷等是導(dǎo)致IA的高危因素［1］。在流行病學(xué)上，曲霉菌屬于機(jī)會性感染真菌，曲霉孢子從呼吸道吸入，在肺部形成病灶造成侵襲性肺部曲霉感染（invasive pulmonary aspergillus infections，IPAI）［2-3］。其中半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）是曲霉細(xì)胞壁表達(dá)釋放的一種特異性多糖即曲霉半乳甘露聚糖，生長時會由菌絲的頂端釋放到外界環(huán)境中。GM抗原被公認(rèn)為曲霉感染后首先釋放到血液的標(biāo)志物，其釋放量與曲霉量成正相關(guān)，可代表患者的曲霉感染程度，因此曲霉特異性表達(dá)抗原GM的檢測對IA的早期診斷具有極為重要的意義［4-6］。

目前傳統(tǒng)的微生物學(xué)培養(yǎng)、組織病理學(xué)及影像學(xué)檢查仍是診斷曲霉菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但真菌微生物培養(yǎng)耗時長、組織病理學(xué)有創(chuàng)檢測敏感性和精確性較低。影像學(xué)檢查特異性低難以與肺部的其他感染區(qū)分，對早期臨床診斷指導(dǎo)意義有限。近年來隨著分子生物學(xué)和生物傳感器技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)方法RT-PCR、恒溫擴(kuò)增等技術(shù)廣泛用于侵襲性真菌的診斷。但真菌細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白組成，結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜。曲霉細(xì)胞壁DNA較難提取，致使真菌核酸診斷不能在臨床上廣泛使用。血清學(xué)檢測可作為傳統(tǒng)方法及分子生物學(xué)的重要補(bǔ)充。目前臨床實(shí)驗室主要利用GM實(shí)驗（ELISA）檢測GM，臨床上也常用1，3-β-D葡聚糖（G實(shí)驗）和GM實(shí)驗聯(lián)合檢測患者體內(nèi)特異性GM，但ELISA檢測時間長，操作步驟繁瑣，敏感性和特異性變化較大［7-9］。為了彌補(bǔ)ELISA檢測的缺陷，本文利用儀器自動化平臺和免疫測定技術(shù)，建立了GM磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法（CLIA）檢測體系［10］。CLIA中懸浮性磁微粒作為固相載體具有較高的比表面積，整個免疫反應(yīng)在均相體系中進(jìn)行，增大了抗原與抗體特異性結(jié)合的概率，大大提高反應(yīng)特異度和靈敏度；另外自動化設(shè)施的應(yīng)用，使檢測更加快速、準(zhǔn)確，在生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)以及環(huán)境、藥物等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。基于此，本文針對曲霉菌感染所產(chǎn)生的GM抗原標(biāo)志物，研究開發(fā)出一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測時間短、自動化操作的CLIA檢測方法［11-12］。并對該方法性能指標(biāo)進(jìn)行評價，為IA感染臨床診斷提供技術(shù)支持［13］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器GM、莢膜多糖抗原（glucyro?noxylomannan，GXM）、甘露聚糖抗原（mannosan，MN）購自天津丹娜（生物）科技股份有限公司；Plate?liaTM曲霉菌抗原檢測試劑盒購自Bio-Rad公司；其他常用試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。全自動化學(xué)發(fā)光分析儀SMART 6500購自重慶科斯邁生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購自帝肯奧地利有限責(zé)任公司；HDL生物安全柜購自北京東聯(lián)哈爾儀器；DS-11超微量紫外/可見分光光度計購自美國DeNovix公司。

1.1.2 實(shí)驗動物新西蘭大白兔（2~3 kg/只）由北京隆安實(shí)驗動物養(yǎng)殖中心提供和飼養(yǎng)，動物合格證號為SCXK（京）2019-0006。

1.1.3 血清標(biāo)本收集天津胸科醫(yī)院曲霉血清陽性樣本100份，健康人血清標(biāo)本220份。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫及血清效價測定將GM抗原的生理鹽水稀釋液與等比例的弗氏完全佐劑（初免）和不完全佐劑（后續(xù)免疫）乳化混勻，采用皮下注射法免疫新西蘭兔，2次加強(qiáng)免疫后對兔耳動脈采血離心得到抗血清，使用間接法測定血清中特異性抗體的效價。用0.02 mol/L PBS倍比梯度稀釋抗血清從1∶1 000開始直至稀釋到1∶512 000，稀釋液4℃保存?zhèn)溆?。然后分別包被GM、GXM、MN酶標(biāo)板；采用酶聯(lián)免疫間接法測定上述稀釋液的吸光值A(chǔ)（450 nm/620 nm）。將A值在1.0附近的抗血清的稀釋倍數(shù)作為效價。

1.2.2 多克隆抗體制備及電泳鑒定將獲得的抗血清離心后，上清用55%飽和硫酸銨2次鹽析，再用0.02 mol/L PBS 4℃過夜透析，將透析產(chǎn)物采用Protein A瓊脂糖凝膠親和層析，獲得高純度的多克隆抗體，并用SDS-PAGE電泳鑒定其分子量。使用超微量紫外/可見分光光度計測其濃度。

1.2.3 GM磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測體系的建立

1.2.3.1 磁微粒體系的制備將混勻的鏈霉親和素磁珠在磁微粒架上靜置，待磁微粒全部沉降后，棄去上清，加入3倍磁微粒緩沖液（0.02 mol/L PBS，0.5%Tween20）混勻，靜置，洗滌。用0.02 mol/L PBS稀釋液將鏈霉親和素磁珠溶液配制成1 mg/ml的母液，混勻放置2~8℃冰箱備用。

1.2.3.2 生物素標(biāo)記抗GM抗體的制備將抗GM與生物素水溶液按質(zhì)量10∶1比例混合避光，室溫反應(yīng)1~2 h。0.02 mol/L PBS透析過夜，每隔2 h透析1次，透析5次。收集透析產(chǎn)物，最終用0.02 mol/L PBS的稀釋液配制成1μg/ml的母液，混勻放置2~8℃冰箱備用。

1.2.3.3 吖啶磺酰胺標(biāo)記抗GM抗體的制備將抗GM抗體與活化吖啶磺酰胺按照質(zhì)量10∶1比例混勻避光，室溫反應(yīng)45 min。加一定體積15%賴氨酸終止液，混勻避光，室溫反應(yīng)45 min后透析，透析方法同1.2.3.2。收集透析產(chǎn)物，最終用0.02 mol/L PBS的稀釋液配制成5μg/ml的母液，混勻放置2~8℃冰箱備用。

1.2.4條件優(yōu)化

1.2.4.1 磁微粒濃度的選擇選擇最優(yōu)磁微粒濃度，設(shè)置不同濃度梯度：0.1、0.5、1.0 mg/ml，將陽性和陰性檢測信號發(fā)光值的比值（P/N）作為考核指標(biāo)。

1.2.4.2 捕獲抗體濃度的選擇選擇最優(yōu)捕獲記抗體濃度，設(shè)置不同濃度梯度：0.2、0.5、1.0μg/ml，在陰性血清里添加不同梯度曲霉抗原，測定其檢測信號發(fā)光值大小和相關(guān)性。

1.2.4.3 檢測抗體濃度的選擇選擇最優(yōu)檢測抗體濃度，設(shè)置不同濃度梯度：1.25、2.5、5.0μg/ml，在陰性血清里添加不同梯度曲霉抗原，測定其檢測信號值大小和相關(guān)性。最終篩選區(qū)分較大的生物素標(biāo)記抗體與吖啶磺酰胺標(biāo)記抗體組合對，建立最優(yōu)體系。

1.2.5 分析性能評估

1.2.5.1 準(zhǔn)確度回收率評估方法如下：選擇高值參考品1份，按1∶9的比例加到低值參考品中，回收標(biāo)本平行檢測3次求均值，計算回收率?；厥章蔙（%）=［C×（V0+VS）-C0×V0］/（CS×VS）×100%（V0：低值參考品的體積，VS：高值參考品的體積，C：回收標(biāo)本的檢測濃度，C0：低值參考品的檢測濃度，CS：高值參考品的檢測濃度）。

1.2.5.2 精密度批內(nèi)精密度（也稱重復(fù)性）用3個不同批次高、中、低標(biāo)本各重復(fù)檢測10次，批間精密度用3個不同批次高、中、低標(biāo)本重復(fù)檢測10次。計算批內(nèi)精密度和批間精密度。

1.2.5.3 分析靈敏度準(zhǔn)備5個接近零濃度樣本分別用3批試劑盒檢測3 d，每個樣本每天做4個重復(fù)（同一設(shè)備檢測）；準(zhǔn)備5個低檢測濃度樣本（1~5倍預(yù)期的LoB）分別用3批試劑盒檢測3 d，每個樣本每天做4個重復(fù)（同一設(shè)備檢測）；準(zhǔn)備5份濃度范圍1~4倍的LoB之間的標(biāo)本，每天各檢測4次，間隔≥2 h，每個指標(biāo)重復(fù)2次，共進(jìn)行5 d。結(jié)果分析計算LoB和LoD。

1.2.5.4 線性范圍將超過預(yù)期線性區(qū)間（0.15~50 ng/ml）上限的高值參考品L1與低于線性區(qū)間下限的低值參考品L2按照一定比例稀釋為11個濃度的樣品；對每一濃度樣品平行測定3次，計算平均檢測濃度（Xi），計算理論濃度Ci=C1×V1+C2×V2/V1+V2（其中Ci為樣品i的理論濃度；C1為高值線性參考品L1的參考濃度；V1為樣品i中高值線性參考品L1的體積；C2為低值線性參考品L2的參考濃度；V2為樣品i中低值線性參考品L2的體積），最終計算出線性范圍。

1.2.5.5 一致性比較采用SPSS22.0軟件對伯樂試劑盒和本研究開發(fā)的GM CLIA進(jìn)行分析。對臨床健康人血清及曲霉確診樣本的陰陽性符合情況進(jìn)行Kappa一致性分析。Kappa系數(shù)≥0.75，認(rèn)為兩試劑盒檢測結(jié)果呈現(xiàn)高度一致；0.4≤Kappa系數(shù)<0.75，認(rèn)為兩試劑盒檢測結(jié)果一致，基本等效；Kap?pa值<0.4則認(rèn)為兩試劑盒檢測結(jié)果不一致。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS22.0軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 抗血清效價測定和交叉實(shí)驗本研究利用GM作為抗原免疫多只新西蘭兔，通過ELISA間接法篩選獲得分泌針對GM的多克隆抗體。由圖1可知，選擇吸光值在1.0附近的稀釋倍數(shù)為抗體效價，可知該法獲得的多克隆抗體效價為1×104~1×105，且與GXM、MN無交叉反應(yīng)。

圖1 間接ELISA法測定抗GM多克隆抗體效價Fig.1 Determination of anti-GM polyclonal antibody titer by indirect ELISA

2.2 抗GM多克隆抗體電泳鑒定由SDS-PAGE電泳可知（圖2），抗GM多克隆抗體蛋白其分子量為25~55 kD。使用超微量紫外/可見分光光度計直接測得多克隆抗體蛋白濃度為1.87 mg/ml。

圖2 GM抗體SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of aspergillus GM anti?body

2.3 條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 磁微粒濃度的選擇由表1可知，磁微粒濃度在0.5 mg/ml陰陽區(qū)分最大且本底值最低，故選擇0.5 mg/ml為磁微粒最優(yōu)濃度。

表1 磁微粒濃度條件優(yōu)化Tab.1 Optimization of magnetic particle concentration conditions

2.3.2 捕獲抗體濃度的選擇由圖3可知，隨著捕獲濃度由0.2μg/ml增加到0.5μg/ml，檢測發(fā)光值明顯升高；當(dāng)捕獲抗體的濃度增加至1.0μg/ml時，檢測發(fā)光值未見升高。表明捕獲抗體為0.5μg/ml時捕獲抗體能夠充分捕獲到樣本待測物GM抗原并與之充分反應(yīng)。因此選擇捕獲抗體最優(yōu)濃度為0.5μg/ml。

圖3 GM CLIA法捕獲抗體濃度優(yōu)化檢測抗體Fig.3 Optimization of capture antibody concentration by GM CLIA method antibody detection

2.3.3 檢測抗體濃度的選擇由圖4可知，隨著檢測抗體濃度由1.25μg/ml增加到2.50μg/ml，檢測發(fā)光值明顯升高；當(dāng)檢測抗體的濃度增加至5.00μg/ml時，檢測發(fā)光值沒有升高，反而總體呈下降趨勢。表明檢測抗體為2.05μg/ml時，信號值已達(dá)到飽和狀態(tài)。因此選擇檢測抗體的最佳濃度為2.50μg/ml。捕獲抗體0.50μg/ml，檢測抗體2.50μg/ml。

圖4 GM CLIA法檢測抗體濃度優(yōu)化Fig.4 Optimization of antibody concentration by GM CLIA method

2.4 分析性能評估

2.4.1 準(zhǔn)確度由表2可知，所測的10個回收標(biāo)本其回收率在（100±15）%，符合需要。實(shí)驗中10個標(biāo)本的回收率均在允許誤差范圍內(nèi)，故此方法的回收率滿足要求。

表2 GM CLIA法試劑回收率檢測結(jié)果Tab.2 Test results of reagent recovery by GM CLIA method

2.4.2 精密度由表3可知，對3個不同批次高，中，低值參考品標(biāo)本分別測試，分析內(nèi)精密度，分析間精密度均<10%。

表3 GM CLIA法試劑精密度結(jié)果（n=10）Tab.3 Reagent precision results of GM CLIA method（n=10）

2.4.3 分析靈敏度對靈敏度測試結(jié)果進(jìn)行分析計算，得到LoB、LoD分別為0.05、0.08 ng/ml。

2.4.4 線性范圍由表4可知，10個標(biāo)本實(shí)際所測濃度與理論濃度相對偏差均<10%，且其線性相關(guān)性較好。因此本研究建立的檢測體系線性范圍為0.15~50.00 ng/ml。

表4 GM CLIA法試劑線性范圍檢測結(jié)果Tab.4 Results of linear range detection of GM CLIA reagent

2.4.5 一致性比較由表5可知，將兩種測試結(jié)果轉(zhuǎn)化為陰陽性符合情況進(jìn)行分析，Kappa系數(shù)0.88>0.75，因此可認(rèn)為本研究GM CLIA試劑盒與伯樂試劑盒顯示出高度一致性。

表5 GM CLIA法試劑一致性分析Tab.5 Reagent consistency analysis of GM CLIA method

3 討論

本研究基于GM對新西蘭兔進(jìn)行免疫，獲得抗GM多克隆特異性抗體效價在1×104~1×105，能夠特異性識別GM且與GXM、MN無交叉反應(yīng)。通過SDS-PAGE，測得其分子量在25~55 kD左右。從而篩選出了性能較好的抗GM多克隆抗體［13-14］?；贑LIA系統(tǒng)，本文建立了GM CLIA法定性檢測。以期實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏性、高特異性、高準(zhǔn)確度，線性范圍寬的自動化檢測，為GM快速臨床診斷提供有力依據(jù)。

本文研制的GM試劑盒回收率在（100±15）%以內(nèi)，符合要求。分析內(nèi)精密度、分析間精密度均<10%，精密度較好。線性范圍在0.15~50.00 ng/ml，相比較曲霉菌檢測有更廣的線性區(qū)間。分析靈敏度LoB、LoD分別為0.05 ng/ml、0.08 ng/ml。Kappa系數(shù)0.88>0.75，與伯樂試劑盒具有很好的一致性。不足之處在于本研究尚處于初步開發(fā)階段，該方法的體系性能指標(biāo)還需進(jìn)一步評估。如果GM CLIA法檢測體系能夠廣泛應(yīng)用臨床診斷中，必將大大提高GM檢測的特異度和靈敏度。有利于GM的早期診斷及治療效果評價［15］，可實(shí)現(xiàn)對高危人群曲霉感染的動態(tài)監(jiān)測，可對抗真菌治療提供用藥依據(jù)和藥效學(xué)評價，具有較好的推廣運(yùn)用價值。