王小娟 張珺 鮮勝 鄧猛 韓春俐（武漢市第五醫(yī)院檢驗科，武漢 430050）

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是全球常見的惡性消化道疾病之一，是癌癥相關死亡的第六大原因，其發(fā)病率及病死率逐年升高［1］。EC癥狀隱匿，往往會延誤診斷，導致患者確診時已進入晚期，五年生存率不足15%［2］。手術切除、化療、放療等在一定程度上可緩解EC發(fā)展，但其術后風險及副作用不容忽視［3］。因此，尋找新的生物標志物來協(xié)助EC的早期診斷和靶向治療迫在眉睫。

微小核糖核酸（miRNA）是一種長度為18~25個核苷酸的單鏈、進化高度保守的小分子非編碼RNA［4］。由于不具備開放閱讀框等條件而無法編碼蛋白質，miRNA可通過與靶mRNA特異性識別結合，抑制靶mRNA翻譯或影響其穩(wěn)定性，從而調控基因表達；同時，miRNA通過影響腫瘤形成相關的基因和傳導通路調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮促進或抑制作用［5］。其中，miR-383-5p通過靶向作用顯著抑制腫瘤細胞生長，緩解疾病進程，如非小細胞肺癌、胃癌、卵巢癌等，但未見miR-383-5p與EC的關系［6-8］。因此，本研究探討miR-383-5p過表達對EC細胞增殖、侵襲及上皮-間質轉化（epithelial-mesen?chymal transition，EMT）的影響，以期為EC的臨床診斷、靶向治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源人EC細胞Eca-109購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、脂質體Lipofectamine?3000購自美國Thermo公司；miR-383-5p模擬物（mimics）、陰性對照（NC）序列購自上海吉凱基因有限公司；ZEB2過表達質粒購自北京傲銳東源生物科技有限公司；RNA提取試劑TRIzol、RT-PCR試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；ZEB2、Actin等及相關抗體購自上海艾博抗有限公司；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、E-鈣黏蛋白（E-cad）、N-鈣黏蛋白（Ncad）等相關抗體購自美國Thermo Fisher公司；熒光素酶檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司，熒光素酶報告載體由該公司合成。

1.1.3 主要儀器HBS-1096A酶標分析儀購自南京德鐵實驗設備有限公司；Microfuge 20R離心機購自美國貝克曼庫爾特公司；DYC-ZY2電泳儀、垂直電泳槽購自北京東方瑞利科技有限公司；HTC-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱購自上海三騰儀器有限公司；Transwell小室購自美國康寧公司；SW-CJ-2D垂直超凈無菌工作臺購自江蘇博萊爾有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將凍存的Eca-109細胞水浴復蘇，接種于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到85%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代，用于后續(xù)實驗研究。

1.2.2 RT-PCR驗證過表達效率調整細胞密度為1×105個/孔，接種于6孔板，待融合度達60%時更換無血清培養(yǎng)基，采用脂質體Lipofectamine?3000向Eca-109細胞中分別轉染200 nmol miR-383-5p模擬物（過表達組）和陰性對照序列（NC組），并設置未轉染的細胞為空白對照組。向轉染后的細胞中加入1 ml TRIzol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，再根據(jù)PCR試劑盒說明書配制反應溶液，進行PCR反應。以2-ΔΔCt公式計算miR-383-5p表達量，選擇U6為內參基因，實驗重復3次，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.2.3 熒光素酶報告基因實驗 利用Targetscan數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/）預測miR-383-5p的潛在靶點，結果顯示ZEB2可能是miR-383-5p的靶點，采用熒光素酶實驗驗證二者的靶向關系。通過向pGL3-basic載體中插入ZEB2 3'UTR區(qū)與miR-383-5p結合的種子序列（CUGAUCUA）構建熒光素酶報告受體Luc-ZEB2-3'UTR-wt；構建突變型熒光素酶載體Luc-ZEB2-3'UTR-mut，將miR-383-5p mimics和NC序列分別以Lipofectamine3000轉染細胞，48 h后，試劑盒檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.2.4 RT-PCR檢測ZEB2 mRNA表達根據(jù)相應試劑盒說明，分別進行引物設計、總RNA提取、反轉錄、定量PCR，以2-ΔΔCt法計算ZEB2的相對mRNA表達水平，重復3次。

1.2.5 Western blot檢測ZEB2表達為進一步驗證miR-383-5p對ZEB2的調節(jié)作用，將細胞分為空白對照組、單獨轉染miR-383-5p組、單獨轉染ZEB2組、聯(lián)合轉染miR-383-5p/ZEB2組。采用RIPA裂解液裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。分別取各組約30μg蛋白加入10%SDS-PAGE體系，將目的條帶轉膜并封閉2 h，加入稀釋后的ZEB2、Actin一抗，4℃孵育過夜。加入稀釋的二抗，2 h后加入ECL工作液顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，統(tǒng)計灰度值并計算ZEB2表達量。

1.2.6 CCK8法檢測細胞增殖采用CCK8試劑盒檢測細胞增殖水平，將各組細胞密度調整至1×105個/ml，以200μl/孔接種至96孔板，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)4 d，每孔加入20μl CCK8溶液，37℃孵育2 h。酶標儀檢測450 nm處光密度值。

1.2.7 Transwell檢測細胞侵襲將Matrigel膠用PBS稀釋后，包被于Transwell小室底膜上室，下室加入800μl含10%血清的培養(yǎng)基，分別取各組Eca-109細胞，調整密度為1×105個/ml，接種100μl于上室，置于培養(yǎng)箱中48 h后取出侵襲小室，PBS沖洗培養(yǎng)基，將小室內層未穿膜的細胞用濕潤的棉球擦除。以預冷的4%多聚甲醛固定處理后，采用0.1%結晶紫溶液染色并進行顯微鏡觀察。

1.2.8 Western blot檢測侵襲相關蛋白VEGF、EMT標志蛋白E-cad，N-cad表達采用VEGF、E-cad、N-cad相關抗體進行實驗，具體操作同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，選擇單因素方差分析比較各組間的顯著性差異，數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-383-5p與ZEB2的靶向關 系驗證Tar?getscan程序在線預測發(fā)現(xiàn)ZEB2基因3'UTR區(qū)含有miR-383-5p的潛在互補結合位點（圖1A）。雙熒光素酶報告基因實驗表明，經(jīng)miR-383-5p mimics處理后，轉染野生型ZEB2 3'UTR質粒的細胞相對熒光強度低于轉染突變型質粒的細胞（P<0.05，圖1D）。與空白組相比，NC組差異無統(tǒng)計學意義；與NC組相比，miR-383-5p組miR-383-5p表達明顯增多（P<0.05，圖1B），而ZEB2 mRNA表達明顯減少（P<0.05，圖1C）。

圖1 miR-383-5p與ZEB2的靶向關系驗證Fig.1 Verification of targeting relationship between miR-383-5p and ZEB2

2.2 ZEB2過表達與Control組相比，pcDNA組ZEB2 mRNA水平和蛋白表達無明顯差異，pcDNAZEB2組ZEB2 mRNA水平和蛋白表達均明顯升高（P<0.05，圖2），提示ZEB2過表達成功。

圖2 ZEB2過表達對Eca-109細胞ZEB2 mRNA水平和蛋白表達的影響Fig.2 Effects of ZEB2 overexpression on ZEB2 mRNA level and protein expressions in Eca-109 cells

2.3 miR-383-5p通過下調ZEB2抑制Eca-109細胞增殖與空白組相比，單獨轉染miR-383-5p組ZEB2表達明顯減少（P<0.05），單獨轉染ZEB2組ZEB2表達明顯增多（P<0.05）；與ZEB2組相比，miR-383-5p/ZEB2聯(lián)合轉染組ZEB2表達明顯降低（P<0.05）。此外，與ZEB2組相比，miR-383-5p/ZEB2聯(lián)合轉染組Eca-109細胞增殖率明顯降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 miR-383-5p對Eca-109細胞增殖的影響Fig.3 Effect of miR-383-5p on proliferation of Eca-109 cells

2.4 miR-383-5p通過下 調ZEB2抑制Eca-109細胞侵襲 與空白組相比，單獨轉染miR-383-5p組侵襲細胞數(shù)明顯減少（P<0.05）；單獨轉染ZEB2組侵襲細胞數(shù)明顯增多（P<0.05）；與單獨轉染ZEB2組相比，miR-383-5p/ZEB2聯(lián)合轉染組侵襲細胞數(shù)明顯減少（P<0.05）；Western blot結果表明VEGF的表達趨勢與Transwell檢測結果吻合。見圖4。

圖4 miR-383-5p對Eca-109細胞侵襲的影響Fig.4 Effect of miR-383-5p on invasion of Eca-109 cells

2.5 miR-383-5p通過下調ZEB2抑制Eca-109細胞EMT與空白組相比，單獨轉染miR-383-5p組E-cad表達明顯減少、N-cad表達明顯增多（P<0.05）；單獨轉染ZEB2組E-cad表達明顯增多、N-cad表達明顯減少（P<0.05）；與單獨轉染ZEB2組相比，miR-383-5p/ZEB2聯(lián)合轉染組E-cad表達明顯減少、N-cad表達明顯增多（P<0.05）。見圖5。

圖5 miR-383-5p對Eca-109細胞EMT的影響Fig.5 Effect of miR-383-5p on Eca-109 cell EMT

3 結論

miRNA與腫瘤的形成密切相關，當正常組織發(fā)生癌變時，miRNA的表達有明顯變化。此外，miRNA在腫瘤的增殖、凋亡、轉移、侵襲、浸潤等方面發(fā)揮促進或抑制作用，又在腫瘤的診斷和治療等方面具有重要意義［5］。其中，miR-383-5p在腫瘤的早期診斷、靶向治療、預后檢測等方面發(fā)揮重要作用。ZHANG等［9］研究顯示，miR-383-5p可作為乳腺癌的預后標志物和腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲的抑制劑；XU等［10］的報道指出，靶向HDAC9表達可調控胃癌進展；ZHAO等［11］研究表明，蛋白磷酸酶2A癌抑制劑可作為肺腺癌的預后標志物抑制細胞增殖；JIANG等［12］研究指出，通過靶向TRIM27可抑制卵巢癌細胞的增殖并增強化療敏感性。本研究通過靶向實驗證實ZEB2的3'UTR區(qū)存在與miR-383-5p靶向結合的堿基互補區(qū)，初步確定miR-383-5p可靶向作用 于ZEB2的3'UTR區(qū)，miR-383-5p可在 轉 錄后水平負性調控ZEB2表達；探討miR-383-5p下調ZEB2對EC細胞炎癥因子水平、增殖、侵襲及EMT的影響。

EMT是調控腫瘤細胞侵襲和轉移的機制之一，上皮標志物E-cad的減少和間質標志物波形蛋白、N-Cad等的增加使細胞緊密連接、極性丟失、間充質細胞形態(tài)轉變，導致腫瘤細胞黏附作用減弱，但運動能力增強，從而獲得更強的遷移和侵襲能力［13-14］。如miR-205通過下調HOXD9抑制人膠質瘤EMT，減輕細胞運動能力，抑制腫瘤生長［15］。此外，VEGF是調節(jié)腫瘤侵襲的重要調控因素。miR-718可通過下調VEGF表達抑制卵巢癌細胞侵襲［16］。本研究顯示，聯(lián)合轉染組EMT相關蛋白E-cad表達減少、N-cad表達增多，且侵襲細胞數(shù)及VEGF表達均明顯減少，與上述研究一致，提示miR-383-5p通過下調ZEB2抑制Eca-109細胞的侵襲及EMT。

綜上，miR-383-5p能夠靶向下調ZEB2，進而抑制Eca-109細胞增殖、侵襲及EMT，緩解EC的發(fā)生發(fā)展，具有靶向治療EC的潛力及深入研究的意義。