羅楨弋 曾啟山 羅旭娟 甘華田

炎癥性腸病(IBD)是一種病因未明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其發(fā)病機制尚未闡明，治療上缺乏特異有效藥物[1-2]。大量研究結果已證實腸道神經系統(tǒng)與腸道免疫系統(tǒng)形成的腸道神經免疫網絡在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用。神經膠質細胞(EGCs)作為腸道神經系統(tǒng)的重要組成部分，近期研究發(fā)現，除具有營養(yǎng)支持神經元的作用外，還廣泛參與IBD的發(fā)生發(fā)展過程[3]；T淋巴細胞(簡稱T細胞)是腸道免疫系統(tǒng)中最重要的效應細胞之一，其在IBD發(fā)病機制中的重要免疫作用也已得到公認[4]。其中Foxp3+調節(jié)性T淋巴細胞(Foxp3+Treg)為主要的免疫抑制細胞，Foxp3+為其特異性標志物[5]。因此，研究EGCs與T細胞之間的關系對于揭示IBD的發(fā)病本質意義重大。本研究將探討腸EGCs分泌的膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)對T細胞的影響及其在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結腸炎中的作用。

材料與方法

1.材料：SPF級C57BL/6雄性小鼠購自成都達碩生物科技有限公司，CD4磁珠購自Miltenyi Biotec公司，EGCs及人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)均購自iCell bioscience公司，Transwell小室購自Corning公司，GDNF購自PeproTech公司，anti-GDNF、GFR-α1、RET、DAPI抗體均購自Abcam公司，anti-GAPDH、CD4抗體、Foxp3抗體均購自BD Pharmingen公司，DSS購自JK Scientific公司，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、488熒光素、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-10 ELISA kit均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2.方法：

(1)小鼠脾臟原代T細胞提取：取4只6～8周齡C57BL/6雄性小鼠，全麻后取小鼠脾臟制成單細胞懸液，按照磁珠分選說明書進行CD4+T細胞分選，用流式分析儀檢測CD4+T細胞純度，用于后續(xù)細胞實驗。

(2)蛋白印跡法(Western Blot)及細胞免疫熒光檢測：以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，1∶5 000)作為內參，HUVECs為陽性對照，二抗稀釋倍數為1∶10 000。提取(1)中小鼠脾臟原代T細胞蛋白，檢測GFR-α1、RET的表達水平。取T細胞進行488熒光免疫染色標記，觀察RET表達情況。

(3)細胞實驗：將(1)中提取的小鼠脾臟原代T細胞及EGCs采用隨機數字表法分為T細胞1組、T+EGCs組及T+EGC+anti-GDNF組。取5×105個T細胞，種于Transwell上室，下室種5×105個EGCs，參照說明書在下室加入20 μg/ml的anti-GDNF抗體。培養(yǎng)72 h后，取各組中T細胞，孵育CD4流式抗體及Foxp3+Treg特異性抗體Foxp3，采用流式分析儀分析Foxp3+Treg比例；收集各組細胞的上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測各組細胞上清液中的IL-10水平。然后采用100 ng/ml的GDNF蛋白直接干預T細胞，劑量參考預實驗結果及既往文獻[6]，再將其隨機分為T細胞2組和T+GDNF組，檢測Foxp3+Treg比例及IL-10水平。

(4)動物實驗：將18只C57BL/6雄性小鼠采用隨機數字表法分為對照組、DSS組、DSS+GDNF組，每組各6只。對照組連續(xù)7日飲用實驗室提供的無菌飲用水，同時DSS組與DSS+GDNF組連續(xù)7日飲用2.5%DSS，之后DSS+GDNF組再連續(xù)7日腹腔注射GDNF 5 μg/kg[6]。從造模第1日開始記錄3組小鼠體重、大便性狀、 便血情況進行疾病活動指數(DAI)評分，取小鼠結腸組織進行HE染色，在電鏡下觀察腸道炎癥反應(包括腸道組織上皮壞死、脫落，腺體變形，黏膜水腫等情況)[6]。采用流式分析儀檢測小鼠腸系膜淋巴結中Foxp3+Treg比例，采用ELISA檢測小鼠結腸組織中IL-10、TNF-α水平。

結 果

1.小鼠脾臟原代T細胞磁珠分選結果：經磁珠分選純化后，小鼠脾臟原代CD4+T淋巴細胞純度>95%，滿足后續(xù)實驗要求。

2.小鼠脾臟原代T細胞GDNF受體(GFR-α1/RET)表達情況：Western Blot結果提示小鼠脾臟原代T細胞存在GDNF受體(GFR-α1/RET)表達。見圖1。免疫熒光染色結果顯示RET受體在T細胞胞膜與胞漿中均有表達。見圖2。

圖1 Western Blot驗證T細胞表達GDNF受體 圖2 免疫熒光染色結果顯示T細胞胞膜及胞漿均有RET受體表達(A:RET受體；B:細胞核DAPI；C:Merge，為兩者重合；×20)

3.3組T細胞中Foxp3+Treg比例及IL-10水平比較：T+EGCs組中Foxp3+Treg比例及IL-10水平均顯著高于T細胞1組和T+EGCs+anti-GDNF組(P<0.05)。見表1。

表1 3組T細胞中Foxp3+Treg比例及IL-10水平比較

4.T細胞2組與T+GDNF組Foxp3+Treg比例及IL-10水平比較：T+GDNF組中Foxp3+Treg比例及IL-10水平均明顯高于T細胞2組[(16.28±3.58)%比(4.13±3.29)%，(129.12±23.65)pg/ml比(80.93±20.39)pg/ml，P<0.05)。

5.3組小鼠結腸組織HE染色結果：對照組小鼠的結腸上皮完整，腺體排列整齊，未見炎性細胞浸潤；DSS組小鼠的結腸上皮壞死、脫落，腺體變形，黏膜下層明顯水腫，黏膜層及黏膜下層可見炎性細胞浸潤；DSS+GDNF組小鼠結腸上皮壞死、脫落好轉，黏膜下層炎性細胞浸潤減少。見圖3。

圖3 3組小鼠結腸組織HE染色結果(A：對照組；B：DSS組；C：DSS+GDNF組；×20)

6.3組小鼠DAI、組織學評分、IL-10、TNF-α水平及Foxp3+Treg比例比較：DSS組小鼠DAI、組織學評分及TNF-α水平均高于對照組，IL-10水平低于對照組(P<0.05)。DSS+GDNF組小鼠DAI、組織學評分及TNF-α水平均低于DSS組，IL-10水平及Foxp3+Treg比例均高于DSS組(P<0.05)。DSS+GDNF組小鼠IL-10、TNF-α水平及Foxp3+Treg比例均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠DAI及組織學評分、IL-10及TNF-α水平、Foxp3+Treg比例比較

討 論

目前，大量探討T細胞在IBD發(fā)生發(fā)展中作用的研究大多是孤立地研究T細胞的作用，而忽略腸道神經系統(tǒng)對T細胞的影響。本研究將腸道神經系統(tǒng)中重要成員EGCs與T細胞聯(lián)系起來，探討EGCs對T細胞的影響及其在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用,結果發(fā)現，EGCs及其分泌的GDNF可誘導T細胞向Foxp3+Treg分化并增加IL-10分泌，緩解DSS導致的結腸炎炎癥。眾所周知，Foxp3+Treg是由CD4+T細胞分化而來的具有免疫抑制功能的淋巴細胞，分為自然調節(jié)性T細胞(nTreg)和誘導性調節(jié)性T細胞(iTreg)。Foxp3是目前公認的Foxp3+Treg的特異性標志，后者主要通過分泌免疫抑制性細胞因子[如轉化生長因子(TGF)-β和IL-10]以介導免疫調節(jié)和免疫耐受[7]。Foxp3+Treg的免疫抑制功能在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用也受到了廣泛關注，Zhou等[8]發(fā)現使用腸雙歧桿菌可誘導Foxp3+Treg的產生，從而減輕IBD小鼠模型的腸上皮損傷。這些研究結果均表明，Foxp3+Treg具有負性免疫調節(jié)作用，可上調Foxp3+Treg數量和比例從而起到抑制免疫反應、減輕炎癥的作用。本研究結果發(fā)現，GDNF可誘導T細胞分化為Foxp3+Treg，提高Foxp3+Treg比例，增加IL-10分泌，進而緩解DSS誘導的結腸炎小鼠的腸道炎癥，推測這一抗炎作用的產生與Foxp3+Treg使IL-10水平升高有關。IL-10可抑制黏附分子及促炎癥因子的釋放，抑制巨噬細胞的免疫功能，在人體的免疫介導中發(fā)揮重要作用。Schreiber等[9]研究發(fā)現，給予克羅恩病患者8 μg/kg IL-10，可明顯緩解其腸道炎癥，還能緩解IBD患者腸道炎癥并改善其預后。

GDNF主要作用于T細胞，但前提條件是T細胞上存在GDNF受體。本研究發(fā)現T細胞存在GDNF受體(GFR-α1/RET)。GDNF受體是由GFR-α1和RET兩個受體亞基構成的復合物，其中GFR-α1為膜受體，在細胞膜上表達，RET為跨膜受體，在細胞膜與細胞漿中均有表達[10]。

本研究的另一個重要發(fā)現是EGCs對T細胞的影響通過其分泌的神經營養(yǎng)因子GDNF來實現。GDNF是EGCs分泌的重要的神經營養(yǎng)因子，近年來研究發(fā)現，GDNF除具有營養(yǎng)腸神經元的作用外，還參與調節(jié)腸道免疫反應[11]。鑒于小鼠脾臟原代T細胞，提純后細胞純度及活性均高于腸道淋巴細胞，更符合細胞實驗要求，故本研究采用脾臟T細胞進行細胞實驗，采用腸道淋巴T細胞進行動物實驗。同時本研究發(fā)現EGCs與T細胞共同培養(yǎng)時，EGCs可誘導T細胞向Foxp3+Treg分化，顯著提高其在T細胞中的比例。當用anti-GDNF阻斷GDNF的作用后，EGCs促進T細胞向Foxp3+Treg分化的作用明顯減弱，提示GDNF可能是EGCs誘導T細胞向Foxp3+Treg分化的關鍵因子。GDNF在EGCs促進T細胞向Foxp3+Treg分化中起到重要作用，證實GDNF是EGCs誘導T細胞分化為Foxp3+Treg的關鍵中間神經遞質。

本研究還發(fā)現GDNF可抑制小鼠腸道TNF-α分泌。TNF-α是一種主要由巨噬細胞及單核細胞所分泌的促炎性細胞因子，通過促進血小板活化因子釋放生成氧自由基、誘導合成一氧化氮(NO)造成腸黏膜屏障的損傷、誘導腸黏膜小血管形成微血栓、破壞腸道微循環(huán)等加重腸道損傷和炎癥，目前以TNF-α為靶點治療IBD的藥物(如類克)已進入臨床并取得良好療效[12]。本研究結果也發(fā)現，使用GDNF后，小鼠腸道TNF-α表達明顯降低，DSS小鼠結腸炎癥明顯緩解，我們認為這可能與GDNF誘導產生Foxp3+Treg，進而分泌大量IL-10，又進一步通過抑制相關mRNA的表達從而抑制巨噬細胞分泌TNF-α有關。

GDNF作為EGCs分泌的重要神經營養(yǎng)因子，可通過誘導T細胞向Foxp3+Treg分化來間接調節(jié)腸道免疫反應以減輕腸道炎癥。GDNF可能是腸道EGCs與T細胞交叉對話的中介因子，有臨床開發(fā)的價值。