韓忠耀，陳 菊，張林甦，周福軍

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 558000；2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 110122；3.天津藥物研究院，天津 300301）

水冬瓜葉來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia AngulataOliv.var.intermedia（Harms）Hu的干燥葉，藥用部位根皮收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003版）［1］及湖北中草藥志［2］。有齒鞘柄木植物體根皮或葉中主要含有熊果酸、金絲桃苷、異槲皮苷、β-谷甾醇、3β-甲氧基-豆甾-7-烯、谷甾烷、β-胡蘿卜苷、硬脂酸、軟脂酸、syringo ylglycerol、2H-1-benzopyr-an-2-one、3，5-二甲氧基苯甲醛、10-griselinosidic acid、丁香樹脂酚、豆甾醇、紫丁香苷［3-7］等化學(xué)成分。

課題組前期建立了水冬瓜根皮HPLC指紋圖譜［8-9］、不同采收期大接骨丹樹皮HPLC指紋圖譜［10］、根皮部位總黃酮與浸出物NIR快速檢測方法［11］、根皮部位提取工藝優(yōu)化［12］、水冬瓜葉生藥學(xué)研究及近紅外快速真?zhèn)舞b別與含量測定方法［13-14］、抗炎鎮(zhèn)痛譜效關(guān)系研究［15］等。相關(guān)文獻(xiàn)記載山茱萸科植物有齒鞘柄木的藥用部位為根、根皮、樹皮及葉［16］，相關(guān)研究表明，水冬瓜葉也具有深入開發(fā)、利用的價(jià)值，可作為根皮藥用部位替代或補(bǔ)充藥用植物資源［17］。當(dāng)前，水冬瓜葉既未被歷版《中國藥典》收載，也未被地方標(biāo)準(zhǔn)收載，該藥材在少數(shù)民族聚集地或民族醫(yī)療機(jī)構(gòu)被廣泛應(yīng)用，為貴州少數(shù)民族用藥，基于此，對民族藥水冬瓜葉開展質(zhì)量控制研究并建立系統(tǒng)化質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)意義重大，且具有必要性。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，金絲桃苷具有抗急性肝損傷、抗抑郁、抗炎癥、抗血栓、抗癌、抗菌、抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡等藥理作用［18］，鑒于此，本文擬以金絲桃苷作為民族藥水冬瓜葉藥材質(zhì)量控制指標(biāo)性化學(xué)成分。

本試驗(yàn)擬以黔產(chǎn)水冬瓜葉藥材為研究對象，對10批次水冬瓜葉藥材進(jìn)行TLC定性鑒別，水分、總灰分、浸出物的含有量，并建立HPLC法測定金絲桃苷的含量，為民族藥水冬瓜葉藥材質(zhì)量控制及臨床用藥提供參考與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；PX125DZH型電子天平（成都川弘科生物技術(shù)有限公司）；SX-4-10型箱式電阻爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；101-3AB型烘箱（天津市泰斯特有限公司）；三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；雙列六孔水浴鍋（常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；KQ3200型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；WK-1000A型高速粉碎機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司）。

1.2 試藥 金絲桃苷對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號111521-201809，純度為94.9%）；硅膠GF254薄層板（青島鼎康硅膠有限公司）；甲醇（分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸［分析純，購自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司］；水為娃哈哈純凈水（浙江娃哈哈集團(tuán)有限公司），其他試劑均為分析純。

1.3 藥材10批水冬瓜葉藥材均為課題組從貴州遵義、黔南、銅仁等主要分布地自采的野生品，所有自采藥材均由韓忠耀副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia AngulataOliv.var.intermedia（Harms）Hu的葉，見表1。

表1 藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 稱取10批次水冬瓜葉藥材（編號見表1）粉末每份1 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 ml，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）處理20 min，過濾，濾液置蒸發(fā)皿中，水浴鍋控溫70℃蒸干，殘?jiān)尤爰状? ml溶解，作為供試品溶液；精密稱取金絲桃苷對照品，加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷約為1 mg的溶液，作為對照品溶液。參照2015版《中國藥典》（四部）0502薄層色譜測定法［19］，分別吸取供試品溶液、對照品溶液各10μl，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（33∶4∶2）為展開劑，置于展開缸中展開，取出、晾干，噴10%硫酸乙醇，晾干，三用紫外光燈254 nm下檢視，在供試品、金絲桃苷對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，見圖1。

圖1 10批水冬瓜葉藥材TLC色譜圖

2.2 水分測定 取10批次水冬瓜葉藥材（編號S1～S10）粉末適量，精密稱定，參照2015版《中國藥典》（四部）通則0832水分測定法第二法（烘干法）［19］進(jìn)行水分檢查，各批次藥材平行3份，取平均值，結(jié)果見表2。10批次水冬瓜葉藥材水分含量為6.34%～8.89%，均值為7.94%。參照文獻(xiàn)［20］，將10批次水冬瓜葉藥材水分含量均值上浮30%作為限度標(biāo)準(zhǔn)，初步擬定水冬瓜葉藥材水分含有量不得超過10.3%。

2.3 總灰分測定 取10批次水冬瓜葉藥材（編號S1～S10）粉末適量，精密稱定，參照2015版《中國藥典》（四部）通則2302總灰分測定法［19］，進(jìn)行總灰分檢查，各批次平行3份，取平均值，結(jié)果見表2。10批次水冬瓜葉藥材總灰分含量為7.95%～11.62%，均值為9.06%。根據(jù)檢測結(jié)果，初步擬定水冬瓜葉藥材總灰分含有量不得超過12.0%。

2.4 浸出物測定 取10批次水冬瓜葉藥材（編號S1～S10）粉末適量，精密稱定，參照2015版《中國藥典》（四部）2201浸出物測定法（冷浸法）［19］，進(jìn)行浸出物測定，溶劑為水，各批次平行3份，取平均值，結(jié)果見表2。10批次水冬瓜葉藥材浸出物含量為29.48%～39.76%，均值為35.75%。根據(jù)檢測結(jié)果，以浸出物不少于平均值的70%為最低限度要求計(jì)算，初步擬定水冬瓜葉藥材浸出物含有量不得少于25.0%。

表2 10批水冬瓜葉藥材水分、浸出物及灰分測定結(jié)果（n=3）

2.5 金絲桃苷含量測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)Agela Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為0.2%磷酸（A）-乙腈（C）；柱溫35℃；體積流量為1.0 ml/min；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量20μl；梯度洗脫條件：0～10 min，13%→19% C；10～20 min，19%→45% C；20～22 min，45%→70% C；22～25 min，70% C；25～25.1 min，70%→13% C；25.1～30 min，13% C，洗脫時(shí)間30 min，色譜圖見圖2。在此條件下，金絲桃苷理論塔板數(shù)大于8 000，與相鄰成分色譜峰的分離度均大于1.5，且70%甲醇空白對照無干擾。

圖2 對照品（A）供試品（B）空白對照（C）高效液相色譜圖

2.5.2 溶液的制備

2.5.2.1 對照品貯備溶液的制備 取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入適量70%甲醇溶解后，再加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.164 8 mg/ml的對照品貯備溶液。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 分別稱取S1～S10藥材粉末（過50目藥典篩）約1 g，精密稱定，記錄稱樣量，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 ml，稱定重量，水浴回流提取60 min，放冷，再稱定重量，70%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾液用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 線性關(guān)系考查 分別精密吸取“2.5.2.1”項(xiàng)下金絲桃苷貯備液0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得1～5號對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液（1～5號）及“2.5.2.1”項(xiàng)下金絲桃苷對照品貯備液（6號）各20μl，注入液相色譜儀，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）作線性回歸，得到金絲桃苷線性回歸方程為Y=34 544X+182.67（r=0.999 2），線性范圍為0.008 24～0.164 80 mg/ml。

2.5.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.5.3”項(xiàng)下4號線性金絲桃苷對照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得金絲桃苷色譜峰面積RSD為2.61%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1供試品藥材粉末1份，約1.0 g，精密稱定，按“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、6、10、12和18 h，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測得金絲桃苷峰面積的RSD為0.66%，說明樣品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1供試品藥材粉末共6份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測得金絲桃苷含量RSD為1.44%，表明該方法重復(fù)性符合要求。

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的樣品（編號S1）粉末約0.5 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入金絲桃苷對照品溶液3 ml（按“2.5.2.1”項(xiàng)下方法，另配制金絲桃苷質(zhì)量濃度為0.302 4 mg/ml的對照品溶液），再分別加入70%甲醇97 ml，按照“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，然后按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中金絲桃苷的含量，并計(jì)算其加樣回收率。結(jié)果，金絲桃苷的平均加樣回收率為100.53%，RSD為2.67%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度高。金絲桃苷的加樣回收率測定結(jié)果見表3。

表3 金絲桃苷的加樣回收率測定結(jié)果（n=6）

2.5.8 含量測定 分別稱取S1～S10藥材粉末，每份約1 g，按“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算金絲桃苷含量，結(jié)果見表4。由表可知，除S6和S9樣品中金絲桃苷含量較低外（金絲桃苷含量分別為0.49和0.46 mg/g），其余批次藥材金絲桃苷含量均高于1.18 mg/g。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)指標(biāo)性成分含量判定標(biāo)準(zhǔn)［21-23］，初步擬定金絲桃苷含量不低于0.46 mg/g，以干燥品計(jì)為0.51 mg/g，即按干燥品計(jì)算金絲桃苷含量不得低于0.051%。

表4 金絲桃苷測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 薄層色譜條件考查TLC研究過程中，考查了不同展開系統(tǒng)［乙酸乙酯-甲酸-水（30∶3∶2）、乙酸乙酯-甲酸-水（25∶2∶2）、乙酸乙酯-甲酸-水（33∶2∶2）、乙酸乙酯-甲酸-水（33∶4∶2）、乙酸乙酯-丙酮-甲酸（28∶3∶2）、正丁醇-丙酮-甲酸（28∶3∶2）］等條件下TLC結(jié)果，同時(shí)，也考查了各展開系統(tǒng)條件下硅膠H、硅膠G等不同硅膠薄層板對金絲桃苷TLC鑒別的影響，綜合考慮，最終確定在硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（33∶4∶2）為展開劑，作為金絲桃苷TLC鑒別條件。結(jié)果在上述條件下，TLC圖成點(diǎn)性好、分離度高、斑點(diǎn)清晰可辨且熒光斑點(diǎn)清晰，表明本研究確定的TLC法耐用、可靠，可有效用于水冬瓜葉藥材的定性鑒別。

3.2 供試品提取溶劑與提取方法的篩選 預(yù)試驗(yàn)考查了甲醇、70%甲醇、70%乙醇等溶劑，及超聲提取、水浴回流提取等提取方法對水冬瓜葉中金絲桃苷含量的影響，發(fā)現(xiàn)70%甲醇水浴回流提取條件下，金絲桃苷含量相對較高，且峰形較好，分離度高，因此，確定70%甲醇水浴回流提取作為水冬瓜葉藥材供試品的提取溶劑與提取方法。

3.3 HPLC分離條件篩選 預(yù)試驗(yàn)對HPLC分離條件進(jìn)行了系統(tǒng)考查，篩選了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸溶液、甲醇-0.2%醋酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.2%醋酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等流動相比例，最終發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸溶液分離效果最佳。采用Agilent 1260型高效液相色譜儀DAD檢測器多波長篩選金絲桃苷檢測波長，并參照《中國藥典》中收載的有關(guān)金絲桃苷檢測波長，發(fā)現(xiàn)360 nm下金絲桃苷（均大于1.50），峰高最高，且峰面積最大，表明金絲桃苷在此波長下吸收均較大，可用于金絲桃苷含量測定。

3.4 HPLC法耐用性考查 試驗(yàn)考查了Agela Promosil C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）等色譜柱，柱溫（33和37℃），流速（0.9和1.1 ml/min），發(fā)現(xiàn)金絲桃苷峰形較好，可與相鄰峰達(dá)到基線分離，且金絲桃苷含量測定結(jié)果無明顯差異。

3.5 浸出物測定條件篩選 依據(jù)藥材所含成分的理化性質(zhì)，考查了不同提取溶劑（水、10%乙醇～無水乙醇、乙醚）在不同浸出方法下對浸出物的影響，最終確定用水作為溶劑，采用“冷浸法”進(jìn)行浸出物測定。

綜上所述，本試驗(yàn)對民族藥水冬瓜葉TLC鑒別、水分含有量、總灰分含有量、浸出物含有量、金絲桃苷HPLC含量測定方法，進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并初步擬定藥材限量要求，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于民族藥水冬瓜葉藥材的質(zhì)量控制。