陳勇

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科甲乳三病區(qū)，蚌埠 233004）

甲狀腺癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤[1]，甲狀腺乳頭狀癌（Papillary Thyroid Carcinoma，PTC）是其中最為常見的一種亞型，占比高達(dá)4/5[2]。經(jīng)過臨床治療，多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌患者可以取得較好的療效，但仍有十分之一的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3]。越來越多的研究表明，BRAF基因 在多個(gè)癌癥中均存在廣泛的突變[4-5]。不同的BRAF突變具有不同的臨床和治療意義，尤其是V600E和非V600E突變之間的區(qū)別[6]。近年來隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，BRAF及TERT啟動(dòng)子突變?cè)诩谞钕侔┌l(fā)病過程中的作用越來越受到重視。本研究通過對(duì)PTC腫瘤細(xì)胞進(jìn)行BRAFV600E以及TERT的檢測，探討了突變體在PTC中的作用功能。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2018年8月至2021年8月在我院就診的甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者68例，平均年齡（40.62±11.92）歲，其中男性13人，女性55人，多灶腫瘤4例，單發(fā)64例。侵犯包膜33例，未侵犯包膜35例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期36例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移pN1期32例。根據(jù)BRAFV600E啟動(dòng)子突變情況分為突變組及無突變組，無突變組有23例，平均年齡（40.05±12.81）歲。突變組45例，平均年齡（40.12±13.18）。

納入的研究對(duì)象：確診為甲狀腺乳頭狀癌患者，無其他惡性腫瘤，無精神疾病，術(shù)后病理切片確診為甲狀腺乳頭狀癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：病史病例不完全者；既往有嚴(yán)重心肝腎等重要臟器功能障礙者；既往有服用甲狀腺素藥史者。

所有患者對(duì)研究內(nèi)容知情，且均簽署知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 將PTC腫瘤樣本進(jìn)行DNA的提取。采用試劑盒進(jìn)行DNA的提取，所有操作嚴(yán)格按照操作指南，提取完畢后進(jìn)行濃度測定，放置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變的情況。登錄NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫，查找到BRAF和TERT基因的序列，由上海生物公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成，設(shè)計(jì)BRAF基因上游引物序列5'-CATCTCACCTCATCCTAACACA-3'，下游引物序列5'-GCCTCAATTCTTACCATCCACAA-3'。設(shè)置PCR反應(yīng)體系（基因組DNA：1 μL；前引物：2 μL；后引物：2 μL；2X Taq PCR MasterMix：25 μL；ddH2O：20 μL），反應(yīng)條件（①94℃，3 min；②94℃，30 sec；③55℃，30 sec④72℃，1 min；⑤72℃，5 min；②-④*30）。

同理，設(shè)計(jì)TERT基因上游引物序列5'-GGGCTCCCAGTGGATTC-3'，下游引物序列5'-CC AC TACCGCGAGGTG-3'，設(shè)置PCR反應(yīng)體系（基因組DNA：1 μL；前引物：2 μL；后引物：2 μL；dNTP mix：1 μL；GC-RICH resolution solution:10 μL；GCRICH Reaction buffer:10 μL；GC-RICH System enzyme mix:1 μL；ddH2O：23 μL），PCR擴(kuò) 增 結(jié) 束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過比對(duì)條帶大小確定是否為目標(biāo)產(chǎn)物。確認(rèn)無誤后送至金唯智生物公司進(jìn)行測序檢測，比對(duì)測序結(jié)果以及正常序列，探討是否存在突變。

1.3 觀察指標(biāo) 分析比較BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子與甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)聯(lián)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，年齡、腫瘤大小等計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAFV600E啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系BRAFV600E啟動(dòng)子突變率為66.18%，突變組與無突變組在年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 BRAFV600E啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系

2.2 TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系TERT啟動(dòng)子突變率為11.76%，突變組與無突變組在年齡及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在腫瘤大小上具有差異性，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05），見表2。

表2 TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系

2.3 BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系BRAFV600E啟動(dòng)子聯(lián)合TERT突變的發(fā)生率為7.35%，突變組與無突變組在年齡及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間并無明顯差異性（P＞0.05），在腫瘤大小上具有差異性，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05），見表3。

表3 BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子突變與年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間的關(guān)系

2.4 BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征的關(guān)系 對(duì)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征之間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BRAFV600E是否突變與中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移之間具有差異性，其突變狀態(tài)與腫瘤組織有無中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移存在差異（P＜0.05）；TERT的突變狀態(tài)與腫瘤組織有無腺外浸潤存在差異（P＜0.05）；BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子的聯(lián)合突變狀態(tài)與腺外浸潤、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無之間存在差異（P＜0.05）。見表4。

表4 BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征的關(guān)系

3 討論

根據(jù)2021年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌在全球造成586000例病例，在2020年的發(fā)病率中排名第9，女性的全球發(fā)病率為每100000人中10.1人，是男性的3倍[7-8]。相比于高的發(fā)病率,這種疾病的死亡率要低得多，女性為每10萬人0.5人，男性為0.3人每10萬人，估計(jì)有44000人死亡。發(fā)病率的上升主要是由于分化型甲狀腺癌(Differentiated Thyroid Cancers，DTC)和乳頭狀甲狀腺癌(PTC)的診斷增加[9]。在過去的30年中，濾泡性(FTC)、間變性(ATC)和髓樣(MTC)甲狀腺癌的發(fā)病率一直保持相對(duì)穩(wěn)定。但是隨著醫(yī)學(xué)檢測手段的發(fā)展，廣泛的使用成像技術(shù)、活檢程序[例如，細(xì)針穿刺(FNA)]、醫(yī)學(xué)監(jiān)測以及居民醫(yī)療保健的改善等，促進(jìn)了臨床PTC的檢出率[10-11]。由此產(chǎn)生的過度診斷總是伴隨著過度治療，根據(jù)美國預(yù)防服務(wù)工作組的說法，對(duì)無癥狀成人進(jìn)行TC篩查相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)可能超過其潛在益處[12]。

DTC（包括低分化形式）的診斷工作包括術(shù)前和術(shù)后病理和分子評(píng)估?！? cm的結(jié)節(jié)不需要進(jìn)行術(shù)前FNA細(xì)胞學(xué)檢查,應(yīng)根據(jù)病變大小和超聲外觀來決定是否抽吸較大的結(jié)節(jié)[13]。細(xì)胞學(xué)結(jié)果被分為與不同惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的診斷類別。大多數(shù)惡性甲狀腺腫瘤可以通過細(xì)胞學(xué)識(shí)別。值得注意的例外是FTC和新定義的“具有乳頭狀核特征的非侵入性甲狀腺濾泡腫瘤”(NIFTP)，它們通常在各種甲狀腺細(xì)胞學(xué)報(bào)告方案中被歸類為不確定的[14-15]。除非有絲分裂活動(dòng)明顯增加和/或壞死，否則基于FNA對(duì)低分化癌的診斷也具有挑戰(zhàn)性[16]。通過評(píng)估惡性腫瘤標(biāo)志物（包括通常在腫瘤中過度表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如HBME1或galectin-3）和與惡性腫瘤特別相關(guān)的分子改變（例如BRAF突變、RET融合、其他新基因改變），可以促進(jìn)FNA診斷[17]。另外有研究表明，血漿glactin-3、sIL-2R水平聯(lián)合檢測對(duì)于診斷甲狀腺癌較單獨(dú)應(yīng)用具有更高的臨床價(jià)值,并且與甲狀腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是一種上皮惡性腫瘤，它是最常見的甲狀腺腫瘤，PTC的一個(gè)關(guān)鍵特征是它能夠侵入鄰近的結(jié)構(gòu)，如淋巴管[19]。BRAF突變是PTC中最常見的遺傳改變，約占PTC的29%~69%[20]。高 細(xì) 胞 變 異 （PTC的 侵 襲 性 變 異）中BRAFV600E突變的高頻率表明BRAFV600E突變可能與PTC侵襲性表型相關(guān)，研究表明，BRAFV600E通過誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性促進(jìn)了PTC的發(fā)生發(fā)展[21]。TERT是端粒酶的催化亞基，其啟動(dòng)子區(qū)最常見的兩個(gè)突變分別是C228T和C250T，這兩個(gè)突變能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生[22]。最近，有研究顯示TERT啟動(dòng)子的突變和BRAF突變之間存在一定的相關(guān)性[23]。自TERT突變首次報(bào)道以來，它與BRAF突變被廣泛認(rèn)為與甲狀腺乳頭狀癌的致病機(jī)理有關(guān)[24]。

在本研究中，BRAFV600E啟動(dòng)子突變率為66.18%，突變組與無突變組在年齡、腫瘤大小及送檢淋巴結(jié)數(shù)目之間并無明顯差異（P＞0.05）。TERT啟動(dòng)子突變率為11.76%，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05）。BRAFV600E啟動(dòng)子聯(lián)合TERT突變的發(fā)生率為7.35%，突變組的腫瘤明顯大于無突變組（P＜0.05）。對(duì)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變與臨床特征之間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BRAFV600E是否突變與中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移之間具有差異性，其突變狀態(tài)與腫瘤組織有無中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移存在差異 （P＜0.05）；TERT的突變狀態(tài)與腫瘤組織有無腺外浸潤存在差異（P＜0.05）；BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子的聯(lián)合突變狀態(tài)與腺外浸潤、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無之間存在差異（P＜0.05）。

綜上，在PTC患者中，BRAFV600E的突變率較高，與患者臨床特征關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，TERT的突變率較低，與患者腫瘤大小相關(guān)，對(duì)PTC患者預(yù)后評(píng)估具有指導(dǎo)意義，同時(shí)出現(xiàn)BRAFV600E及TERT啟動(dòng)子突變的發(fā)生率較低，且與患者的腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤存在相關(guān)性，對(duì)PTC風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有重要價(jià)值。BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子的突變情況的檢測為臨床甲狀腺乳頭狀癌的診治提供了一定的參考價(jià)值，但是其仍有一定的局限性。