吳國(guó)明，張 盈，王 楠

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 311201；2.蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院 婦科，浙江 杭州 311201)

臨床常見(jiàn)因各種外傷所致的肌腱損傷[1-2]，肌腱損傷在自我修復(fù)過(guò)程中可能會(huì)造成粘連。嚴(yán)重肌腱損傷一般需要手術(shù)治療，而手術(shù)治療可能繼發(fā)的粘連性更大，并會(huì)嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能。因此，如何防止肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中的粘連是臨床上迫切需要解決的科學(xué)問(wèn)題。成纖維細(xì)胞的增殖是肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中形成粘連的重要因素[3]。可抑制成纖維細(xì)胞增殖的藥物主要有5-氟尿嘧啶(5-Fu)、6-磷酸果糖等[3]，但局部給藥后，上述藥物很快就會(huì)泄露至機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)，造成局部的藥物有效濃度過(guò)度降低。因此，為維持肌腱局部治療的有效藥物濃度水平，需要頻繁給藥，不僅提高了藥物的毒副作用，而且增加肝腎負(fù)擔(dān)，從而降低了患者的依從性。為此，我們制備了5-Fu的緩釋劑型(即負(fù)載5-Fu的PLGA微球)，觀察其對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肌腱成纖維細(xì)胞的抑制作用，從而為確證5-Fu的新型緩釋劑是否能有效調(diào)節(jié)和預(yù)防術(shù)后肌腱的粘連提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50，上海)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-501，山東)，勻漿機(jī)(S10，上海)。

1.2 主要藥品與試劑 5-氟尿嘧啶(5-FU)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)(貨號(hào)：P133293，阿拉丁公司)；明膠(貨號(hào)：G108398，阿拉丁公司)及二氯甲烷(貨號(hào)：G1238N，西隴化工股份有限公司)。

1.3 細(xì)胞、生化試劑及抗體 大鼠成纖維細(xì)胞系(RAT-1)由本院實(shí)驗(yàn)室保存。完全培養(yǎng)基：DMEM 90%；胎牛血清10%(Thermo Fisher Scientific，貨號(hào):11965092)。培養(yǎng)條件：37 ℃，5%二氧化碳。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher公司。PVDF膜購(gòu)自Millipore公司(Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)：88518)。CCK-8試劑盒(用于細(xì)胞增殖分析)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所(Dojindo，貨號(hào)：39580)。ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(貨號(hào)：S00335)。AKT(Abcam,貨號(hào)：6532)、p-AKT(貨號(hào)：3420)、Bax(貨號(hào)：2898)、Bcl-2(貨號(hào)：3689)、GAPDH(貨號(hào)：8924)抗體，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology(Danvers，Mass)。EdU試劑盒購(gòu)自銳博生物科技有限公司。ANNEXINV-FITC/PI購(gòu)自北京索萊寶公司(貨號(hào)：589214)。

1.4 PLGA微球制備 配制明膠溶液備用。采用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法，將200 mg PLGA溶解在2 mL二氯甲烷溶液中，將20 mg 5-氟尿嘧啶加入上述溶液中做為油相，充分溶解后加入到10 mL的2%明膠溶液中，用手持式勻漿機(jī)在10 000 r/min高速攪拌60 s，形成初乳溶液；迅速將初乳溶液倒入100 mL的0.5%PVA中，冰浴下10 000 r/min攪拌10 s，形成復(fù)乳溶液;將復(fù)乳溶液倒入500 mL的0.5%明膠溶液中，室溫下磁力攪拌2 h,減壓蒸餾6 h去除其中殘余的有機(jī)溶劑，10 000 r/min離心10 min，去離子水洗3次，將沉淀冷凍干燥可得到PLGA微球載5-氟尿嘧啶粉末，4 ℃保存。

1.5 Western-blot分析 5-Fu-PLGA微球處理RAT-1成纖維細(xì)胞后，采用Western-blot檢測(cè)胞內(nèi)信號(hào)分子(AKT、mTOR)、增殖相關(guān)基因蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Survivin)、凋亡相關(guān)基因蛋白(Bax、Bim)的表達(dá)水平，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用伯樂(lè)ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)觀察熒光條帶。

1.6 DCFH-DA熒光檢測(cè)成纖維細(xì)胞活性氧含量 將成纖維細(xì)胞(RAT-1)密度調(diào)整為2×105/mL，然后，將細(xì)胞接種于6孔板中，再將5-Fu-PLGA微球加入培養(yǎng)液中，并繼續(xù)培48 h洗滌細(xì)胞后加入DCFH-DA(實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書(shū)操作指南)。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵2 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 CCK-8檢測(cè)RAT-1細(xì)胞增殖能力 將RAT-1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后將細(xì)胞以4×105每孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)處理組至少設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后,分別加入5-氟尿嘧啶的PLGA微球，并培養(yǎng)至不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)后,將CCK-8檢測(cè)溶液加入并在37 ℃條件下繼續(xù)孵育3.5 h，使用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測(cè)每孔的吸光度。

1.8 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 使用5-Fu-PLGA微球刺激纖維細(xì)胞(RAT-1)，洗滌2次后，使用ANNEXINV-FITC/PI檢測(cè)試劑盒檢測(cè)成纖維細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格參照索萊寶的試劑盒進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 5-Fu-PLGA微球制備成功 按照上述的技術(shù)方法，成功制備5-Fu-PLGA微球，見(jiàn)封三圖1。掃描電鏡觀察可見(jiàn)微球呈正圓形，粒徑約為20 μm左右，形態(tài)規(guī)整。

2.2 5-Fu-PLGA微球?qū)Τ衫w維細(xì)胞增殖的影響 分別使用1、5、10、20 mg的PLGA微球處理成纖維細(xì)胞24～72 h后，經(jīng)CCK-8檢測(cè)，結(jié)果顯示：不 同濃度的5-氟尿嘧啶的PLGA微球能夠以劑量依賴(lài)性的方式抑制成纖維細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖1。

圖1 5-Fu-PLGA微球抑制成纖維細(xì)胞的增殖

2.3 5-Fu-PLGA微球?qū)ο嚓P(guān)蛋白的影響 Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，5-Fu-PLGA微球處理成纖維細(xì)胞后，AKT、Juk、mTOR及Bcl-2、Bcl-xL、Survivin的表達(dá)水平低于對(duì)照組，Bax、Bim的表達(dá)水平高于對(duì)照組(PLGA微球)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但在磷酸化的ERK1/2和p38MAPK表達(dá)中未觀察到明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 5-Fu-PLGA微球誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激 單純處理PLGA微球的成纖維細(xì)胞(對(duì)照組)內(nèi) ROS含量，高于5-Fu-PLGA微球處理的成纖維細(xì)胞內(nèi) ROS含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)封三圖2。

2.5 EdU檢測(cè)5-Fu-PLGA微球?qū)Τ衫w維細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞增殖EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，5-Fu-PLGA微球組熒光細(xì)胞陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.6 5-氟尿嘧啶的PLGA微球成纖維細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析5-Fu-PLGA微球?qū)Τ衫w維細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，PLGA 5-Fu-PLGA微球引起細(xì)胞凋亡的比例顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)封三圖3。

3 討論

肌腱損傷在自我修復(fù)過(guò)程中可能會(huì)造成粘連，嚴(yán)重者可能會(huì)影響關(guān)節(jié)功能。因此，如何預(yù)防肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中的粘連是一個(gè)亟待解決的臨床問(wèn)題[1]。以往研究表明,引起肌腱形成粘連的因素主要包括：1) 來(lái)源于周?chē)M織的成纖維細(xì)胞向肌腱斷開(kāi)方向增殖生長(zhǎng)，這是引起粘連最核心的因素之一；2) 炎癥也是造成肌腱粘連的因素之一；3) 受傷后，肌腱細(xì)胞的自我增殖修復(fù)可能會(huì)與周?chē)M織的成纖維細(xì)胞密切相關(guān)，進(jìn)而可能引發(fā)粘連。因此，在肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中抑制成纖維細(xì)胞的增殖，是解決肌腱粘連的方法之一。5-氟尿嘧啶雖能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖，但由于其藥物本身的特性，給藥后的5-氟尿嘧啶會(huì)發(fā)生泄露至循環(huán)系統(tǒng)的現(xiàn)象，引起藥物濃度迅速降低。PLGA是一種高分子聚合物材料，由于PLGA擁有良好的生物可降解性能，因此PLGA已被廣泛用作緩控釋系統(tǒng)的骨架材料，并已經(jīng)有以PLGA為載體的藥品上市[3-4]。 本研究中，我們使用PLGA作5-氟尿嘧啶載體材料，研制了5-Fu-PLGA微球緩釋劑。通過(guò)這種緩釋、控釋的給藥方式，可以在較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋藥，維持藥物的有效治療濃度，避免局部高藥物濃度引起的刺激作用。

本研究中，我們首先使用成纖維細(xì)胞模型在體外評(píng)估5-Fu-PLGA微球緩釋劑的潛在生物活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5-氟尿嘧啶的PLGA微球緩釋劑能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖，抑制AKT和mTOR信號(hào)通路的活化；可以抑制抗凋亡基因Bcl-2，Bcl-xL和Survivin的表達(dá)，并增加了凋亡基因Bax及Bim的表達(dá)；但對(duì)ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路的激活沒(méi)有顯著的影響；進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)5-Fu-PLGA微球可以顯著提高ROS的水平，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)屬于抗代謝類(lèi)的藥物，能干擾DNA的合成進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖，臨床上主要用于治療腫瘤。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)5-Fu可明顯降低肌腱周?chē)M織中成纖維細(xì)胞的含量。他們將5-Fu應(yīng)用于兔肌腱局部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-Fu可顯著降低受損肌腱細(xì)胞的增殖，并能有效提高肌腱術(shù)后的功能恢復(fù)[5-6]。研究表明,不同濃度的5-Fu溶液作用于雞的肌腱斷端，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低術(shù)后肌腱粘連的程度。但由于5-Fu在體內(nèi)的半衰期非常短，只有10～20 min，這在很大程度上限制了5-Fu在治療中的具體應(yīng)用[5]。PLGA具有出色的生物相容性和可生物降解性，微球緩釋給藥可延長(zhǎng)5-Fu的半衰期。席寧等[7]制備了姜黃素的PLGA納米微球，并發(fā)現(xiàn)其具有良好的緩釋特性。此外，劉梓昕等[8]全面地綜述了PLGA微球的抗腫瘤作用。為了提高5-Fu的應(yīng)用潛力，我們?cè)诳偨Y(jié)一系列前人研究的基礎(chǔ)上，使用PLGA作為5-氟尿嘧啶載體材料，研制了負(fù)載5-Fu的PLGA微球緩釋劑，并通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其生物活性。因此，負(fù)載5-Fu的PLGA微球作為緩釋劑型用于防治肌腱粘連具有廣闊的前景[9-10]。

綜上，5-氟尿嘧啶的PLGA微球緩釋劑具有良好的生物學(xué)性能，能夠顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，這為其進(jìn)一步在體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)的臨床試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。