張瑞強(qiáng)，馬國(guó)虎，繁萍，駱寅梅，趙永智，冶蕊，巨雪燕，董芊里

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

青海地區(qū)放牧家畜的消化道寄生線蟲(chóng)主要以?shī)W斯特線蟲(chóng)、細(xì)頸線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、夏伯特線蟲(chóng)和毛首線蟲(chóng)等為主，引起家畜慢性消耗性疾病[1-3]，降低飼料的有效利用率[4]。傳統(tǒng)的家畜線蟲(chóng)檢測(cè)方法分為形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)方法等[5]，這些方法的不足之處是檢測(cè)目標(biāo)單一，工作量大和對(duì)動(dòng)物損傷度高?，F(xiàn)代獸醫(yī)診斷學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)是微創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)精準(zhǔn)檢測(cè)，而且基于動(dòng)物群體龐大的實(shí)際狀況能通過(guò)群體的檢測(cè)來(lái)降低工作量。糞便是許多寄生蟲(chóng)生活史或一過(guò)性停留的載體，是開(kāi)展多種寄生蟲(chóng)病原高通量檢測(cè)的較理想樣本。2018年底，Cannon等[6]用改進(jìn)的擴(kuò)增子技術(shù)分析了人源和環(huán)境源樣本中的單細(xì)胞和寄生生物，測(cè)序平臺(tái)通過(guò)使用優(yōu)化的聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)，在DNA聚合酶的催化下，DNA分子錨和熒光標(biāo)記核苷酸進(jìn)行聚合，在激光的作用下熒光信號(hào)被激發(fā)，隨后高分辨率成像系統(tǒng)對(duì)光信號(hào)進(jìn)行采集，光信號(hào)經(jīng)過(guò)數(shù)字化處理后，獲得當(dāng)前待測(cè)堿基的信息，從而完成測(cè)序，該技術(shù)為開(kāi)展寄生蟲(chóng)群體檢測(cè)研究提供了思路。

本研究選用參考文獻(xiàn)[6,7]中的兩對(duì)線蟲(chóng)引物，以青海省內(nèi)不同地區(qū)的牦牛和藏羊糞便樣本為研究對(duì)象，初步探索了基于聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)的高通量測(cè)序檢測(cè)方法在寄生線蟲(chóng)上的檢測(cè)效果，對(duì)家畜糞便中線蟲(chóng)種系進(jìn)行了分析鑒定。

1 材料

1.1 糞便樣本

2021年8月在青海省海晏、貴南、澤庫(kù)和河南四縣，共采集了155份牦牛和藏羊糞便樣本，低溫運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室保存。各縣不分動(dòng)物種隨機(jī)取樣2份，每份樣本約10 g，共8份混勻成1份，然后分裝后分成3份，干冰保存寄送上海美吉生物公司。

1.2 試劑

磁珠法糞便DNA提取試劑盒、糞便DNA樣本保存管、M5 Marker i DNA Marker與2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix (with blue dye) 購(gòu)買(mǎi)于北京聚合美生物科技有限公司。GeneGreen核酸染料與瓊脂糖購(gòu)買(mǎi)于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物

用于鉤蟲(chóng)基因PCR的引物如下：5'-CTTTGTCGGGAAGGTTGG-3'與5'-TTCACCACTCTAAGCGTCT-3'[7]；線蟲(chóng)錨定高通量測(cè)序引物A序列如下：5'-CACCCGTGAGGATTGACAG-3'與5'- CGATCACG'GAGGATTTTCA-3'[6]；線蟲(chóng)錨定高通量測(cè)序引物B序列如下：5'-CGTCATTGCTGCGGTTAAAA-3'與5'-CCGTCCTTCGAACCTCTGAC-3'[6]；4對(duì)引物委托賽默飛旗下Invitrogen公司合成。

2 方法

2.1 基因組提取

選取糞便樣本約220 mg，按照磁珠法糞便DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.2 測(cè)序

錨定高通量測(cè)序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥有限公司完成，測(cè)序工作包括樣本DNA質(zhì)檢、樣本DNA建庫(kù)和上機(jī)測(cè)序、初始序列優(yōu)化及注釋等。

2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系：樣本基因組DNA 1.0 μL，正反向引物(10 nM)各1.0 μL，2×Taq PCR MasterMix Ⅱ 10.0 μL，補(bǔ)ddH2O至20.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 Sec，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 sec，循環(huán)35次；再72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。100 bp～750 bp的DNA Maker和樣品各使用5.0 μL，電泳電壓不超過(guò)80 V，電泳結(jié)果拍照片，并用photoshop 6.0加標(biāo)注。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)出填寫(xiě)到表格中，運(yùn)用 Microsoft Office Excel軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 錨定高通量測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)兩對(duì)線蟲(chóng)特異性引物做錨定高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，青海四縣區(qū)糞便樣本DNA的擴(kuò)增結(jié)果如圖1和圖2，各樣本均有不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增條帶。經(jīng)高通量測(cè)序后注釋的生物分類(lèi)如表1，其中已確認(rèn)的動(dòng)植物線蟲(chóng)檢出率為37.34%，屬于家畜已知的寄生線蟲(chóng)為鉤口屬和血矛屬。

圖1 錨定高通量測(cè)序引物擴(kuò)增結(jié)果

圖2 四縣區(qū)內(nèi)樣本中生物屬水平群落豐度

錨定高通量引物是基于18 S rDNA設(shè)計(jì)，基本覆蓋大多數(shù)已知線蟲(chóng)[6]，兩對(duì)引物的測(cè)序結(jié)果共156條有效OTU，確認(rèn)屬的線蟲(chóng)OTU數(shù)為36。有8個(gè)已知細(xì)菌屬，其余均為未知生物序列。

表1 錨定高通量測(cè)序結(jié)果

3.2 PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果

鉤口屬引物為文獻(xiàn)報(bào)道[7]的特異性引物，可以區(qū)分多種不同動(dòng)物源鉤蟲(chóng)種。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3，目的片段大小如文獻(xiàn)敘述，介于404bp-408bp間。

圖3 鉤口屬片段擴(kuò)增結(jié)果1-7、9、11、12和16判定為陽(yáng)性結(jié)果，M為Marker

3.3 四縣區(qū)樣本擴(kuò)增陽(yáng)性率

海晏縣2份牦牛樣本、6份藏羊樣本呈陽(yáng)性；貴南縣沒(méi)有陽(yáng)性樣本；澤庫(kù)縣1份牦牛樣本、2份藏羊樣本呈陽(yáng)性；河南縣4份牦牛樣本呈陽(yáng)性。圖3是四縣區(qū)部分糞便樣本中鉤口屬線蟲(chóng)的PCR擴(kuò)增結(jié)果，陽(yáng)性樣本擴(kuò)增目標(biāo)條帶與預(yù)期片段大小相似。

各縣區(qū)全部牦牛和藏羊樣本中鉤口屬線蟲(chóng)總的陽(yáng)性率為9.68%，其中河南縣牦牛和藏羊全部糞便的陽(yáng)性率為6.90%，澤庫(kù)縣牦牛和藏羊全部糞便的陽(yáng)性率為8.82%，貴南的為0，海晏縣最高，為25%，顯著高于其他地區(qū)(p<0.01)。從動(dòng)物陽(yáng)性率看，鉤口屬線蟲(chóng)在牦牛中的陽(yáng)性率(8.33%)低于在藏羊中的陽(yáng)性率(11.27%)(p<0.05)。

表2 各縣區(qū)樣本陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)表

4 討論

本研究基于消化系統(tǒng)內(nèi)寄生蟲(chóng)種類(lèi)多的常識(shí)，以高通量測(cè)序技術(shù)為依托，初步探索限定于小范圍的寄生蟲(chóng)種群或單細(xì)胞種群的引物檢測(cè)效果[6]，進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)。因引物特別錨定于小范圍寄生蟲(chóng)群及一些單細(xì)胞生物群，與常規(guī)擴(kuò)增子針對(duì)特定序列片段有明顯的區(qū)別，所以稱(chēng)為錨定高通量測(cè)序。本研究首選了針對(duì)線蟲(chóng)的引物，對(duì)青海省內(nèi)四縣采集的動(dòng)物糞便樣本做錨定高通量測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果中的156個(gè)有效操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units，OTU)，確認(rèn)屬的線蟲(chóng)OTU數(shù)為36個(gè)，集中于鉤口屬和血矛屬。還有8個(gè)已知細(xì)菌屬，應(yīng)該屬于錯(cuò)誤擴(kuò)增測(cè)序，其余OTU均為未知生物序列。因此有效的檢出率為37.34%，這個(gè)效率從數(shù)字上來(lái)看并不高，因?yàn)橛?12個(gè)OTU為未知生物，即可檢索物種數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有相關(guān)生物記錄。

再?gòu)木€蟲(chóng)角度來(lái)看，我們選用的引物擴(kuò)增范圍是線蟲(chóng)，沒(méi)有動(dòng)物源和植物源的區(qū)分；加上本研究所用糞便樣本為放牧的草食家畜，糞便中出現(xiàn)植物線蟲(chóng)不可避免，所以檢出線蟲(chóng)的效率不能僅限于動(dòng)物源線蟲(chóng)，因此從已知線蟲(chóng)的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)來(lái)說(shuō) 這種錨定高通量測(cè)序在寄生蟲(chóng)檢測(cè)中有很好的優(yōu)勢(shì)。

本研究中，可確認(rèn)屬的動(dòng)物源線蟲(chóng)主要是鉤口屬和血矛屬，這兩種線蟲(chóng)均屬于人獸共患病原[8]。已知牛羊可作為鉤蟲(chóng)的轉(zhuǎn)續(xù)宿主[9]，人生食了這類(lèi)含有蟲(chóng)卵的牛羊肉食品，極易感染。為了進(jìn)一步驗(yàn)證動(dòng)物線蟲(chóng)的檢出準(zhǔn)確性，選用已有文獻(xiàn)中驗(yàn)證的鉤蟲(chóng)屬引物[7]，對(duì)樣本中鉤蟲(chóng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，155份樣本中有9.38%擴(kuò)增陽(yáng)性，總體陽(yáng)性率不高；其中牦牛樣本陽(yáng)性率為8.33%，而藏羊樣本的陽(yáng)性率為11.27%，高于牦牛樣本。從縣區(qū)來(lái)看，海晏縣樣本陽(yáng)性率(25%)高于其他縣的樣本陽(yáng)性率，而貴南縣陽(yáng)性率為零。已知這些縣區(qū)都在不同時(shí)間建立了有機(jī)牧場(chǎng)，發(fā)展有機(jī)畜牧業(yè)，從時(shí)間上來(lái)看，貴南縣、河南縣和澤庫(kù)縣建立時(shí)間較長(zhǎng)，有機(jī)牧場(chǎng)的建立與線蟲(chóng)的陽(yáng)性率可能存在一定關(guān)聯(lián)，還需要深入研究。總之，本研究結(jié)果一方面初步驗(yàn)證了錨定高通量測(cè)序在限定范圍內(nèi)寄生蟲(chóng)檢測(cè)中有較好的鑒定分析效果，另一方面也提示本研究樣本采集地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)鉤口屬和血矛屬線蟲(chóng)的預(yù)防，從而阻斷相關(guān)寄生蟲(chóng)病的發(fā)生和傳播。