劉金杰 賀 偉 彭心如 劉若萱 史 萌

河北北方學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，張家口，075000，中國(guó)

《難經(jīng)·十四難》認(rèn)為“損其心者，調(diào)其營(yíng)衛(wèi)”。后世宗《難經(jīng)》之旨確立了“調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、健脾益氣”的缺血性心臟病治則，組方芍藥甘草湯。芍藥甘草湯源自張仲景《傷寒論》，由芍藥和甘草兩味藥材組成，具有益營(yíng)合血、調(diào)和肝脾、柔筋止痛的功效。依“謹(jǐn)守病機(jī)，異病同治”原則，該方臨床應(yīng)用廣泛，對(duì)多種疾病療效較好?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥甘草湯具有抗氧化、抗炎、止痛、抗心律失常、抗心肌缺血之功效［1-3］，但目前其在抗心肌缺血的作用機(jī)制研究并未明確。心肌缺血時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量自由基，造成心肌細(xì)胞氧化損傷，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，但目前尚不清楚芍藥甘草湯提取物（SYG）對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是否與其抗氧化及抗炎作用有關(guān)。本研究擬采用過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷，從細(xì)胞及分子水平探究SYG 對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，為進(jìn)一步完善芍藥甘草湯的藥理作用及指導(dǎo)臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

新生1～2 d 的Wistar 大鼠心肌細(xì)胞。

1.1.2 藥品與試劑

芍藥、炙甘草中藥飲片，購(gòu)于河北北方學(xué)院附屬校醫(yī)院；過(guò)氧化氫（H2O2），購(gòu)自美國(guó)Hyclone；DMEM-H 液體培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Hyclone；新生胎牛血清，購(gòu)自美國(guó)Gibco；0.25%胰蛋白酶溶液，購(gòu)自美國(guó)Difco；四甲基偶氮唑鹽（MTT），購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Sigma；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）引物，合成于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器

RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6050 型真空干燥箱，寧波江南儀器廠；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo；倒置熒光顯微鏡，Olympus；RT-PCR 測(cè)定儀，Therm7500；Nanodrop2000c 超微量分光光度計(jì)，Thermo。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芍藥甘草湯提取物的制備

稱取芍藥、炙甘草飲片各50 g，按照料液比為1∶7的比例采用70%乙醇進(jìn)行提取，每次提取1 h，共提取3 次，收集3 次的提取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮為浸膏，并最終得到干粉20.3 g，提取率為20.3%。

1.2.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

取新生1～2 d 的Wistar 大鼠心室肌組織，剪碎，用含0.25%胰蛋白酶的Hank’s 液分別消化5、15、20 min，之后將三次細(xì)胞懸液混合在一起。預(yù)培養(yǎng)90 min 后，以3×105個(gè)·mL-1置入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37℃、5% CO2和95% 空氣的二氧化碳孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM（含15%胎牛血清）［4］，本實(shí)驗(yàn)所有檢測(cè)在心肌細(xì)胞培養(yǎng)4 d 細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)后進(jìn)行。

1.2.3 H2O2致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立

參照文獻(xiàn)［5］選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠心肌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶Hank’s 液消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)·mL-1，按照每孔100 μL的密度接種于96 孔板，采用終濃度為200 μmol·L-1H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞2 h，作為模型對(duì)照組。

1.2.4 分組與給藥

將長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)良好的細(xì)胞分成5 組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、SYG 高、中、低劑量組。正常組為正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞；模型組為心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度為200 μmol·L-1H2O2誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞2 h；SYG 高、中、低劑量組分別為采用150、100、50 μg·mL-1的SYG培養(yǎng)24 h 后，添加終濃度為200 μmol·L-1H2O2處理2 h。

1.2.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

選取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞接種于96 孔板（5×105個(gè)·mL-1），每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，室溫避光振蕩孵育5 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定吸光度（absorbance，A）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

各組細(xì)胞存活率按照如下公式計(jì)算：

細(xì)胞存活率（%）=（A 處理組-A 空白組）/（A 對(duì)照組-A 空白組）×100%，此方法用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。

1.2.6 紫外分光光度法檢測(cè)心肌細(xì)胞SOD、MDA、CAT、LDH 的含量

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別測(cè)定各組心肌細(xì)胞上清液中SOD、MDA、CAT、LDH相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的含量。

1.2.7 RT-PCR 法檢測(cè)心肌細(xì)胞中COX-2、iNOS、TNF-α、NF-κB 的含量

根據(jù)NCBI 公布的大鼠基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物，如Tab.1 所示。

Tab.1 Gene name and sequence

培養(yǎng)24 h 后棄去細(xì)胞上清液，將細(xì)胞裂解，收集各組心肌細(xì)胞，采用Trizol 法提取心肌細(xì)胞中的總RNA，用Nanodrop2000c 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 次循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以mean±SD 表示，多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用t檢驗(yàn)法，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，終濃度為200 μmol·L-1的H2O2處理后心肌細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01，F(xiàn)ig.1）。

Fig.1 Effects of SYG and H2O2 on cardiomyocyte proliferation

2.2 心肌細(xì)胞上清液中SOD、MDA、CAT 和LDH 測(cè)定結(jié)果

SOD、MDA、CAT 和LDH 含量能夠反應(yīng)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組能夠顯著降低心肌細(xì)胞上清液中SOD 和CAT 的含量（P＜0.01），SYG 各劑量組能夠不同程度改善上述狀況，且與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。與正常對(duì)照組相比，H2O2模 型組能夠顯著性升高心肌細(xì)胞上清液中MDA 及LDH 的含量（P＜0.001），SYG 各劑量組干預(yù)后能夠顯著性降低心肌細(xì)胞上清液中MDA、LDH 的含量，且與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，F(xiàn)ig.2）。

Fig.2 Effect of SYG on the contents of LDH，SOD，MDA and CAT in the supernatant of H2O2-induced cardiomyocytes

2.3 心肌細(xì)胞中TNF-α、COX-2、iNOS、NF-κB 含量測(cè)定結(jié)果

TNF-α、COX-2、iNOS、NF-κB 是重要的炎癥因子與炎癥介質(zhì)，其含量的高低與炎癥程度成正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于正常組，模型組心肌細(xì)胞組織中TNF-α、NF-κB、COX-2 和iNOS 炎癥因子mRNA 含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），SYG 高、中、低劑量組能使COX-2 和iNOS mRNA 表達(dá)量降低（P＜0.05，P＜0.01），SYG 高、中劑量組能使TNF-α mRNA 表達(dá)量降低（P＜0.05），SYG 中、低劑量組能使NF-κB mRNA 表達(dá)量降低（P＜0.05，F(xiàn)ig.3）。

Fig.3 Effects of SYG on the expression of inflammatory factors TNF-α，COX-2，iNOS and NF-κB in H2O2-induced cardiomyocytes

3 討論

大量研究證實(shí)心肌缺血時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量自由基，造成心肌細(xì)胞氧化損傷，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［6］。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的氧化劑與抗氧劑之間存在著動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體的正常生理功能，一旦心肌細(xì)胞受損會(huì)使機(jī)體內(nèi)氧化劑與抗氧劑之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，使得心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，誘發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)生一系列的炎癥反應(yīng)，影響機(jī)體的各項(xiàng)功能［7］。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，H2O2作為一種重要的活性氧，在體內(nèi)氧化代謝起著非常重要的作用，其可以誘發(fā)機(jī)體內(nèi)的核酸、蛋白等發(fā)生不同形式的氧化反應(yīng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)或細(xì)胞死亡［8］。本研究以H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞模擬心肌缺血后引發(fā)的系列氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，用以評(píng)價(jià)SYG 對(duì)心肌缺血的影響。

氧化應(yīng)激反應(yīng)與心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)，是缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［9］。氧化應(yīng)激包括氧化產(chǎn)物生成的增加和抗氧化酶活性的降低。SOD 作為機(jī)體內(nèi)的一種抗氧化酶，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)［10］。MDA 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中穩(wěn)定的代謝終產(chǎn)物之一，其含量的高低能夠反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，從而反應(yīng)體內(nèi)ROS 的水平。CAT 作為H2O2分解的催化酶能夠使得H2O2快速轉(zhuǎn)化為其他無(wú)害或較小毒性物質(zhì)，減輕其對(duì)機(jī)體的危害［11］；LDH 在機(jī)體內(nèi)的各個(gè)細(xì)胞中都有存在，是催化乳酸進(jìn)行氧化反應(yīng)的催化酶，其漏出量的增加，往往標(biāo)志著心肌細(xì)胞受到了不可逆的損傷［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)SYG 干預(yù)后，各劑量組能夠不同程度的增加H2O2誘導(dǎo)所致的SOD、CAT 的降低，能夠降低H2O2誘導(dǎo)所致的MDA、LDH 的增加，在一定程度上顯示出較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激的作用。

TNF-α作為一種促炎因子其可以激活經(jīng)典的NF-κB 信號(hào)通路。NF-κB 信號(hào)通路在免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中均起到了重要的作用，其可以被促炎因子、脂多糖、生長(zhǎng)因子等物質(zhì)激活，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核，進(jìn)而誘發(fā)炎癥因子如：iNOS、COX-2 等的表達(dá)［13-15］，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SYG 能夠顯著性降低H2O2誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α、iNOS、COX-2 及NF-κB mRNA 的表達(dá)，顯示出一定的抗炎作用。

綜上所述，SYG 能夠抑制H2O2誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，對(duì)心肌缺血有一定的保護(hù)作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)其抗炎作用機(jī)制可能為抑制TNF-α激活NF-κB 信號(hào)通路，從而抑制iNOS 及COX-2 的表達(dá)，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。課題組在后期的研究中將繼續(xù)深入研究SYG 對(duì)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用機(jī)制，力求全面闡釋SYG 對(duì)心肌缺血保護(hù)作用，為芍藥甘草湯的臨床應(yīng)用提供可借鑒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。