孫 麗 張曉瑩 高廣生，3

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，濟南，250013，中國

2 山東省泰安市中心醫(yī)院住院準(zhǔn)備中心，泰安，271000，中國

3 山東省泰安市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，泰安，271000，中國

腦梗死是由于腦血液供應(yīng)異常導(dǎo)致的嚴(yán)重危及生命的疾病。由于該病具有較高的發(fā)病率和死亡率，是導(dǎo)致人類死亡和致殘的主要原因，但除了超早期溶栓以外，目前仍然沒有有效的方法預(yù)防和治療這種疾病。雖然迅速恢復(fù)血液供應(yīng)可以使神經(jīng)細(xì)胞重新恢復(fù)其生理功能，但是再灌注仍然引起了其他的一系列嚴(yán)重問題，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙和離子失衡等［1］，大大降低了血液恢復(fù)的有利作用，導(dǎo)致了更嚴(yán)重的病理狀態(tài)，且與腦卒中損傷的程度直接相關(guān)。因此，抑制缺血再灌注帶來的一系列不良后果，對于腦梗死的治療仍然是至關(guān)重要的。

S14G-Humanin（HNG）是Humanin（HN）衍生物，HN 抑制β淀粉樣蛋白（amyloid-beta protein，Aβ）誘導(dǎo)的STAT3 低表達，降低caspase-3 的表達，從而抑制Aβ對大鼠的損傷，具有神經(jīng)保護作用［2］。給予HN 預(yù)處理可以降低心律失常發(fā)生率，改善心功能，減少心梗面積，以及改善心肌線粒體功能，減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷［3］。本課題組前期研究［4］已證實HNG 抑制缺血再灌注造成的神經(jīng)損傷，具有神經(jīng)保護作用，其機制可能與激活JAK2-STAT3 通路有關(guān)。在這項研究中，我們采用SHSY5Y 細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）的方法作為體外缺血/再灌注模型，進一步明確HNG 神經(jīng)保護作用的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞與試劑

SH-SY5Y 細(xì)胞，購于美國ATCC 公司（Type Culture Collection（ATCC；Manassas，VA，USA）；［甘氨酸14］-人蛋白G 抗體（S14G-Humanin），購自美國Sigma 公司；FITC Annexin V 凋亡檢測試劑盒，購自美國BD Biosciences 公司；JAK 抑制劑FLLL32（S7259）、PI3K 抑制劑LY294002（S1105）及AKT 抑制劑MK-2206 2HCl（S1078），均購自美國Selleck 公司；SOD 活性檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；CCK-8 細(xì)胞增值及毒性檢測試劑盒，購自上海Beyotime 公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（S0131），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗蛋白酪氨酸激酶JAK2 抗體、兔抗磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3 抗體（S727）、兔抗細(xì)胞色素C 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，均購自美國Abcam 公司；兔抗磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3 抗體（Tyr705），購自美國Cell Signaling Technology 公司；兔抗BCL2-相關(guān)X 蛋白抗體（N-20）、beta-Actin 內(nèi)參抗體，購自美國Santa Cruz 公司；半胱氨酸天冬酶3（Caspase 3），購自武漢Proteintech 公司。

1.1.2 儀器

流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson 公司；Mini-PROTEAN Tetra System，美國Bio-Rad 公司；Mini Trans-Blot Cell，美國Bio-Rad Laboratories 公司；Synergy HT酶標(biāo)儀，美國BioTek Instruments 公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、三氣培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和鏈霉素。細(xì)胞在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法孵育，每兩天換液一次。

1.2.2 氧糖剝奪模型制備及干預(yù)

當(dāng)細(xì)胞爬滿70%～80% 培養(yǎng)皿時，對細(xì)胞進行OGD/R 實驗，并給予HNG 干預(yù)治療。OGD/R 詳細(xì)步驟：將細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，更換為無血清無糖Earles 平衡鹽溶液，其組成為（NaCl 143.0 mmol·L-1，KCl 5.4 mmol·L-1，CaCl21.8 mmol·L-1，MgSO41.0 mmol·L-1，NaH2PO41.0 mmol·L-1，HEPES 2.4 mmol·L-1，pH 7.4），立 即移至三氣培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中持續(xù)充入缺氧混合氣體，維持培養(yǎng)箱內(nèi)0.5%氧濃度，在剝奪葡萄糖和血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h。然后將細(xì)胞保持在常氧條件下（復(fù)氧）正常培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)9 h。FLLL32、LY294002和MK-2206 2HCl 分別是STAT3、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase，AKT）抑制劑。這些抑制劑被添加到細(xì)胞實驗中干預(yù)治療。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測

SH-SY5Y 細(xì)胞活性測定采用CCK-8 細(xì)胞計數(shù)試劑盒，所有操作均按試劑盒說明書進行。用Synergy HT 酶標(biāo)儀在450 nm 測定吸光度。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率分析

用FITC Annexin V 凋亡檢測試劑盒檢測SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率，所有操作均按試劑盒說明書進行。細(xì)胞凋亡的程度應(yīng)用雙激光流式細(xì)胞儀和ModFit LT 軟件分析。

1.2.5 免疫印跡分析（Western Blot）

選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，氧糖剝脫及藥物干預(yù)后提取總蛋白，倒掉培養(yǎng)基，PBS 沖洗，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF 混合液，冰上靜置2～ 10 min，刮板刮取細(xì)胞，4 ℃離心機離心：12 000 r，15 min，取上清至新EP 管，BCA 方法測總蛋白濃度，按照20 μg 蛋白上樣量計算上樣體積。10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。然后用一抗標(biāo)記蛋白JAK2（稀釋濃度1∶1 000）、phospho（p）-STAT3（Y705）（稀釋濃 度1∶1 000）、p-STAT3（S727）（稀釋濃度1∶500），4℃于搖床上孵育過夜。洗膜后，加入5%脫脂奶粉封閉液稀釋（稀釋濃度1∶2 000）的二抗，置于37℃恒溫箱中，脫色搖床上孵育1 h。洗膜后每條膜加入適量的發(fā)光底物試劑，以浸潤膜條為宜，盡快行化學(xué)發(fā)光，圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)值均為重復(fù)三遍實驗數(shù)據(jù)。所有的數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS Statistics Version 26統(tǒng)計學(xué)軟件分析，兩均數(shù)比較采用t檢驗，多均數(shù)比較采用方差分析one-way ANOVA。P＜0.05 表示統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 OGD/R 導(dǎo)致SH-SY5Y 細(xì)胞存活率降低，凋亡率增加

細(xì)胞活性檢測表明OGD/R 導(dǎo)致SH-SY5Y 細(xì)胞存活率顯著降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，F(xiàn)ig.1A）。OGD/R 也導(dǎo)致SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率顯著增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，F(xiàn)ig.1B～D）。

Fig.1 Results of SH-SY5Y cell viability and apoptosis rate following OGD/R treatments

2.2 HNG 神經(jīng)保護和抗凋亡作用

給予不同劑量的HNG（0.1～10 μg·L-1）干預(yù)，可不同程度上抑制OGD/R 引起的細(xì)胞活性降低。給予0.1、1、5、10 μg·L-1HNG 干預(yù)的SH-SY5Y 細(xì)胞與未行HNG 干預(yù)的OGD/R 細(xì)胞相比，細(xì)胞存活率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，F(xiàn)ig.2A），其中1 μg·L-1HNG 干預(yù)組細(xì)胞存活率最高。給予0.1、1、5、10 μg·L-1HNG干預(yù)的細(xì)胞凋亡明顯減少（P＜0.01，F(xiàn)ig.2B～H）。與不應(yīng)用HNG 組相比，1 μg·L-1HNG 使細(xì)胞凋亡率下降最明顯。這些數(shù)據(jù)表明HNG 增加OGD/R 處理神經(jīng)細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞凋亡率，具有神經(jīng)保護和抗凋亡作用。

Fig.2 Results of cell viability and apoptosis rate following OGD/R treatments，while adding doses of HNG（0.01～10 μg·L-1）to the SH-SY5Y cells

2.3 HNG 激活OGD/R 抑制的JAK2/STAT3 信號通路

研究檢測了OGD/R 處理后SH-SY5Y 細(xì)胞JAK2和p-STAT3 蛋白表達水平。如Fig.3 所示，與正常對照組比較，OGD/R 處理后明顯降低了JAK2 蛋白表達（P＜0.01，F(xiàn)ig.3B），降低了p-STAT3（Y705）蛋白表達（P＜0.01，F(xiàn)ig.3C），但未明顯降低p-STAT3（S727）蛋白表達（P＞0.05，F(xiàn)ig.3D）。給予0.1 μg·L-1HNG 干預(yù)的細(xì)胞表達JAK2（P＜0.01，F(xiàn)ig.3B）和p-STAT3（Y705）（P＜0.01，F(xiàn)ig.3B）蛋白增加。給予1 和5 μg·L-1HNG干預(yù)的細(xì)胞JAK2（P＜0.01，F(xiàn)ig.3B）、p-STAT3（Y705）（P＜0.01，F(xiàn)ig.3C）和p-STAT3（S727）（P＜0.01，F(xiàn)ig.3D）蛋白表達增加更顯著。而給予10 μg·L-1的HNG 干預(yù)也提高了細(xì)胞JAK2（P＜0.01，F(xiàn)ig.3B）蛋白表達，但是未能提高p-STAT3（Y705）（P＞0.05，F(xiàn)ig.3C）和p-STAT3（S727）（P＞0.05，F(xiàn)ig.3D）蛋白表達。

Fig.3 Protein expression levels of JAK2，p-STAT3（Y705）and p-STAT3（S727）were detected using Western Blot following the OGD/R treatments，while adding doses of HNG（0.01～10 μg·L-1）to the SH-SY5Y cells

2.4 JAK2/STAT3 信號介導(dǎo)HNG 神經(jīng)保護作用

為確定是否JAK2/STAT3 信號介導(dǎo)了HNG 對OGD/R 處理后細(xì)胞的神經(jīng)保護功能，我們應(yīng)用了該通路的特異性抑制劑（FLLL32），與HNG 一起加入培養(yǎng)液中。細(xì)胞活性檢測表明，1 μg·L-1HNG 增加了因OGD/R 損害的細(xì)胞存活率（P＜0.01，F(xiàn)ig.4A），而 1 μg·L-1HNG 和5 μmol·L-1FLLL 32 聯(lián)合應(yīng)用卻無法增加因OGD/R 損害的細(xì)胞存活率（P＞0.05，F(xiàn)ig.4A）。給予1 μg·L-1HNG 干預(yù)能有效抑制OGD/R 模型處理后導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01，F(xiàn)ig.4B），但是聯(lián)合給予5 μmol·L-1FLLL 32 則抵消了HNG 的應(yīng)用對細(xì)胞凋亡的抑制作用（P＞0.05，F(xiàn)ig.4B）。免疫印跡分析檢測數(shù)據(jù)表明，OGD/R 處理可以減少JAK2、p-STAT3（Y705）、p-STAT3（S727）蛋白表達（P＜0.01，F(xiàn)ig.4D，E，F(xiàn)），但給予1 μg·L-1HNG 干預(yù)可以抑制OGD/R 處理后所誘發(fā)的JAK2、p-STAT3（Y705）、p-STAT3（S727）蛋白表達量的減少（P＜0.01，F(xiàn)ig.4D、E、F）。但這種抑制作用在聯(lián)合給予1 μg·L-1HNG 和5 μmol·L-1FLLL 32干預(yù)細(xì)胞中沒有觀察到。以上這些數(shù)據(jù)表明HNG 通過激活JAK2/STAT3 信號通路有效抑制OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Fig.4 Results of cell viability，apoptosis rate and protein expression following OGD/R treatments，while adding 1 μg·L-1 HNG alone or 1 μg·L-1 HNG and 5 μmol·L-1 FLLL32 in combination to the SH-SY5Y cells

3 討論

腦梗死以其發(fā)病率、致殘率、病死率、復(fù)發(fā)率均高的特點給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)，且近年來有年輕化的趨勢［5］。腦梗死發(fā)生后，缺血缺氧會造成神經(jīng)細(xì)胞壞死、變性，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷，及早恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。目前臨床上用于腦梗死的有效治療方法以溶栓為主，溶栓治療是指靜脈注射組織纖溶酶原激活劑［6］，溶解新鮮血栓，使缺血腦組織恢復(fù)血液灌注，但由于治療時間窗狹窄，恢復(fù)血流灌注后可能帶來再灌注損傷及腦保護治療的滯后，進一步加重腦功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞的損傷［7］，這一病理生理變化就是腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷最基本的病理生理學(xué)特征是神經(jīng)元死亡［8］，同時，腦缺血再灌注損傷直接影響缺血性腦血管病的預(yù)后轉(zhuǎn)歸，如何有效地減輕缺血再灌注所造成的神經(jīng)損傷一直是腦缺血臨床治療的首要問題。目前腦缺血再灌注損傷的機制尚未完全清楚。因此，深入研究腦缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)機制，尋找有效的治療藥物，抑制缺血再灌注損傷造成的神經(jīng)細(xì)胞死亡，對于改善缺血再灌注損傷的預(yù)后具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

凋亡是缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要方式［9］，細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別仍然主要依靠形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞壞死是偏離正常的生理機能，開始于ATP 的耗竭和細(xì)胞膜通透性損傷，然后出現(xiàn)核固縮和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整性的破壞，產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)碎片的釋放伴隨著炎癥反應(yīng)。與之相反，細(xì)胞凋亡是有序的基因表達和蛋白質(zhì)活性的改變，從染色質(zhì)濃縮和核仁解體開始，然后死亡的細(xì)胞被分裂形成所謂的凋亡小體，細(xì)胞碎片被附近的固有細(xì)胞吞噬，通常不產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)。細(xì)胞正常的生長發(fā)育是由于凋亡誘導(dǎo)因素和抑制凋亡因素的神經(jīng)元存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互平衡、共同作用的結(jié)果，若某些因素影響神經(jīng)元存活信號，則觸發(fā)了促凋亡級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞的程序化死亡，甚至發(fā)生細(xì)胞凋亡。SH-SY5Y 細(xì)胞廣泛用來研究與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而揭示神經(jīng)退行性疾病、缺血性腦卒中的發(fā)病機制。

本研究通過建立體外OGD/R 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡模型模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)OGD/R 處理后SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率顯著增加，細(xì)胞活性減少。神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的核心組成部分，是形成神經(jīng)功能的基礎(chǔ)，神經(jīng)元死亡，尤其是海馬和大腦皮質(zhì)部位的神經(jīng)元，是腦梗死高致殘率和高死亡率的主要原因。因此，治療急性腦缺血再灌注損傷的重要策略是抑制神經(jīng)元的死亡。

HN 是2001 年由日本學(xué)者Hashimoto 在阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者大腦枕葉皮層未受損腦區(qū)發(fā)現(xiàn)的［10］。HN 存在于許多組織，包括睪丸、結(jié)腸、下丘腦、心臟、肝臟、骨骼肌、腎臟和血管壁［11］。最初研究顯示HN 及其衍生物能有效抑制多種AD 相關(guān)致病因子（如FAD 基因突變、APP 抗體、Aβ等）誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的死亡，改善AD 小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力，被認(rèn)為是未來用于治療AD 最有希望的藥物［12］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)HN 有著更廣泛的作用，已有大量報道HN 在病理和生理狀態(tài)下都有抗凋亡作用，如缺血引起的各種類型的細(xì)胞死亡［13］，氧化低密度脂蛋白相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡［14］，以及精子發(fā)生中睪丸間質(zhì)細(xì)胞死亡［15］，然而，隨著年齡增長，HN 的生理血漿水平明顯降低，這可能導(dǎo)致HN 在老年性疾病的抗凋亡過程中作用有限，如腦梗死。HNG 是人工合成物，第14 位的Ser 被Gly 取代后形成的HN 衍生物，具有1 000 倍的HN 生物活性，是HN 的重要衍生物［16］，本課題組既往研究證實HNG 對缺血再灌注大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元有保護作用［17］，但目前還不清楚HNG 是否能夠保護OGD/R 后神經(jīng)元死亡。在本研究中，我們首先提供證據(jù)表明HNG 是OGD/R 后細(xì)胞凋亡的有效抑制劑，1 μg·L-1HNG 可使氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率下降60%。這表明HNG 可能通過預(yù)防神經(jīng)元凋亡減輕腦卒中損害，是一種很有臨床應(yīng)用前景的藥物。

JAK2、STAT3 蛋白參與發(fā)育過程，支持和修復(fù)成熟期神經(jīng)細(xì)胞損傷，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達，包括海馬、齒狀回、紅核、小腦及皮層等。在正常成人腦中，JAK2-STAT3 通路通常是不激活的，腦缺血性損傷后具有神經(jīng)保護作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子通過激活JAK2-STAT3 通路誘導(dǎo)保護性基因表達促進神經(jīng)細(xì)胞存活。本研究應(yīng)用JAK2/STAT3 抑制劑證實JAK2/STAT3 通路在HNG 抑制OGD/R 神經(jīng)損傷中起重要作用。本研究觀察到暴露于OGD/R 的神經(jīng)元JAK2 和p-STAT3 表達水平降低，提示JAK2/STAT3 信號通路減弱。而給予HNG 干預(yù)后，HNG 通過提高信號蛋白或磷酸化蛋白的水平激活JAK2/STAT3 信號，從而起到神經(jīng)保護的作用。研究表明，HN 作用于GP130/IL6ST受體復(fù)合物后，AKT 和STAT3 磷酸化水平增加［18］。活化的AKT 和STAT3參與HN 在多種老年疾病中細(xì)胞保護和神經(jīng)保護機制［19］。本研究給予JAK2/STAT3 信號抑制劑FLLL32 則抵消了HNG 對細(xì)胞凋亡的抑制作用，進一步證實HNG 通過激活JAK2/STAT3 信號通路實現(xiàn)其神經(jīng)保護作用。

總之，本研究證實HNG 通過激活JAK2/STAT3 信號通路抑制OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護作用，為HNG 用于腦梗死的治療提供了理論基礎(chǔ)。