郝甜甜，陳艷陽(yáng)，苗佳琪，牛 晨，梁 佳，許永華

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 人參新品種選育與開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，長(zhǎng)春 130118

西洋參(American ginseng，AG)PanaxquinquefoliusL.是五加科人參屬多年生草本植物，其主要活性成分是人參皂苷、皂苷類化合物，它是世界上最常用的中草藥之一[1]。根據(jù)現(xiàn)代研究表明，其在降血脂、改善心肌缺血、預(yù)防癌癥等方面有顯著功效[2,3]，具有極高的醫(yī)學(xué)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。目前，我國(guó)西洋參長(zhǎng)期依靠進(jìn)口且面臨野生資源稀缺，生產(chǎn)成本高、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，特別是西洋參中稀有皂苷的含量極低，難以滿足臨床應(yīng)用需求[4,5]。采用藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，不受時(shí)間、地域和材料生長(zhǎng)時(shí)期的限制，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的西洋參生物量及目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物[6]，值得注意的是，建立起來的西洋參愈傷組織培養(yǎng)系統(tǒng)仍然存在著人參皂苷產(chǎn)量低的問題，影響著西洋參產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[7]。

隨著誘導(dǎo)子的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，關(guān)于誘導(dǎo)子作為一種特定信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞中目的基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物合成已成為熱點(diǎn)[8]，而將誘導(dǎo)子用于植物組織培養(yǎng)中促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累研究也變的尤為重要。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和水楊酸(salicylic acid，SA)作為一種常用的誘導(dǎo)子，對(duì)多種代謝產(chǎn)物合成具有促進(jìn)作用，已成功應(yīng)用于雷公藤、紅花、黃芩、丹參等多種藥用植物次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)中[9-12]。目前利用MeJA和SA處理西洋參愈傷組織提高皂苷含量的報(bào)道很少。因此，本試驗(yàn)以西洋參愈傷組織為材料，研究了MeJA和SA處理后對(duì)西洋參愈傷組織生長(zhǎng)、相關(guān)酶活性及主要化學(xué)成分人參皂苷含量的影響，為西洋參愈傷組織培養(yǎng)及其次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料：供試材料培養(yǎng)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院溫室A04，兩年生西洋參葉片為試驗(yàn)材料。由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)許永華副教授鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliusL.。以1/4 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 1.0 mg/L、2,4-D 2.0 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂6.5 g/L，pH=5.8。培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度(25±2)℃，濕度60%。

實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)驗(yàn)高壓滅菌器(致微儀器有限公司，GI54DWS型)；雙人單面凈化工作臺(tái)(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-2FD型)；智能人工氣候室(南京恒裕儀器設(shè)備制造有限公司，F(xiàn)YS-10型)；高效液相色譜儀(美國(guó)通微公司，Dionex UltiMate 3000型)；MuItiskan GO酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司-中國(guó))；ST16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司-中國(guó))。

實(shí)驗(yàn)試劑：MeJA(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200118，純度≥95.0%)；SA(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為：B20191128，純度≥98.0%)；乙腈和甲醇均為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司-中國(guó))；純凈水(杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司)；SOD試劑盒、CAT試劑盒、POD試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為SOD-1-Y、CAT-1-Y、POD-1-Y)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

西洋參愈傷組織在培養(yǎng)第 15 d加入誘導(dǎo)子，濃度分別設(shè)置為MeJA(50、100、200、300 μmol/L)；SA(50、100、200、300 μmol/L)；以不添加任何誘導(dǎo)子為對(duì)照，每個(gè)濃度3次重復(fù)，10瓶為一重復(fù)，25 ℃暗培養(yǎng)，至35 d收獲。

1.2.2 西洋參愈傷組織中生長(zhǎng)量的測(cè)定

將收獲的人參愈傷組織用濾紙吸干其表面水分，稱其重量記為鮮重(fresh weight，F(xiàn)W)，每6盤一組，重復(fù)3次，然后置于50 ℃ 烘箱中烘干至恒重，稱重記為干重(dry weight，DW)。

1.2.3 抗氧化酶活性的測(cè)定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定采用羥胺法，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測(cè)定采用可見光法，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.4 西洋參愈傷組織中單體皂苷含量的測(cè)定

(1)色譜條件：Waters XBridge?C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～35 min，19% A；35～50 min，19% A→22% A；50～108 min，22%A→45% A；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度：75 ℃，氣體流量：2.5 L/min，增益值：1。

(2)樣品中皂苷的提取方法：稱取愈傷組織100 mg，精密加入1 mL的甲醇，超聲1 h，置于4 ℃ 冰箱過夜，取出，超聲3 h，5 000 r/min 離心5 min，取上清，過0.22 μm濾膜，待高效液相色譜儀檢測(cè)，進(jìn)樣量20 μL。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd適量，加甲醇制成每1 mL分別含上述人參皂苷0.200、0.200、0.194、0.200、0.224、0.210、0.200、0.190、0.204 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、8、16、20 μL，測(cè)定各種人參皂苷的峰面積，色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)與西洋參愈傷組織提取物(B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard (A) and AG callus extract (B)

1.2.5 西洋參愈傷組織中總皂苷含量的測(cè)定

采用香草醛-高氯酸法測(cè)定愈傷組織中總皂苷的含量，參考于2020版《中國(guó)藥典》[13]，修改處為：取愈傷組織100 mg，精密加入1 mL甲醇，超聲60 min，4 ℃冰箱過夜，超聲3 h。5 000 r/min離心5 min，取上清，待測(cè)。其他步驟均同《中國(guó)藥典》。以人參皂苷Re為對(duì)照品，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.002 2X+0.038 7，R2=0.997 5。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過方差分析對(duì)比數(shù)據(jù)差異顯著性；采用OriginPro 2018軟件繪制試驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織生長(zhǎng)的影響

由圖2分析可知，不同濃度誘導(dǎo)子處理對(duì)西洋參愈傷組織FW及DW的影響不同。在西洋參愈傷組織中，(1)與對(duì)照組相比，各濃度MeJA誘導(dǎo)子處理均顯著降低了愈傷組織的FW，但各濃度處理間的愈傷組織FW并無顯著性差異(P>0.05)，說明MeJA能明顯抑制西洋參愈傷組織的生長(zhǎng)；不同濃度的MeJA均會(huì)不同程度抑制西洋參愈傷組織干物質(zhì)的積累，其濃度越高，抑制效果越強(qiáng)。當(dāng)MeJA濃度為300(μmol/L)時(shí)，西洋參愈傷組織DW最低，為0.670 7 g，比對(duì)照組降低了27%(P<0.05)。(2)在供試濃度內(nèi)，SA誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織的生長(zhǎng)表現(xiàn)為一定的抑制作用，且誘導(dǎo)濃度不同，對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)弱有明顯差異；與對(duì)照組相比，各濃度SA均不利于愈傷組織干物質(zhì)的積累。

圖2 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織FW和DW的影響Fig.2 Effects of different concentrations of inducers on FW and DW in callus of AG注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note:Different lowercase letters in graph indicate significant differences (P<0.05),the same below.

2.2 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織抗氧化酶活性及MDA含量的影響

由圖3分析可知，在西洋參愈傷組織中，(1)同一誘導(dǎo)子處理組下，西洋參愈傷組織中SOD和CAT的活性隨誘導(dǎo)子濃度變化的趨勢(shì)并不一致。在供試濃度內(nèi)，MeJA和SA處理組SOD、CAT活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)50 μmol/L濃度MeJA和100 μmol/L濃度SA處理后的西洋參愈傷組織中SOD的活性均達(dá)到高峰值，分別為對(duì)照組的1.84、2.04、1.94、1.90倍；經(jīng)100 μmol/L濃度MeJA、50 μmol/L濃度SA處理后的西洋參愈傷組織中CAT活性均達(dá)到活性高峰。(2)MeJA和SA的作用濃度對(duì)西洋參愈傷組織中POD活性的影響趨勢(shì)一致，均隨著誘導(dǎo)子濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，POD活性誘導(dǎo)峰值分別出現(xiàn)在50 μmol/L濃度MeJA和100 μmol/L濃度SA誘導(dǎo)下。與對(duì)照組相比，50 μmol/L至200 μmol/L濃度MeJA能顯著促進(jìn)MDA含量的增加(P<0.05)；在SA誘導(dǎo)子試驗(yàn)組內(nèi)，低濃度SA對(duì)MDA含量無顯著影響，高濃度SA能顯著促進(jìn)MDA含量的積累。

圖3 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織中抗氧化酶活性及MDA含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of inducers on antioxidant enzyme activity and MDA content in callus of AG

2.3 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織皂苷的影響

2.3.1 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織總皂苷的影響

由圖4分析可知，與對(duì)照組相比，各濃度誘導(dǎo)子均能顯著促進(jìn)西洋參愈傷組織中總皂苷含量和產(chǎn)量的增加(P<0.05)。在MeJA誘導(dǎo)作用下，總皂苷的含量和產(chǎn)量隨著其作用濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，但在SA誘導(dǎo)子作用下，總皂苷的含量和產(chǎn)量隨著作用濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。(1)當(dāng)MeJA濃度為100 μmol/L時(shí)，愈傷組織中總皂苷含量和產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為31.495 8 mg/g和24.465 3 mg，是對(duì)照組的4.23和3.86倍。(2)在SA誘導(dǎo)子試驗(yàn)組中，當(dāng)SA濃度為300 μmol/L時(shí)，西洋參愈傷組織中總皂苷含量和產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為18.537 6 mg/g和14.085 3 mg，是對(duì)照組的2.49和2.22倍，但與200 μmol/L濃度SA處理組之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織中總皂苷的影響Fig.4 Effects of different concentrations of inducers on total saponins in callus of AG

2.3.2 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織單體皂苷含量的影響

由圖5分析可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)適宜濃度MeJA和SA處理的西洋參愈傷組織中單體皂苷的含量均有明顯提高(P<0.05)。(1)當(dāng)MeJA濃度為100 μmol/L時(shí)，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量最高，其含量為2.576 0、2.291 3、7.493 3、0.600 7 mg/g，是對(duì)照組的3.78、3.74、3.77、3.11倍。(2)經(jīng)200 μmol/L濃度SA處理的人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb2的含量最高，其含量為1.874 0、1.712 3、0.517 3、1.517 0 mg/g，是對(duì)照組的2.75、2.79、11.50、1.45倍。當(dāng)SA濃度為300 μmol/L時(shí)，人參皂苷Rb1的含量最高，為2.885 3 mg/g，是對(duì)照組的5.78倍。

圖5 不同濃度MeJA和SA對(duì)西洋參愈傷組織中單體皂苷含量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of MeJA and SA on monomoside saponins content in callus of AG

3 討論與結(jié)論

雖然誘導(dǎo)子能夠促使植物細(xì)胞有目的性的分泌某些次生產(chǎn)物，滿足人類所需求的藥用價(jià)值,但所產(chǎn)生的這類次生產(chǎn)物也可能對(duì)植物細(xì)胞自身的生長(zhǎng)發(fā)育造成損傷，降低植物細(xì)胞的生物總量。Mao等[14]通過不同濃度的誘導(dǎo)子進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)研究表明，不同濃度的MeJA和酵母提取物對(duì)朱砂愈傷組織的生長(zhǎng)具有不同的生理作用；此外，Miao等[15]在試驗(yàn)中用HPLC測(cè)定香豆素含量結(jié)果表明，SA和MeJA對(duì)北沙參愈傷組織生長(zhǎng)及香豆素均有一定的促進(jìn)作用；Wang等[16]在試驗(yàn)中指出50～100 μmol/L濃度MeJA會(huì)促進(jìn)銀杏懸浮細(xì)胞中黃酮含量的積累，150～200 μmol/L濃度則會(huì)抑制其合成。本試驗(yàn)中選用的MeJA和SA誘導(dǎo)子均對(duì)西洋參愈傷組織的生物量產(chǎn)生影響，均阻礙西洋參愈傷組織生長(zhǎng)。這可能是因?yàn)楦邼舛鹊恼T導(dǎo)子能激發(fā)植物體內(nèi)多種脅迫反應(yīng)，致使細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)膨脹、收縮或破損等，破壞了細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制了植物組織的生長(zhǎng)。

正常條件下生長(zhǎng)的植物細(xì)胞受到外源誘導(dǎo)子刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平會(huì)表現(xiàn)出不同程度的失調(diào)。植物細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自身的抗氧化酶系統(tǒng)，利用SOD、CAT、POD等酶的相互協(xié)調(diào)配合，以清除體內(nèi)過剩的自由基，從而保護(hù)植株在不良環(huán)境下免遭破壞。MDA作為細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化時(shí)的產(chǎn)物，能間接反應(yīng)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性[17,18]。Li等[19]研究指出，SA和MeJA對(duì)SOD、POD、CAT活性，MDA含量及遠(yuǎn)志酮III、3,6′-二芥子?；崽堑姆e累均具有促進(jìn)作用。Taimoor等[18]發(fā)現(xiàn)蕎麥愈傷組織中POD和SOD活性隨著SA作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在第7周時(shí)活性最高。Marziyeh等[20]發(fā)現(xiàn)4%和6%濃度聚乙二醇顯著增加了紅豆杉愈傷組織中MDA含量，但1%、2%、3%和5%濃度聚乙二醇對(duì)MDA含量沒有影響。在本研究中發(fā)現(xiàn)2種誘導(dǎo)子在適宜濃度下均可以顯著激活西洋參愈傷組織中抗氧化酶SOD、CAT、POD活性和MDA含量，超出濃度范圍相關(guān)酶活性低于對(duì)照組，這可能是因?yàn)檎T導(dǎo)子對(duì)抗氧化酶活性影響都有一定限度，如果超過限度，會(huì)使酶活性大大降低，致使細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積累，從而會(huì)危害植物細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

大量研究表明，不同誘導(dǎo)劑和濃度對(duì)同一植物材料的影響有很大差異。例如，通過添加乙酸鈉、SA和Cu2+能不同程度有效的提高北柴胡不定根的產(chǎn)量和柴胡皂苷的含量[21]；低濃度的稀土元素Ce3+能增加銀杏懸浮細(xì)胞中黃酮類化合物的產(chǎn)生，但是高劑量的Ce3+會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]。在同一植物中，誘導(dǎo)子誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的最佳濃度也不相同。Qi等[23]發(fā)現(xiàn)在絞股藍(lán)毛狀根培養(yǎng)中，MeJA、SA和酵母提取物的最佳添加濃度不同，分別不同程度增加毛狀根生長(zhǎng)量及總皂苷含量。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在西洋參愈傷組織中，2種誘導(dǎo)子均能顯著促進(jìn)人參皂苷的積累，其中MeJA和SA誘導(dǎo)人參皂苷的最佳濃度分別為100、200 μmol/L，分別是對(duì)照組的4.23、2.49倍。另外發(fā)現(xiàn)，不同誘導(dǎo)子及濃度影響西洋參愈傷組織中單體皂苷的合成，其中對(duì)單體皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rc、Rb2的影響變化很大。由此得出，在西洋參愈傷組織中，誘導(dǎo)效果為MeJA>SA。在西洋參組織培養(yǎng)中，酵母提取物、SA、硝酸銀、氯化鈣、MeJA、真菌誘導(dǎo)子都能提高人參皂苷的含量，我們的結(jié)果與其一致[24-26]。這種結(jié)果可能是由多種因素共同作用導(dǎo)致，原因可能與不同誘導(dǎo)子的受體種類、數(shù)量有關(guān)，雖然低濃度的誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞的傷害較小，但可能只會(huì)引起植物細(xì)胞的部分誘導(dǎo)，使次生代謝產(chǎn)物的含量達(dá)不到最高值；也可能與西洋參愈傷中各個(gè)內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平不同有關(guān)，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)涉及多個(gè)合成途徑及反應(yīng)步驟不同，不同誘導(dǎo)子所參與的合成通路不同。因此，選擇合適的誘導(dǎo)子以及最佳的濃度促進(jìn)西洋參愈傷生長(zhǎng)和人參皂苷積累尤為重要。

次生代謝產(chǎn)物是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,在植物生命活動(dòng)中有重要意義，還是許多藥物、染料、香料等化合物的重要來源[27]。誘導(dǎo)子是在植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)新的次生代謝產(chǎn)物或增強(qiáng)生物合成以及積累次生代謝產(chǎn)物最有效和最廣泛使用的生物技術(shù)工具之一[14]。本試驗(yàn)考察了MeJA和SA誘導(dǎo)子對(duì)西洋參愈傷組織生長(zhǎng)、相關(guān)酶活性及人參皂苷含量的影響，結(jié)果表明在西洋參愈傷組織中添加適當(dāng)濃度MeJA和SA均可以顯著激活相關(guān)酶活性，提高人參皂苷化合物含量，雖然MeJA抑制生長(zhǎng)，但是MeJA濃度為100 μmol/L時(shí)，愈傷組織中總皂苷含量和產(chǎn)量均達(dá)到最大值，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc的含量最高，所以MeJA誘導(dǎo)人參總皂苷的效果最好。本文為利用誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參有效成分合成提供了依據(jù)，但關(guān)于誘導(dǎo)子調(diào)控西洋參愈傷中人參皂苷積累的機(jī)理，以及如何更有效地協(xié)同利用誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參愈傷品質(zhì)的提高，是后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要解決的問題。