馬意軒，杜 娟，陳美霓，徐向榮，趙菊梅

（延安大學醫(yī)學院，延安市腫瘤防治重點實驗室，陜西 延安 716000）

乳腺癌是威脅女性生命安全和健康的常見癌癥。2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)［1］顯示，女性乳腺癌已超過肺癌，成為最常見的癌癥。在2020年大約有230萬新發(fā)乳腺癌病例，占所有癌癥病例的11.7%。目前，治療乳腺癌的主要手段仍為手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療等［2］。但是由于較高的復(fù)發(fā)率和放、化療的一些不良反應(yīng)，患者的生存質(zhì)量仍然得不到有效的保障。相比于傳統(tǒng)治療，中藥治療乳腺癌具有多靶點、毒性及不良反應(yīng)小、效果好等特點［3］。研究［4］表明土茯苓有治療乳腺癌的作用，但目前對于土茯苓抗乳腺癌作用機制的研究報道較少，缺乏系統(tǒng)的分子水平的作用機制探索以及多細胞層面的抗癌作用研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，融合高通量組學技術(shù)、生物信息學技術(shù)，通過構(gòu)建多成分-多靶點的調(diào)控模型，并通過多節(jié)點的分析找出關(guān)鍵節(jié)點，系統(tǒng)性地闡釋中藥作用于疾病過程中在分子水平的作用機制，這與中醫(yī)的整體性、系統(tǒng)性診治觀點相吻合［5-6］。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，構(gòu)建整體性、系統(tǒng)性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，多角度分析土茯苓治療乳腺癌的潛在靶點，為其作用機制的實驗探索提供理論參考。

1 方法

1.1 土茯苓活性成分篩選以及靶點預(yù)測

1.1.1 成分篩選以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為標準，通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）篩選土茯苓的活性成分。

1.1.2 靶點預(yù)測用TCMSP預(yù)測活性成分的潛在靶點。同時獲取活性成分的化學結(jié)構(gòu)，通過瑞士生物信息學研究所（Swiss Institute of Bioinformatics，Swiss，http：//swisstargetprediction.ch/）、美國加利福尼亞大學藥物化學系Shoichet實驗室提供的相似性集合方法數(shù)據(jù)庫（Similarity ensemble approach，SEA，https：//sea.bkslab.org/）、PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預(yù)測活性成分的潛在靶點，所取得結(jié)果經(jīng)合并后去重。蛋白靶點經(jīng)UniProt數(shù) 據(jù) 庫（https：//www．uniprot．org/uniprot/）比對矯正，同時轉(zhuǎn)為基因靶點。

1.2 乳腺癌相關(guān)靶基因的獲取

以“Breast Cancer”為關(guān)鍵詞，通過毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（comparative toxicogenomics database，CTD，https：//ctdbase.org/）、人類基因數(shù)據(jù)庫（The Human Gene Database，GeneCards，https：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/）、PharmGKB數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.pharmgkb.org/）、Dis-GeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/），檢索并篩選乳腺癌的相關(guān)靶基因，其中CTD數(shù)據(jù)庫根據(jù)經(jīng)驗設(shè)置推理分數(shù)大于100為篩選條件，DisGeNET數(shù)據(jù)庫以“Advanced breast cancer”“Breast Cancer，F(xiàn)amilial”“estrogen receptor-negative breast cancer”“Oestrogen receptor positive breast cancer”“HER-2 positive breast cancer”“HER2-negative breast cancer”為關(guān)鍵詞檢索。GeneCards以相關(guān)分數(shù)大于20為篩選條件。將以上數(shù)據(jù)庫檢索到的疾病相關(guān)基因合并后進行去重。

1.3 土茯苓活性成分與作用靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny 2.1在線工具分析土茯苓與乳腺癌的交集靶點作為土茯苓治療乳腺癌的潛在靶點。將土茯苓的活性成分和潛在作用靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。其網(wǎng)絡(luò)節(jié)點代表藥物、活性成分、交集靶點和疾病，邊表示兩者具有相互作用。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI），將獲得數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.2軟件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過Cytohubba插件篩選其核心靶點進行可視化處理。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

利用Metascape在線分析平臺（https：//metascape.org/）進行基因本體（GeneOntology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并通過微生信（www.bioinformatics.com.cn）在線工具進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 土茯苓活性成分的收集與篩選

以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選 條件，研究 由TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選獲得15個（表1）土茯苓有效活性成分。其中包括槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、花旗松素（taxifolin）、谷甾醇（sitosterol）、柚皮素（naringenin）、異黃杞苷（isoengelitin）、落新婦苷（astilbin）、豆甾醇（Stigmasterol）、薯蕷皂苷元（diosgenin）等活性成分。

表1 土茯苓有效活性成分

2.2 靶點信息的收集和篩選

通過TCMSP、Swiss、SEA、PharmMapper數(shù)據(jù)庫共預(yù)測到土茯苓治療乳腺癌的潛在靶點有614個。通過DisGeNET、PharmGKB、GeneCards、CTD、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索乳腺癌靶點，最終得到2 195個乳腺癌疾病靶點。通過韋恩在線平臺取藥物-疾病靶點基因的交集，得到273個交集靶點，即土茯苓治療乳腺癌的潛在作用靶點，將共有靶點所對應(yīng)的中藥、有效成分、對應(yīng)的疾病信息導入Cytoscape 3.8.2，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。網(wǎng)絡(luò)由290個節(jié)點和1 039條邊組成。

圖1 土茯苓治療乳腺癌的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

紅色節(jié)點對應(yīng)疾病，綠色節(jié)點對應(yīng)藥物，橙色節(jié)點對應(yīng)活性成分，藍色節(jié)點對應(yīng)藥物-疾病的交集靶點，邊表示節(jié)點之間的相互作用關(guān)系。

2.3 土茯苓治療乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò)

將273個藥物-疾病共同靶點導入STRING在線數(shù)據(jù)庫，設(shè)置使用默認參數(shù)，剔除1個游離的靶點，得到靶點蛋白272個。將獲得結(jié)果導入Cytoscape 3.8.2軟件，利用cytuHubba插件根據(jù)度值篩選出土茯苓治療乳腺癌排名前30的關(guān)鍵靶點蛋白，430條相互作用關(guān)系，并進行可視化處理（圖2）。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，排名靠前的核心靶點包括AKT1、TP53、ALB、TNF、EGFR、VEGFA、IL6、MYC、JUN等，提示這些靶點在治療過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中連接其他節(jié)點的樞紐。

圖2 土茯苓治療乳腺癌的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析

根據(jù)PPI核心靶點的分析結(jié)果，將30個核心靶點蛋白導入Metascape在線分析平臺，結(jié)果顯示土茯苓治療乳腺癌共涉及900個生物學過程（biological processes，BP），35種細胞組分（cellular components，CC）以及47種分子功能（molecular functions，MF）。

BP中，主要涉及到蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)控、細胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細胞運動的正向調(diào)節(jié)、細胞組分運動的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)移酶活性的正向調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)調(diào)控、對細胞因子的反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞的應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)蛋白激酶活性以及調(diào)節(jié)上皮細胞增殖等生物過程進行調(diào)節(jié)。

CC中，主要涉及到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膜筏、膜微域、囊泡腔、核膜、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、溶酶體、轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物以及分泌顆粒管腔等細胞組分進行調(diào)節(jié)。

MF中，主要涉及蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性、細胞因子受體結(jié)合、信號受體激活劑活性、蛋白C端結(jié)合、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、細胞因子活性以及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性等分子功能進行調(diào)節(jié)。

將上述30個核心靶點蛋白導入Metascape在線分析平臺進行KEGG通路富集分析，得到的結(jié)果顯示土茯苓治療乳腺癌共涉及157條通路。富集潛在靶基因最多的10條通路依次為癌癥、癌癥中的蛋白聚糖、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)性皰疹病毒感染、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、內(nèi)分泌抵抗、乳腺癌、癌癥中的微小RNA，提示土茯苓可能通過以上通路發(fā)揮治療乳腺癌的作用。

使用微生信在線作圖網(wǎng)站將GO分析與KEGG分析結(jié)果，分別按富集基因數(shù)和P值排序，選前15個繪制成柱狀圖和氣泡圖（圖3）。氣泡圖中氣泡大小代表富集基因數(shù)的多少，氣泡顏色差異依P值變化。

圖3 土茯苓治療乳腺癌的GO富集分析和KEGG通路富集分析

3 討論

本研究最終預(yù)測得到土茯苓治療乳腺癌涉及到15種有效活性成分，273個潛在作用靶點和157條信號通路，其活性成分、作用靶點、信號通路的多樣性以及網(wǎng)絡(luò)分析的整體性，與中醫(yī)藥強調(diào)的“同病異治和異病同治”觀點不謀而合［7］。

現(xiàn)代藥理學研究證實，土茯苓的化學成分主要包括黃酮類、苯丙素類、甾體類、有機酸、揮發(fā)油［8］。本次研究的土茯苓有效化學成分為黃酮類和甾體類，其中黃酮類包括異黃杞苷、花旗松素、槲皮素、柚皮素和落新婦苷等，甾體類包括谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇和薯蕷皂苷元等。有研究表明，黃酮類化合物有抗病毒［9］、抗菌［10］、抗腫瘤［11］、抗氧化［12］等生物活性。Li等［13］發(fā)現(xiàn)花旗松素通過下調(diào)β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄及翻譯促進間充質(zhì)細胞到上皮細胞的轉(zhuǎn)變，進而抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲；Lee等［14］發(fā)現(xiàn)槲皮素可以調(diào)節(jié)表皮生長因子/熱激蛋白27通路從而調(diào)節(jié)乳腺癌干細胞和祖細胞的血管生成擬態(tài)，進而減少乳腺癌干細胞的數(shù)量；Zhao等［15］發(fā)現(xiàn)柚皮素能以時間和濃度依賴性的方式抑制乳腺癌細胞增殖，并使其停留在G0/G1期阻止細胞發(fā)育。Sun等［16］發(fā)現(xiàn)落新婦苷通過調(diào)節(jié)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶依賴性途徑促進乳腺癌細胞的凋亡。甾體類化合物經(jīng)常被用于炎癥、癌癥和內(nèi)分泌治療中［17］，其中Vundru等［18］發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇誘導細胞周期停滯在G0/G1期并伴隨著CDK4和cyclin D1的降低，以及p21/Cip1和p27/Kip1蛋白水平的增加，同時β-谷甾醇還可誘導乳腺癌細胞的凋亡。Liu等［19］發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元通過抑制乳腺癌細胞中的S期激酶相關(guān)蛋白2（Skp2）從而降低細胞活力和運動性并誘導細胞凋亡。在本次研究中主要涉及到的活性成分同樣包括上述黃酮類和甾體類化合物，由此說明，本次研究較全面地收集到土茯苓治療乳腺癌的有效活性成分。

靶點AKT1、TP53、ALB、TNF、EGFR、VEGFA、IL6、MYC、JUN、PTEN、ERBB2、IGF-1、CASP3等在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，是土茯苓治療乳腺癌的核心靶點。其中，AKT信號在細胞中具有許多功能，如細胞生存、細胞生長、細胞周期調(diào)節(jié)和代謝。Deng等［20］發(fā)現(xiàn)，在中國乳腺癌患者中檢測PIK3CA和AKT1基因的突變并且可能與預(yù)后不良有關(guān)。TP53在許多腫瘤類型中充當腫瘤抑制因子，誘導生長停滯或凋亡。易宗畢等［21］研究發(fā)現(xiàn)，TP53體細胞突變在中國乳腺癌患者中很常見。EGFR是一種細胞表面蛋白，與表皮生長因子結(jié)合，從而誘導受體二聚化和酪氨酸自身磷酸化，導致細胞增殖，而且普遍在乳腺癌中高表達，尤其是三陰性乳腺癌和炎性乳腺癌［22-23］。PTEN是一種PIP3特異性磷酸酶，可使PIP3去磷酸化變?yōu)镻IP2分子，進而阻止AKT的激活而起到抑制腫瘤細胞增殖的作用［24］，同時PTEN在乳腺癌中經(jīng)常發(fā)生突變，導致其功能缺失［25］。ERBB2（又稱HER2）包含一個胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，在大約15%～20%的乳腺癌病例中觀察到ERBB2高表達［26］，這可能導致PI3K/AKT/mTOR通路激活［27］。IGF-1是IGF1R的配體，與IGF1R的α亞基結(jié)合，導致內(nèi)在酪氨酸激酶的激活，其自磷酸化β亞基中的酪氨酸殘基，從而引發(fā)一連串的下游信號事件，導致PI3K-AKT/PKB和Ras-MAPK途徑的激活，免疫組織化學染色顯示，IGF-1受體在近一半的乳腺癌中高表達［28］。而CASP3所編碼的蛋白質(zhì)是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡的執(zhí)行階段起核心作用，同時還參與壞死和炎癥的信號通路，可見這些靶點涉及腫瘤細胞的細胞周期、凋亡、細胞生長等方面，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，由此證實了土茯苓治療乳腺癌的作用。

通過將30個核心靶點進行KEGG信號通路的富集分析發(fā)現(xiàn)土茯苓治療乳腺癌相關(guān)的信號通路有157條，主要涉及到的通路都與PI3K-AKT相關(guān)，包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、MAPK、內(nèi)分泌抵抗等。PI3K/AKT信號通路在細胞代謝、細胞生長、細胞增殖、凋亡和血管生成等基本細胞活動中發(fā)揮重要作用，大約30%～40%的乳腺癌患者存在PIK3CA突變，PIK3CA是編碼PI3K蛋白p110α催化亞基的基因［29］，與此同時PTEN的失活進一步加劇了該通路的激活，這可能與內(nèi)分泌治療的耐藥有關(guān)［30］。也有研究［31］證實，黃酮類化合物通過PI3K-AKT信號通路誘導乳腺癌細胞的凋亡。MAPK信號通路在腫瘤細胞的增殖、生長、分化方面起到關(guān)鍵的作用。有研究［32］證實，MAPK信號通路和PI3K-AKT信號通路共同參與IGF-1誘導的VEGF-C（血管內(nèi)皮生長因子-C）上調(diào)，從而誘導乳腺癌細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。對于EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性與PI3K/AKT信號通路的關(guān)系早在多年以前就有研究［33］報道，EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性產(chǎn)生的原因之一可能與PTEN的缺失有關(guān)，從而解除其對PI3K/AKT信號通路的抑制引發(fā)耐藥，故推測PI3K/AKT信號通路是土茯苓治療乳腺癌過程中的關(guān)鍵樞紐。

綜上所述，本次研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探索土茯苓治療乳腺癌的分子機制，系統(tǒng)闡述了多靶點、多成分、多通路的相互作用關(guān)系，預(yù)測到PI3K/AKT通路在分子網(wǎng)絡(luò)中的核心作用，為更進一步開展土茯苓治療乳腺癌的實驗研究及臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。