王 維，趙曉東，魏明清，雷華斌，溫 豆，薛旭升*

（1.北京中醫(yī)藥大學孫思邈醫(yī)院，陜西 銅川 727031；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在非酒精性或其他特殊肝損傷因素下的一種以肝細胞內脂質沉積過多和肝細胞脂肪變性為特征的疾病，作為目前全球肝病中最常見的類型，其患病率約為25%～45%，并且正在迅速增加，預計在未來5年內將成為肝硬化以及肝細胞癌的首要病因［1］。研究［2］表明NAFLD不僅是心血管疾病的危險因素，還可能對缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響。IS是指因大腦供血不足而導致局部腦缺血、缺氧性壞死，并伴有相應神經(jīng)功能缺損的臨床綜合征。全球范圍內，IS作為繼缺血性心臟病之后的第3大常見死因，嚴重危及中老年人的健康［3］。NAFLD不僅與IS風險增加獨立相關，同時也可能對IS患者病情及預后產(chǎn)生不良影響［4］。因此積極探索NAFLD與IS共病的潛在機制以及推動兩者共病診療進展是當今研究的熱點和重點。

目前有關NAFLD與IS共病機制的研究相對較少，目前未見利用生物信息學探究其共病機制的相關報道。因此，本研究基于多重生物信息學分析的整體思路，擬利用加權基因共表達網(wǎng)絡分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）等多種生物信息學技術，從基因、微小RNA（microRNA，miRNA）、轉錄因子（Transcription factors，TF）、信號轉導通路以及相關藥物等多角度系統(tǒng)性地對NAFLD與IS共病的潛在機制展開分析與探討，以期為NAFLD與IS共病的相關基礎以及臨床研究提供借鑒，并為疾病的預防與診療提供有益的理論參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理

從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中分別下載NAFLD與IS的基因芯片數(shù)據(jù)集。NAFLD數(shù)據(jù)納入標準：①樣本應至少包含3組，分別為健康對照、單純性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝??；②樣本來源于人體肝組織；③芯片數(shù)據(jù)為基因表達譜；IS數(shù)據(jù)納入標準：①樣本應至少包含2組，分別為健康對照和IS；②樣本來源于人體外周血；③芯片數(shù)據(jù)為基因表達譜。研究選取的NAFLD數(shù)據(jù)集為GSE126848和GSE63067，共有NAFLD樣本42例，健康對照樣本21例；選取的IS數(shù)據(jù)集包括GSE16561和GSE22255，共有IS樣本59例，健康對照樣本44例。通過Bioconductor平臺中的affy數(shù)據(jù)包對NAFLD、IS各自的原始數(shù)據(jù)集進行背景校準、歸一化以及基因表達值log2轉換的預處理，同時在NAFLD與IS各自組內當多個探針對應一個共同基因時，取平均值作為其表達值。另外運用SVA數(shù)據(jù)包消除NAFLD與IS各自組內數(shù)據(jù)集之間的批次效應和其他非必要變異。

1.2 加權基因共表達網(wǎng)絡構建以及相關模塊篩選

WGCNA是一種分析多個樣本基因表達特征的方法，它可以通過相似基因表達特征對基因進行聚類并形成模塊，并可分析模塊與樣本特征之間的關系［5］。本研究將分別對NAFLD與IS各自數(shù)據(jù)集展開以下分析：①將各自綜合數(shù)據(jù)集中樣本間變異超過25%的基因導入WGCNA數(shù)據(jù)包；②為保證構建網(wǎng)結果可靠，剔除異常樣本；③通過使用pick-Soft-Threshold函數(shù)的共表達相似性計算軟閾值以及鄰接矩陣；④將鄰接矩陣轉化為拓撲重疊矩陣；⑤通過層次聚類和動態(tài)樹切割功能檢測模塊，并將具有相似表達譜的基因聚類到基因模塊中；⑥對于與NAFLD、IS各自臨床特征最相關的模塊，計算模塊隸屬度（module membership，MM）和基因顯著性（Gene Significance，GS），并將模塊中基因保留用于后續(xù)分析。

1.3 共病基因的篩選以及富集分析

將NAFLD和IS兩種疾病中與自身臨床特征最相關模塊內的基因取交集，篩選出兩者之間潛在共病基因，并對其富集分析。基因本體（gene ontology，GO）功能富集包括以下3項獨立類別：生物過程（biological process，BP），細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）是用于搜索與已篩選基因相關的通路。使用可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery，DAVID）在線工具，對篩選的共病基因進行GO功能注釋和KEGG途徑分析，每個項目的基因數(shù)≥5并且P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.4 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建以及關鍵共病基因初步篩選

將共病基因上傳至STRING（the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING）數(shù)據(jù)庫，以“highest confidence”（＞0.4）作為最低相互作用閾值，并在隱藏斷開節(jié)點后構建PPI網(wǎng)絡。應用網(wǎng)絡拓撲分析插件CytoNCA篩選出中間中心性、緊密性中心性、度中心性、特征向量中心性、基于局部平均連通性的方法、網(wǎng)絡中心性、子網(wǎng)絡中心性、信息中心性均大于中位值的基因初步作為NAFLD與IS之間的關鍵共病基因。

1.5 miRNA-TF-mRNA調控網(wǎng)絡構建

運用mirTarBase、Starbase和Targetscan數(shù)據(jù)庫對初步篩選的NAFLD與IS關鍵共病基因進行相關miRNA預測，為提升預測結果的可靠性，對以上3大數(shù)據(jù)庫各自預測的miRNA取交集，篩選出共同miRNA作為關鍵共病基因的相關miRNA。利用Enrichr數(shù)據(jù)庫預測關鍵共病基因的相關TF，并以P＜0.05作為標準進行篩選。根據(jù)以上所獲信息，運用Cytoscape軟件構建關鍵共病基因的miRNA-TF-mRNA調控網(wǎng)絡，通過分析網(wǎng)絡以進一步篩選出NAFLD與IS共病的關鍵生物學分子。

1.6 藥物預測

基于NAFLD與IS之間潛在共病基因，運用Enrichr數(shù)據(jù)庫中的藥物特征數(shù)據(jù)庫（DSigDB）識別與潛在共病基因相關的藥物分子，篩選條件為P＜0.05，并按照P值由小到大的順序選取前10位藥物作為預測結果進行分析與篩選。

2 結果

2.1 加權基因共表達網(wǎng)絡構建以及相關模塊篩選

研究將兩種疾病中各自基因按方差從大到小排序，選取方差前25%數(shù)量基因進行分析（NAFLD含有4 006個，IS含有4 002個）；應用flashClust工具包分別對NAFLD與IS數(shù)據(jù)進行聚類分析，在NAFLD中閾值設為120，檢測并刪除3個異常值樣本，在IS中閾值設為50，檢測并刪除1個異常值樣本；此外，使用WGCNA包中的“pick-Soft-Threshold”功能篩選軟閾值（NAFLD為3，圖1A；IS為7，圖1E），并在兩種疾病中將閾值設置為0.25以合并集群樹中的相似模塊，最終獲得WGCNA模式圖（圖1B，1F），并獲取兩種疾病各自臨床特征最相關模塊：與NAFLD臨床特征相關性最高的模塊為圖1C所示青綠色模塊，共包含2 119個基因，r=0.53，P=1e-05；與IS臨床特征相關性最高的模塊為圖1G所示黑色模塊，共包含566個基因，r=-0.48，P=4e-07。對兩種疾病各自相關性最高模塊中的基因進行MM和GS相關性分析顯示，二者MM和GS之間存在顯著正相關性（NAFLD的青綠色模塊為相關系數(shù)為0.78，P＜1e-200（圖1D）；IS的黑色模塊為相關系數(shù)=0.68，P=4.8e-78（圖1H）。

圖1 NAFLD與IS加權基因共表達網(wǎng)絡構建及相關模塊篩選

2.2 共病基因的篩選以及富集分析

研究對NAFLD和IS臨床特征相關性最高的基因取交集，共獲得NAFLD與IS之間的潛在共病基因86個（圖2A）。GO功能富集顯示NAFLD和IS潛在共病基因主要參與包括炎癥反應、固有免疫反應、適應性免疫反應等生物學過程，細胞外空間、質膜外側等細胞組成以及細胞因子活性、受體結合分子功能（圖2B）。KEGG通路富集分析NAFLD與IS潛在共病基因主要通過細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞粘附分子信號通路發(fā)揮作用（圖2C）。

圖2 NAFLD與IS共病基因的篩選以及相關功能注釋與富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡構建以及關鍵共病基因初步篩選

用Cytoscape3.8.0軟件對NAFLD與IS共病基因的PPI網(wǎng)絡進行可視化處理，結果顯示NAFLD與IS共病基因的PPI網(wǎng)絡中共有43個節(jié)點和75條邊，如圖3所示。使用CytoNCA插件通過對PPI網(wǎng)絡進行8種中心性分析后篩選關鍵共病基因，本研究初步篩得13個潛在關鍵共病基因：B、T淋巴細胞弱化因 子（B and T lymphocytes attenuators，BTLA）、CC族趨化因子受體7（CC chemokine receptor 7，CCR7）、POU2級同源框關聯(lián)因 子1（POU Class 2 Homeobox Associating Factor 1，POU2AF1）等（圖3中黃色橢圓節(jié)點）。

圖3 NAFLD與IS共病基因的PPI網(wǎng)絡

2.4 miRNA-TF-mRNA調控網(wǎng)絡構建

mirTarBase、Starbase和Targetscan數(shù) 據(jù) 庫預 測的NAFLD與IS關鍵共病基因的相關miRNA分別為118個、206個和4 452個，對上述miRNA做交集后獲得19個miRNA（圖4A），NAFLD、IS關鍵共病基因的19個相關miRNA與NAFLD、IS關鍵共病基因自身的mRNA的對應關系（表1）。此外，運用Enrichr數(shù)據(jù)庫預測得到的關鍵共病基因相關TF共有2個，TF與mRNA的對應關系（表2）。根據(jù)NAFLD與IS關鍵基因及其相關的miRNA與TF信息構建miRNA-TF-mRNA調 控網(wǎng) 絡（圖4B）?？梢?在miRNA-TF-mRNA調控 網(wǎng) 絡中has-miR-335-5p與轉錄因子核受體亞家族1H組成員3（Nuclear Receptor Subfamily 1 Group H Member 3，NR1H3）各調控多個關鍵共病基因的mRNA，另外分別受多個miRNA調控的關鍵共病基因有BTLA、CCR7和POU2AF1。通過以上分析，可見NAFLD與IS共病的關鍵生物學分子主要有作為關鍵基因的BTLA、CCR7、POU2AF1，作 為 關 鍵miRNA的hsa-miR-335-5p以及作為關鍵TF的NR1H3。

表1 miRNA-TF-mRNA調控網(wǎng)絡中mRNA與miRNA的對應關系

表2 miRNA-TF-mRNA調控網(wǎng)絡中TF與mRNA的對應關系

圖4 NAFLD與IS關鍵共病基因的相關miRNA篩選以及相關miRNA-TF-mRNA調控網(wǎng)絡構建

2.5 藥物預測

基于研究篩選所得NAFLD和IS的潛在共病基因，研究利用DSigDB數(shù)據(jù)庫對靶向NAFLD和IS潛在共病基因的藥物進行了分析，結果如表3所示，維生素D3、阿托伐他汀可能作為針對NAFLD與IS共病的主要治療藥物。

表3 NAFLD與IS共病的藥物預測

3 討論

與既往關于疾病共病機制的生物信息學研究相比，本研究主要具有以下幾點優(yōu)勢：首先，本研究利用R語言多項數(shù)據(jù)包對數(shù)據(jù)進行了嚴格的背景校準、歸一化、消除批次效應以及剔除異常值等規(guī)范化處理，盡可能地保證了研究結果的可靠性；其次，本研究主要圍繞WGCNA分析疾病相關模塊基因以展開后續(xù)分析。WGCNA的主要優(yōu)點在于既可識別高度相關基因并將其聚類為基因模塊，同時所得模塊還可顯示與臨床特征的相關系數(shù)以供后續(xù)分析［6］；此外，本研究聯(lián)合多類生物學分子從多重生物信息學的角度對共病機制進行分析，以求更加全面、深入地探索NAFLD與IS共病的潛在機制。

通過WGCNA分析獲得與NAFLD、IS臨床特征最相關的模塊，據(jù)此進一步篩選出NAFLD與IS共病基因并開展富集分析。研究［7］顯示NAFLD在炎癥反應方面的主要發(fā)病機制為胰島素抵抗可致肝細胞內三酰甘油蓄積過多致使肝臟發(fā)生炎癥反應并造成肝臟受損；NAFLD患者由于肝細胞蓄積脂肪過多可引起線粒體功能受損，引起內質網(wǎng)通透性改變并引發(fā)一系列生化反應，導致炎性因子大量產(chǎn)生進而加重肝臟受損；腸道菌群紊亂會導致腸道屏障受損，微生物及其促炎產(chǎn)物將通過腸肝循環(huán)進入肝臟，導致肝細胞發(fā)生炎癥壞死等病理學變化。炎癥反應同樣貫穿IS的整個發(fā)病過程，IS發(fā)生初期時缺血區(qū)域將有大量細胞發(fā)生壞死，受到激活的小膠質細胞將釋放大量炎癥因子以及炎癥介質，并因此造成神經(jīng)元損傷；IS再灌注后，外周中性粒細胞以及炎癥因子等將進入缺血區(qū)域并釋放大量炎癥介質，促使炎癥級聯(lián)反應加速發(fā)展［8］。此外，由炎性介質激活的有害物質將對血腦屏障造成損害，引起炎癥介質等穿越并進一步損害腦細胞［9］。炎癥反應在NAFLD與IS共病中的影響可能極其復雜，目前研究［4］表明NAFLD產(chǎn)生的全身性炎癥可能改變血管張力并促進斑塊形成，進一步造成內皮功能受損，并最終影響IS的發(fā)生與發(fā)展。

NAFLD和IS均與固有免疫反應以及適應性免疫反應關系密切，短時間內的固有免疫反應往往是組織修復的必備條件，若其過度激活則將導致機體受損。在NAFLD中，固有免疫反應被認為是引發(fā)及加重NAFLD炎癥的關鍵因素，相關免疫細胞可通過其模式識別受體識別損傷相關分子模式以及病原體相關分子模式，進而啟動信號級聯(lián)反應損傷肝臟［10］。肝臟的適應性免疫應答主要由T細胞與B細胞介導，研究［11］指出T細胞中的Th22和Treg細胞可減緩NAFLD病情進展，而Tc細胞卻可能促進肝臟脂肪變性進程，并且Th17和Tc細胞都可能加速肝損傷以及肝纖維化，另一方面B細胞可能通過適應性免疫機制促使肝臟炎癥與纖維化發(fā)生。IS引發(fā)的固有免疫反應過程與其炎癥反應相似，主要為由小膠質細胞的過度激活及其引發(fā)的一系列有害反應，不同的是在固有免疫反應中星形膠質細胞會分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來保護受傷部位［12］。主要由T細胞與B細胞參與的適應性免疫反應需在IS發(fā)生后較長時間才可發(fā)揮作用，多種輔助性T細胞可能造成嚴重腦損傷以及不良預后，然而有研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)B細胞可能是IS的保護因素［13］。此外，細胞因子和細胞粘附分子都是免疫系統(tǒng)的重要組成成分，而免疫系統(tǒng)通常介導炎癥反應，NAFLD與IS共病中的炎癥、免疫反應常需細胞因子以及細胞粘附因子參與［14］。

本研究對NAFLD與IS共病機制相關的關鍵生物學分子進行了篩選，BTLA可在大多數(shù)淋巴細胞中檢測到，主要通過抑制T細胞和B細胞增殖、活化來誘導免疫抑制［15］，NAFLD和IS的適應性免疫反應均主要由B細胞和T細胞介導，BP分析中BTLA也富集在適應性免疫條目內，因此推測BTLA可能通過適應性免疫在NAFLD與IS共病機制中發(fā)揮關鍵作用。另外有國外學者［16］在斑馬魚實驗中發(fā)現(xiàn)敲除BTLA基因會顯著促進肝臟炎癥，又有研究［17］通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)BTLA的誘導激活可能抑制腦內炎癥反應。CCR7存在于樹突狀細胞以及T細胞與B細胞，具有誘導細胞遷移的作用，研究［18］證明在使用藥物降低CCR7的mRNA表達與蛋白水平后，NAFLD動物模型的肝臟炎癥得到了遏制。另外相關分析［19］表明CCR7在IS患者血清中表達顯著上調，可能對病情變化產(chǎn)生重要影響。POU2AF1是一種B細胞特異性轉錄激活蛋白，研究發(fā)現(xiàn)POU2AF1過表達可促進間充質干細胞脂肪生成，并推斷其可能成為抑制脂肪生成與蓄積的新靶點［20］。NAFLD與IS的發(fā)病機制與脂肪代謝異常密切相關，可見POU2AF1在NAFLD與IS共病機制中可能具有重要地位。

國內學者通過監(jiān)測NAFLD外泌體miRNA的表達，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-335-5p在NAFLD患者血清外泌體中顯著上調，并可能成為NAFLD的生物標志物［21］。另外有研究［19］指出hsa-miR-335可能是重要的神經(jīng)調控因子，其異常表達可能引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并指出hsa-miR-335-5p的發(fā)現(xiàn)可能有助于IS的早期診斷以及治療靶點開發(fā)，此外該研究發(fā)現(xiàn)CCR7可能作為hsa-miR-335-5p的預測靶點，此與本研究結果相符。作為核受體轉錄因子超家族成員，NR1H3不僅在肝臟主要表達，同時在大腦中也有表達，其可通過調節(jié)靶基因的轉錄而廣泛參與炎癥反應、免疫反應以及脂類代謝等生理或病理學過程［22］，因此推測NR1H3可能是NAFLD與IS共病機制中的關鍵TF。此外，調控網(wǎng)絡中NR1H3的靶基因V-Set Pre-B細胞替代輕鏈3（v-set pre-B cell surrogate Light Chain 3，VPREB3）、淋巴毒素β（lymphotoxin beta，LTB）以及B細胞受體CD22主要在淋巴細胞中表達，另一靶基因髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）則主要在中性粒細胞中表達，結合淋巴細胞以及中性粒細胞特性推測NR1H3在NAFLD與IS共病機制中的作用可能以調節(jié)炎癥反應或免疫反應為主［23］。

結合文獻對藥物預測結果進行分析驗證后發(fā)現(xiàn)除維生素D3與阿托伐他汀外，其余化合物均未顯現(xiàn)出與NAFLD以及IS明顯相關的治療作用。有研究［24］通過臨床隨機對照試驗發(fā)現(xiàn)口服補充維生素D3可顯著改善NAFLD患者的代謝及炎癥等相關指標，并推測潛在機制可能與維生素D可減少各類炎癥細胞因子有關，同時建議將補充維生素D作為針對NAFLD患者的輔助治療。另外有研究［25］發(fā)現(xiàn)通過肌注維生素D3可有效地改善NAFLD患者的纖維化評分以及相關生化指標，并且發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏可能與NAFLD發(fā)病風險之間存在顯著相關性。一項橫斷面研究［26］發(fā)現(xiàn)較低水平的血清維生素D3與IS發(fā)病呈正相關，并推測維生素D3可能通過誘導抗氧化反應以及抑制炎性細胞因子發(fā)揮重要神經(jīng)保護作用。國內學者研究［27］發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可能通過降脂以及調節(jié)炎癥、免疫反應等機制顯著改善NAFLD患者肝脂肪變，并且顯現(xiàn)出較好的安全性。在IS方面，研究［28］發(fā)現(xiàn)大劑量阿托伐他汀可能通過調脂、抗炎以及減小斑塊面積而保護急性IS患者的神經(jīng)功能，且安全性較高。

綜上所述，本研究基于多重生物信息學對NAFLD與IS共病機制以及相關藥物進行分析，通過分析得出NAFLD與IS共病機制主要涉及炎癥反應與免疫反應兩大方面，同時根據(jù)miRNA-TF-mRNA調控網(wǎng)絡篩選出了NAFLD與IS共病的關鍵生物學分子-BTLA、CCR7、POU2AF1、hsa-miR-335-5p以及NR1H3等，并對發(fā)病機理進一步展開分析與探討。此外，本研究經(jīng)過篩選與分析，發(fā)現(xiàn)維生素D3與阿托伐他汀兩種藥物對于治療NAFLD與IS共病很可能具有廣闊的應用前景。