任軍香，韓紅敬

(北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100044)

薄型子宮內(nèi)膜的定義尚無統(tǒng)一標準，臨床上推薦當子宮內(nèi)膜厚度<7 mm時稱為薄型子宮內(nèi)膜。而頑固性薄型子宮內(nèi)膜定義為至少1次在胚胎移植(ET)周期中經(jīng)過標準激素替代療法(HRT)內(nèi)膜準備子宮內(nèi)膜厚度仍<7 mm[1]。體外受精-胚胎移植患者(IVF-ET)中薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生率為2.4%[2]。子宮內(nèi)膜厚度<7 mm的患者IVF臨床妊娠率為11%[3]，遠低于目前平均水平(30%～40%)，并與較高的流產(chǎn)風險有關(guān)[4]。薄型子宮內(nèi)膜人群胚胎植入率低可能與子宮內(nèi)膜血供較少、維持內(nèi)膜正常形態(tài)的蛋白缺乏、支持細胞脆性增加致妊娠囊失去物理支撐而剝離等有關(guān)?；颊唧w內(nèi)低雌激素水平、先天的子宮畸形、既往宮腔操作史、盆腔感染引發(fā)的子宮內(nèi)膜炎、長期服用避孕藥、長期不良生活習(xí)慣等均可導(dǎo)致薄型子宮內(nèi)膜。目前臨床上常用大劑量雌激素補充，聯(lián)合低劑量阿司匹林、維生素E、血管活性藥物(如西地那非)、細胞集落刺激因子(G-CSF)以及神經(jīng)肌肉刺激等[5]方法改善子宮內(nèi)膜厚度及血流，但仍有部分頑固性子宮內(nèi)膜薄型患者對以上方案不敏感。頑固性薄型子宮內(nèi)膜的治療是臨床工作中亟待解決的問題。

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)被定義為“血小板濃度是正常水平的4～5倍的自體血液中的血漿成分”。PRP為自體外周靜脈血離心提取獲得。20世紀70年代即已開展了PRP應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)中的研究，目前已廣泛應(yīng)用：骨科在磨碎的骨移植物中添加PRP以提高成骨速率；整形外科在創(chuàng)傷性瘢痕修復(fù)、生發(fā)、游離皮片移植中的應(yīng)用；皮膚科脫發(fā)、難愈性傷口的治療等。PRP的醫(yī)療價值與生物安全性得到了臨床的認可與驗證，但其在婦產(chǎn)科的應(yīng)用仍在起步階段，自2015年起PRP改善薄型子宮內(nèi)膜患者的臨床妊娠結(jié)局方面的研究開始出現(xiàn)。目前大部分研究結(jié)果顯示PRP可改善薄型子宮內(nèi)膜的妊娠結(jié)局，小部分研究結(jié)果提示PRP改善薄型子宮內(nèi)膜的作用不明顯。本文對此方向的研究進展進行綜述，以期促進研究者對薄型子宮內(nèi)膜宮腔灌注PRP開展高質(zhì)量研究，并推動薄型子宮內(nèi)膜患者PRP宮腔灌注的臨床應(yīng)用。

一、PRP的制備及優(yōu)勢

Marx[6]將PRP中血小板的有效濃度定義為1×106/μl。通過提取血液制品成分促進組織再生和修復(fù)已有40余年的歷史，PRP的制備也經(jīng)歷了一代和二代。其中二代PRP的制備較一代在功效和性價比方面有了質(zhì)的提升。但目前臨床制備PRP的方式參差不齊[7]，有待統(tǒng)一。也有研究者認為盲目采用文獻中報道的離心方法是不可取的，需制定與具體的儀器設(shè)備相配套的制備方法[8]。

(一)PRP的制備方法

1.一代PRP的制備：在預(yù)裝有檸檬酸鹽抗凝溶液(ACD-A)的注射器中抽取一定量新鮮采集的外周靜脈血，通過離心去除血液的某些成分來增加血漿中血小板的濃度。添加血小板激活劑使血小板中的生長因子和細胞因子在凝血后10 min內(nèi)激活并釋放，這些因子協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞遷移、附著、增殖/分化以及促進細胞外基質(zhì)積累的作用。全血采集量需根據(jù)所需PRP用量及患者基礎(chǔ)血小板濃度來評估。1 ml PRP的制備需要的全血量大約為5～10 ml，甚至更多[9]，一般宮腔灌注PRP課題需要制備5 ml左右。不同文獻中PRP的制備方法也不盡相同，包括離心速度、離心時間及離心次數(shù)的差異，主要影響PRP中不同成分的含量，從而影響PRP的功能。因此需要統(tǒng)一PRP的制備方法才能縮小因制備方法不同引起的對妊娠結(jié)局影響的誤差。

2.二代PRP的制備：以Choukroun離心方法[10]為標準，將采集的靜脈全血以2 700 r/min，離心12 min(亦有3 000 r/min離心10 min)的方式離心后分3層，上層為血小板貧乏的血漿(PPP)，中層為二代PRP，下層為紅細胞層。制備過程中應(yīng)注意采血后立即離心；制備完成后立即進行宮腔灌注，其生物活性更高。

二代PRP又稱有白細胞的富血小板纖維蛋白(L-PRF)，它與一代PRP的不同點在于所含細胞成分比例及纖維蛋白構(gòu)架不同。在離心的過程中離心速度越快則形成的纖維蛋白網(wǎng)越致密有序。二代PRP僅一次離心，一代PRP需要經(jīng)過兩次較二代PRP速度低的離心，且第一次離心后會棄掉上層部分纖維蛋白原。因此二代PRP相較于一代有以下優(yōu)勢：(1)能發(fā)揮更高的生物學(xué)效應(yīng)。其內(nèi)含白細胞及其他一些細胞因子能提高子宮內(nèi)膜的抗感染及修復(fù)能力；(2)不需要額外添加鈣離子等促凝劑，僅一次離心，更方便省力且安全；(3)所含纖維蛋白原更豐富，形成的纖維蛋白網(wǎng)更堅固致密、不易被水解，發(fā)揮作用時間更久[11]。

(二)PRP的優(yōu)勢

PRP富含多種生長因子，經(jīng)激活后可以緩慢釋放、協(xié)同發(fā)揮作用，和單一的一次性釋放方式相比作用時間更長、具有更強的實際效果。同時，相關(guān)研究表明PRP不會造成細胞行為方式的改變，即不會導(dǎo)致細胞惡性變[12]，而且造成宮腔內(nèi)感染的可能性也極低。此外，PRP來源于患者本身，減少了宮腔組織對因子的排斥作用；更容易獲得且成本更低；PRP雖屬于血液制品，但血液傳播疾病相關(guān)風險非常低。

二、 PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的研究進展

(一)PRP作用于子宮內(nèi)膜的機制及基礎(chǔ)研究進展

PRP宮腔灌注的生物學(xué)效應(yīng)可能與PRP中生長因子的促炎、趨化、促血管生成和抗凋亡作用有關(guān)。PRP中血小板濃度及各種生長因子如血小板源生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等[13]的濃度提升了4～5倍。這些因子在白細胞向損傷部位的募集、誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)其他參與組織修復(fù)的細胞類型(如平滑肌細胞和間充質(zhì)干細胞)的增殖和遷移、促進血管生成以及成纖維細胞的激活等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。這些生長因子在PRP被激活的過程中通過脫顆粒的方式緩慢釋放，活化的細胞因子與內(nèi)膜細胞上相應(yīng)受體作用激活相關(guān)信號通路，可促進人子宮內(nèi)膜上皮細胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞、骨髓源性間充質(zhì)干細胞的遷移、增殖和分化[15]，從而刺激腺體細胞及血管的增生，促進合成膠原蛋白原，修復(fù)損傷組織。除生長因子外，PRP中還含有纖維蛋白、纖維結(jié)合蛋白等蛋白質(zhì)物質(zhì)，形成纖維網(wǎng)絡(luò)，起到修復(fù)細胞、促進細胞黏附、防止細胞流失的支架作用[16]。

2018年一項PRP刺激子宮內(nèi)膜細胞再生的體外試驗進一步探討了PRP和PPP對子宮內(nèi)膜間質(zhì)成纖維細胞(ESF)、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)和Ishikawa細胞(IC)增殖、遷移和基因表達的影響[15]，該研究發(fā)現(xiàn)：活化的富血小板血漿(APRP)、非活化的富血小板血漿(NAPRP)、PPP均有促進子宮內(nèi)膜細胞增殖和遷移的作用，但APRP的影響最大且作用最一致。另外，由于間充質(zhì)干細胞(MSCs)中性激素受體的存在及其細胞外基質(zhì)重塑的能力，MSCs是細胞外基質(zhì)重塑、血管生成、細胞間通訊和絕經(jīng)后組織修復(fù)的重要細胞成分。MSCs自噬水平降低被認為是BM-MSCs老化的機制之一。在此基礎(chǔ)上，Vishnyakova等[17]通過自體PRP與自體普通血漿和完全生長液對從子宮分離得到的MSCs的影響試驗，觀察到PRP處理后子宮內(nèi)膜MSCs中自噬標志物LC3B蛋白的表達增加，提示PRP可通過促進自噬從而促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的自我更新。

楊耀等[18]在衍生的PRP對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞體外增殖影響的試驗中發(fā)現(xiàn)，37～41周新生兒臍靜脈血中血小板內(nèi)因子PDGF-AB的含量高于同孕周孕婦外周靜脈血中PDGF-AB的含量，此研究還顯示低濃度的PRP可呈劑量依賴模式刺激細胞的增殖和遷移，超過一定濃度范圍則抑制細胞增殖，且2% PRP劑量時細胞增殖最強[19]。因此，PRP的劑量濃度與其臨床療效密切相關(guān)，提示找到最適宜宮腔灌注的PRP應(yīng)用濃度臨床意義重大。

(二)PRP作用于子宮內(nèi)膜的動物實驗研究

薄型子宮內(nèi)膜動物模型(無水乙醇處理大鼠宮腔)內(nèi)膜表面平整、腺體及血管不可見，內(nèi)膜功能層菲薄幾近消失[20]。研究表明，將PRP灌注于經(jīng)無水乙醇處理的大鼠宮腔中，既可提高標志子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)蛋白，如波形蛋白(vimentin)、整合素β3、VEGF、同源盒基因-A10(HOXA10)以及細胞增殖相關(guān)的核蛋白Ki-67的表達，改善子宮內(nèi)膜對胚胎的接納能力[20]；又可降低促炎癥細胞因子IL-1 mRNA的表達水平，降低炎癥反應(yīng)[21]；還可提高子宮內(nèi)膜波形蛋白的表達，維持子宮內(nèi)膜細胞骨架的完整性[20]。經(jīng)PRP宮腔灌注后大鼠宮腔內(nèi)膜表面呈波浪型，可見腺體及小動脈增生。子宮內(nèi)膜損傷導(dǎo)致腺上皮生長不良、子宮血流阻力高、血管生成不良，而PRP可促進子宮內(nèi)膜損傷后子宮內(nèi)膜腺體及血管的恢復(fù)，減少子宮內(nèi)膜損傷后纖維化相關(guān)因子的表達，抑制子宮內(nèi)膜纖維化的形成[22]。

(三)PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的臨床研究進展

Chang等[23]在2015年最先開展宮腔灌注PRP治療薄型子宮內(nèi)膜的研究，納入5例既往子宮內(nèi)膜反應(yīng)差、應(yīng)用HRT周期后子宮內(nèi)膜厚度仍<7 mm的患者，于HRT周期的第10日進行PRP宮腔灌注，若72 h后子宮內(nèi)膜厚度仍<7 mm則進行第2次灌注。結(jié)果5名患者子宮內(nèi)膜厚度均增加，最終4名患者正常妊娠，1名因胚胎染色體異常流產(chǎn)。該研究為PRP改善薄型子宮內(nèi)膜厚度方向的研究拉開了帷幕，也用實踐第一次證明了PRP宮腔灌注體內(nèi)試驗的安全性。

有研究者比較了PRP和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)宮腔灌注對內(nèi)膜薄且反復(fù)種植失敗(RIF)人群凍融胚胎移植(FET)周期妊娠結(jié)局影響，發(fā)現(xiàn)兩種方法在胚胎植入率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率和流產(chǎn)率方面無顯著差異，改善作用相似[24]，但該研究樣本量較小，仍有待高質(zhì)量的隨機對照研究驗證。另有研究在以上基礎(chǔ)上增加了生理鹽水宮腔灌注組，結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，PRP及G-CSF宮腔灌注均促進薄型子宮內(nèi)膜厚度增加及血流改善，但三者之間胚胎種植率、臨床妊娠率及早期流產(chǎn)率均未見明顯差異[25]。目前也有研究關(guān)注PRP宮腔灌注治療RIF人群的效果，認為宮腔自體PRP輸注是一種安全、廉價的優(yōu)化子宮內(nèi)膜的輔助治療，特別是對于有RIF病史的患者。因此RIF或頑固性薄型子宮內(nèi)膜患者是PRP宮腔灌注的重點適用人群。目前大部分的臨床研究得出積極結(jié)論，即宮腔灌注PRP能改善薄型子宮內(nèi)膜人群的妊娠結(jié)局。成慧等[26]設(shè)計的前瞻性研究顯示，F(xiàn)ET周期中子宮內(nèi)膜對HRT反應(yīng)不良(周期第13天時子宮內(nèi)膜厚度<7 mm)的女性，在FET周期的第13天將1 ml PRP注入子宮腔，如48 h后子宮內(nèi)膜厚度未能增加，則在同一周期中重復(fù)PRP灌注；對照組僅接受HRT。與未進行宮腔灌注PRP的對照組相比，PRP組的子宮內(nèi)膜厚度顯著增加 [(8.76±0.65) mm vs.(8.04±0.41) mm，P=0.001]，胚胎植入率(21.0% vs. 9.37%)和臨床妊娠率(40.5% vs. 20.0%)也顯著增高。另一項前瞻性隊列研究[27]結(jié)果表明，在HRT周期第10天和黃體酮給藥日分別經(jīng)宮腔導(dǎo)管注入PRP，能有效改善子宮內(nèi)膜厚度[(7.65±0.22) mm vs.(6.52±0.31) mm]、提高臨床妊娠率(44.12% vs. 20%)和胚胎植入率(27.94% vs. 11.67%)、降低周期取消率(19.05% vs. 41.18%)，以上結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義。此兩項研究代表了目前主流的PRP宮腔灌注時機，雖然PRP宮腔灌注的時機稍有差異，但均間隔2～5 d予PRP宮腔灌注，且均得出子宮內(nèi)膜增厚、臨床妊娠率提高的結(jié)論。另一項納入83例患者的前瞻性研究認為PRP組的胚胎植入率和單周期臨床妊娠率均顯著高于對照組[28]。齊改梅等[29]的回顧性研究也得出相似的結(jié)論。關(guān)于PRP宮腔灌注的時機、重復(fù)PRP宮腔灌注是否優(yōu)于單次灌注、2次PRP宮腔灌注最佳時間間隔等問題，仍有待進一步的研究加以闡明并進行驗證。

Coksuer等[30]回顧性研究觀察到，34例內(nèi)膜形態(tài)不良的RIF患者給予PRP宮腔灌注治療，內(nèi)膜厚度增加(10 mm vs. 6.25 mm，P<0.001)；與36例內(nèi)膜形態(tài)良好不需PRP宮腔灌注的患者相比，臨床妊娠率(35.2% vs. 22.2%)和活產(chǎn)率(41.2% vs. 16.7%)均顯著提高(P<0.05)，而兩組間FET后的自然流產(chǎn)率和異位妊娠率相似。此項研究中PRP宮腔灌注不僅彌補了子宮內(nèi)膜厚度的差異，提高了臨床妊娠率，甚至還提高了活產(chǎn)率，可能與血小板中釋放的多種細胞因子協(xié)同作用提高了子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)?；町a(chǎn)率的提高是最終體現(xiàn)治療有效性的指標，目前尚缺乏PRP宮腔灌注治療薄型子宮內(nèi)膜對活產(chǎn)率影響的研究。

三、未來展望

綜上所述，盡管宮腔灌注PRP改善薄型子宮內(nèi)膜厚度以及改善臨床妊娠結(jié)局方面取得了一定的療效，但依舊存在很多的問題。例如PRP的制備標準、注射劑量、評價指標仍存在很大差異，尚無一致標準。標準化的PRP制備方案對于未來的研究中重現(xiàn)一致和準確的結(jié)果至關(guān)重要。此外，基礎(chǔ)研究證明了PRP在修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的作用機制且發(fā)現(xiàn)作用效果與PRP的劑量濃度有關(guān)，但PRP在宮腔中作用的半衰期尚無文獻說明。臨床中部分患者進行一次宮腔灌注后子宮內(nèi)膜厚度改善仍不理想者需第二次宮腔灌注，其中兩次灌注的時間間隔對于子宮內(nèi)膜厚度的影響仍有待闡明。因此研究PRP的濃度梯度、宮腔灌注的次數(shù)與時間間隔對薄型子宮內(nèi)膜的影響有利于完善PRP宮腔灌注的臨床應(yīng)用。目前大部分的臨床研究樣本較小，某些對照變量未控制，且隨訪時間短，僅獲取臨床妊娠率，未隨訪活產(chǎn)率，因此對母兒最終妊娠結(jié)局的有效性、安全性及不良影響缺乏有力證據(jù)，最終導(dǎo)致臨床研究的證據(jù)級別較低。因此高質(zhì)量、設(shè)計完善的隨機對照研究、體外試驗研究仍有待進一步補充完善，為臨床應(yīng)用PRP宮腔灌注治療頑固性薄型子宮內(nèi)膜提供更高質(zhì)量的證據(jù)。