王志宇，丁飛楊，葛佳一，鄧 奕，胡 磊，王 慧

（皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

脂滴是細(xì)胞中儲(chǔ)存脂肪的細(xì)胞器，參與細(xì)胞代謝、膜的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞活動(dòng)，與神經(jīng)退行癥、糖尿病、癌癥、脂肪肝等疾病息息相關(guān)。脂滴與多種細(xì)胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、過氧化物酶體等）之間存在相互作用，脂滴的功能失調(diào)會(huì)引起多種連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，但其中的作用機(jī)制尚不明確[1-2]。為了研究脂滴的功能，熒光成像是當(dāng)前最有力的技術(shù)。目前，尼羅紅和各種基于BODIPY的探針（BODIPY 493/503）已商業(yè)化，是研究脂滴熒光成像最常用的工具。但這2種探針各有一定的不足，比如尼羅紅選擇性低，信噪比低，在脂滴染色的同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其他膜結(jié)構(gòu)也會(huì)被染色；BODIPY 493/503斯托克斯位移小，背景干擾大，這些局限性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成一定的誤差[3-4]。因此，開發(fā)具有高選擇性和高信噪比的靶向脂滴的熒光探針仍具有挑戰(zhàn)性。

基于此，本文以三苯胺和4-吡啶甲醛作為構(gòu)筑單元，設(shè)計(jì)合成了一種靶向脂滴的化合物L(fēng)(合成路線見圖1)，在分子中引入了具有較好的脂溶性和較強(qiáng)給電子能力的三苯胺官能團(tuán)。結(jié)合紫外可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜和理論計(jì)算，系統(tǒng)研究了化合物L(fēng)的光學(xué)性質(zhì)，探索了化合物L(fēng)在細(xì)胞中的靶向部位及其在監(jiān)測脂滴數(shù)量變化方面的潛力。

圖1 化合物L(fēng)的合成路線圖Figure 1 Synthetic route of compound L

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Finnigan LCQ 型質(zhì)譜儀，美國賽默飛公司；UV-5900 PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；HITACHI F-4600 型熒光分光光度計(jì)（測試參數(shù)：激發(fā)波長410 nm，狹縫寬度均為10 nm，電壓500 V），日本日立有限公司；Leica TCS SP8 共聚焦顯微鏡，德國徠卡公司；Bruker Avance 400 型核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)），德國Bruker公司。

試劑：對(duì)硝基苯乙腈、三苯胺、4-吡啶甲醛、二甲基甲酰胺（DMF）、三氯氧磷（POCl3）、二氯亞錫、苯、乙醇、四氫呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈等試劑均為化學(xué)純或分析純，購自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 化合物L(fēng)的合成

中間體M 的合成見參考文獻(xiàn)[5]。在50 mL 圓底燒瓶中加入化合物M（0.38 g，1 mmol），用30 mL 無水乙醇使其完全溶解，然后分別加入4-吡啶甲醛（0.14 g，1.3 mmol）和2滴冰乙酸，回流反應(yīng)12 h后，析出橙紅色固體，趁熱抽濾，粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶，得橘紅色固體產(chǎn)物L(fēng)（0.32 g），產(chǎn)率為67%。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO): δ 8.80～8.72 (m, 3H), 7.96 (s, 1H), 7.88～7.86 (m, 4H), 7.81 (d,J= 8.6 Hz, 2H), 7.48 (d,J= 8.4 Hz, 2H),7.41～7.37(m, 4 H), 7.22～7.13 (m, 6H), 6.97 (d,J= 8.8 Hz, 2H)。13C NMR (101 MHz,d6-DMSO): δ 159.67,151.12,150.46,149.44,146.02,141.76,131.51,130.78,129.85,129.80,126.36,125.57,125.10,124.66,122.23,122.09,119.99。ESI-MS:477.2063([M+1]+)。

1.3 化合物L(fēng)的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜測定

為了研究化合物L(fēng)的光物理性質(zhì)，選取6種極性不同的溶劑1,4-二氧六環(huán)（DOA）、四氫呋喃（THF）、乙酸乙酯（EA）、乙醇（EtOH）、乙腈（ACN）和磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.40），探究了化合物L(fēng)的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。首先將化合物L(fēng) 配成濃度為10-3mol/L 的母液，溶劑為二甲基亞砜。用移液槍移取50μL的母液置于5 mL的容量瓶中，分別用6種溶劑定容至5 mL，用于其紫外可見吸收光譜和熒光光譜的測定。熒光光譜的測試條件：激發(fā)波長為410 nm，狹縫寬度均為5 nm，電壓為500 V。

1.4 化合物L(fēng)對(duì)脂質(zhì)體的熒光響應(yīng)測定

1.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

利用MTT 法[7]對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估，分別將5、10、15、20、25、30μmol/L 的化合物L(fēng) 與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，測定細(xì)胞存活率。

1.6 脂滴特異性成像

用化合物L(fēng)孵育HepG2細(xì)胞30min，用PBS緩沖溶液洗滌3遍后直接用于激光共聚焦顯微成像。

1.7 細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量變化監(jiān)測

以Hela細(xì)胞為模型，用100μmol/L油酸處理HeLa細(xì)胞6 h后，除去皿中的培養(yǎng)基，隨后加入新鮮的含有10μμmol/L化合物L(fēng)的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育細(xì)胞30 min，然后進(jìn)行激光共聚焦成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物L(fēng)在不同溶劑中的光物理性質(zhì)

圖2(A)為化合物L(fēng)在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜。如圖2(A)所示，隨著溶劑極性的增加，化合物L(fēng)的吸收峰位置沒有發(fā)生明顯的變化（PBS除外），且其最大吸收波長在400 nm左右。運(yùn)用含時(shí)密度泛函理論（TD-DFT/B3LYP，6-31G*基組）對(duì)化合物L(fēng)的躍遷過程進(jìn)行理論計(jì)算，結(jié)構(gòu)優(yōu)化及TD-DFT計(jì)算均采用高斯09程序進(jìn)行。由圖3可知，理論計(jì)算出化合物L(fēng)的最大吸收峰在403 nm左右，是HOMO-1到LUMO的躍遷，其中HOMO-1軌道的電子云主要集中在三苯胺和對(duì)硝基苯乙腈基團(tuán)上，LUMO軌道的電子云主要集中在對(duì)硝基苯乙腈和4-吡啶甲醛基團(tuán)上，可歸屬于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）躍遷。理論計(jì)算得出的最大吸收峰與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，為解釋化合物L(fēng)的紫外可見吸收光譜提供了有力的證據(jù)。

圖2 化合物L(fēng)在不同極性溶劑中的紫外可見吸收光譜（A）和熒光光譜（B）（濃度為10 μmol/L）Figure 2 UV-vis absorption(A)and fluorescence emission(B)spectra of compound L in different polar solvents(c=10 μmol/L)

圖2（B）為化合物L(fēng)在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜。根據(jù)圖2(B)可知，隨著溶劑極性的增大，化合物L(fēng)的熒光光譜發(fā)生紅移，熒光發(fā)射峰從490 nm（DOA）紅移至527 nm（PBS），其最大發(fā)射波長紅移了37 nm，表明化合物L(fēng) 的激發(fā)態(tài)可能存在扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移。而且化合物L(fēng) 的熒光強(qiáng)度大小受溶劑的極性影響，在極性較弱的溶劑DOA中熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，在極性較強(qiáng)的溶劑PBS 中熒光強(qiáng)度較弱，其在DOA 中的熒光強(qiáng)度是在PBS 中的熒光強(qiáng)度的25.8 倍，這種現(xiàn)象可能是由于化合物在極性溶劑中能級(jí)下降，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)與基態(tài)間能級(jí)差縮小，從而引起非輻射躍遷增大，說明化合物L(fēng)符合溶致動(dòng)力學(xué)效應(yīng)[8-9]。

2.2 化合物L(fēng)對(duì)脂質(zhì)體的熒光響應(yīng)

化合物L(fēng) 對(duì)脂質(zhì)體的熒光響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4 可知，當(dāng)脂質(zhì)體和O/W 乳劑加入到化合物L(fēng) 的PBS緩沖溶液中后，化合物L(fēng)的熒光強(qiáng)度分別增強(qiáng)了93倍和10倍，而其它分析物的加入并沒有引起化合物L(fēng)的熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯的變化，說明化合物L(fēng)與脂質(zhì)體和O/W乳劑之間的相互作用可增強(qiáng)化合物L(fēng)在PBS溶液中的熒光強(qiáng)度。這種現(xiàn)象可解釋為脂質(zhì)體和O/W乳劑均有類似于囊泡的結(jié)構(gòu)，由于化合物L(fēng)具有較好的親脂性，當(dāng)向化合物L(fēng)的PBS溶液中加入脂質(zhì)體和O/W乳劑后，化合物L(fēng)中的親脂基團(tuán)三苯胺使其更傾向于滲入到脂質(zhì)體和O/W乳劑中的封閉囊泡結(jié)構(gòu)中，分子中單鍵的旋轉(zhuǎn)受到限制，最終導(dǎo)致其熒光增強(qiáng)。此結(jié)果表明化合物L(fēng)具有靶向細(xì)胞內(nèi)脂滴的潛力。

圖4 化合物L(fēng)與各種不同的分析物相互作用前后的熒光光譜Figure 4 Fluorescence spectra of compound L before and after interaction with various analytes

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性是生物學(xué)應(yīng)用的一個(gè)重要參數(shù)。化合物L(fēng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在5～30μmol/L的濃度下，化合物L(fēng)與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞存活率均在80%以上，這說明化合物L(fēng)的細(xì)胞毒性低，生物相容性好，可用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

圖5 化合物L(fēng)與HepG2細(xì)胞作用24 h后的細(xì)胞存活率圖Figure 5 Cell viability of HepG2 cells incubated with compound L for 24 h

2.4 脂滴特異性成像研究

化合物L(fēng)的脂滴特異性成像研究如圖6所示。從圖6中可以看出，化合物L(fēng)能夠穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞中展現(xiàn)出顆粒狀的亮點(diǎn)，結(jié)合前面的性質(zhì)分析，猜測化合物L(fēng)可能靶向于細(xì)胞內(nèi)的脂滴部位。為了進(jìn)一步驗(yàn)證化合物L(fēng)靶向細(xì)胞的部位，選擇脂滴商業(yè)染料BODIPY493/503與化合物L(fēng)進(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)。從圖7中可以看出，商業(yè)染料BODIPY493/503和化合物L(fēng)的重疊程度較高，計(jì)算得出二者的皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.90，說明化合物L(fēng)能夠靶向在細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)部位。

圖6 化合物L(fēng)與HepG2細(xì)胞給共培養(yǎng)30 min后的激光共聚焦成像圖Figure 6 Confocal images of HepG2 cells incubated with compound L for 30 min

圖7 (A)化合物L(fēng) 與BODIPY493/503在HepG2細(xì)胞中的共定位實(shí)驗(yàn)；(B)化合物L(fēng) 與BODIPY493/503的3D成像圖Figure 7 (A)Colocalization experiments of HepG2 cells incubated with compound L and BODIPY 493/503;(B)The 3D viewer of HepG2 cells incubated with compound L and BODIPY 493/503

2.5 細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量變化監(jiān)測

在證明化合物L(fēng)能特異性靶向脂滴后，進(jìn)一步評(píng)估了化合物L(fēng)對(duì)脂滴數(shù)量的監(jiān)測能力。作為細(xì)胞中儲(chǔ)存脂質(zhì)的細(xì)胞器，脂滴與脂質(zhì)聚集相關(guān)的常見疾病例如脂肪肝、肝癌、肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[10]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，油酸可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生脂滴。圖8為油酸刺激細(xì)胞前后化合物L(fēng) 與細(xì)胞共培養(yǎng)后的激光共聚焦成像。如圖8所示，未用油酸刺激的細(xì)胞中脂滴含量較少，用油酸刺激細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量明顯增加，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，化合物L(fēng)可用于監(jiān)測脂滴的數(shù)量變化，在分析脂滴相關(guān)的疾病方面具有巨大潛力。

圖8 油酸刺激細(xì)胞前后化合物L(fēng)與細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞顯影圖Figure 8 Cell images of HepG2 cells treated with or without oleic acid after incubation with compound L

3 結(jié)論

本文合成了一種基于三苯胺衍生物的脂滴特異性靶向的化合物L(fēng)，結(jié)合理論計(jì)算，系統(tǒng)研究了化合物L(fēng)的光學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，隨著溶劑極性的增加，化合物L(fēng)的最大吸收峰位置未發(fā)生明顯的變化（PBS除外），但熒光峰卻發(fā)生了明顯的紅移且伴隨著熒光強(qiáng)度降低。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明，化合物L(fēng)具有較高的細(xì)胞存活率，能特異性靶向在細(xì)胞內(nèi)的脂滴部位，并可用于監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量變化。此研究結(jié)果為后期開發(fā)具有較好生物相容性和光學(xué)性質(zhì)的脂滴熒光化合物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。