謝碩崟，翟昌林，王海波

(1浙江中醫(yī)藥大學·浙江 杭州 310053；2嘉興市第一醫(yī)院·浙江 嘉興 314001)

近年來，隨著我國經(jīng)濟水平提升，人民膳食結構發(fā)生了改變，并且伴隨人口老齡化程度的加重，各類心血管疾病的發(fā)病率和致死率持續(xù)增長[1]。心血管疾病的發(fā)生與心肌細胞凋亡具有密切的聯(lián)系，其中細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)是導致細胞氧化應激損傷的主導因子[2],冠心病無論是慢性穩(wěn)定型心絞痛或是心肌梗死以及冠脈開通過程中的缺血再灌注損傷均會導致心肌細胞產(chǎn)生大量的ROS[3]；因此，探究發(fā)現(xiàn)抑制心肌細胞凋亡及氧化應激損傷的特異性藥物一直是臨床研究的重點。桑黃，味苦，性寒，歸肝、腎經(jīng)，《本草綱目》記載其能“利五臟，宣腸胃氣，排毒氣”，被列為“上藥”。桑黃素，又名桑色素，類黃酮類物質，是桑黃中的主要有效成分之一，既往研究表明桑黃素具有抑制內皮細胞炎癥反應、降血脂等作用[4-6]。本研究觀察了桑黃素對于心肌過氧化損傷的保護作用及其與凋亡相關通路的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 桑黃素：MACKLIN公司，貨號：C13876704；桑黃素溶液的配制：使用分析天平稱取桑黃素4.0 mg，加入500 μL DMSO溶液，徹底溶解后加入4.5 mL完全培養(yǎng)基，使用0.22 μm孔徑的過濾器過濾除菌，母液濃度為2.5 mmol/L，根據(jù)前期預實驗結果，選擇加入細胞中的終濃度為25 μmol/L。H9C2心肌細胞：上海中喬新舟生物科技有限公司。低糖DMEM培養(yǎng)基：Hyclone公司；胎牛血清：Gibco公司；CCK8試劑盒：Elabscience公司，貨號：E-CK-A362；ROS試劑盒：南京建成公司，貨號：E004-1-1；Western blot抗體：Affinity公司，Bax(貨號：AF0120)、Bcl-2(貨號：AF6139)、Caspase-3(貨號：AF6311)、β-actin(貨號：AF7018)；H2O2：環(huán)凱微生物，批號：6108124。ELX800酶標儀：BIOTEK公司；LSR Fortessa流式細胞儀：美國BD；TZD-CL-200S顯影儀：廈門天中達生物科技；CKX41顯微鏡：奧林巴斯。

1.2 細胞培養(yǎng) H9C2心肌細胞培養(yǎng)于37 ℃，含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，使用低糖DMEM培養(yǎng)基添加10%的FBS，細胞生長至80%予以傳代。

1.3 細胞分組 H9C2心肌細胞傳代鋪板后分為3組。正常組(control組)：正常培養(yǎng)及同步換液處理；氧化損傷組(ODG組)：待實驗細胞生長密度達到70%時，加入H2O2,濃度設定為600 μmol/L,持續(xù)作用12 h；桑黃素組(Morin組)：在構建氧化損傷模型前，加入桑黃素25 μmol/L，持續(xù)作用12 h。

1.4 CCK8實驗 (1)消化對數(shù)生長期的H9C2心肌細胞，鋪96孔板，每孔鋪6 000個細胞，培養(yǎng)24 h；(2)3組細胞分別處理：其中正常組予以換液處理，氧化損傷組構建氧化損傷模型，桑黃素組使用桑黃素25 μmol/L預處理12 h后構建氧化損傷模型；(3)向每孔加入10 μL CCK8溶液；(4)使用酶標儀設定450 nm檢測波長，測定各組吸光度值；(5)計算細胞活力值。細胞活力值=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(正常組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5 流式細胞儀檢測心肌細胞ROS表達 細胞接種于6孔板，不同組別細胞經(jīng)過相應處理后，將DCFH-DA(10 μmol/L)加入到6孔板中，37 ℃孵育30 min，PBS清洗細胞3次，導入流式細胞儀進行細胞內測定ROS表達。

1.6 Western blot檢測各組心肌細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達 PBS潤洗3組細胞，放置于冰上，加入RIPA裂解液提蛋白，BCA法測蛋白濃度，調整濃度一致后以1∶2的比例加入3×loading buffer,95 ℃變性5 min，制分離膠和濃縮膠，進行蛋白電泳、轉膜，5%脫脂牛奶室溫搖床上封閉2 h，PBS潤洗后4 ℃搖床上孵育一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，孵育時長12 h，PBS潤洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，PBS潤洗后ECL化學顯影，QuantityOne軟件計算各組條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料首先予以正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞活性比較 見表1。

表1 各組心肌細胞活力值比較

2.2 各組心肌細胞內ROS表達量的比較 通過流式細胞儀檢測各組心肌細胞內ROS表達，與正常組相比，氧化損傷組與桑黃素組ROS表達量均明顯上升(均P<0.05)，與氧化損傷組相比，桑黃素預處理后，細胞內ROS表達量明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.3 各組心肌細胞凋亡相關蛋白表達的Western blot檢測結果 通過Western blot比較各組凋亡相關蛋白的表達，相較于正常組，氧化損傷組與桑黃素組促凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax的表達量均明顯上升(均P<0.05)，與氧化損傷組相比，桑黃素預處理后，Caspase-3、Bax的表達量明顯降低(均P<0.05)，抗凋亡相關蛋白Bcl-2表達量明顯上升(P<0.05);與此同時，氧化損傷組相較于正常對照組，抗凋亡相關蛋白Bcl-2表達量明顯下降(P<0.05)，桑黃素組相較于正常組，Bcl-2表達量的比較無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與氧化損傷組比較，#P<0.05圖1 各組心肌細胞內ROS流式細胞檢測及熒光強度比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與氧化損傷組比較，#P<0.05圖2 各組心肌細胞凋亡相關信號通路蛋白表達的Western blot檢測結果比較

3 討論

桑黃素屬于天然的五羥基黃酮的一種，廣泛分布于自然界之中，可提取自桑橙樹、黃桑木等桑科植物或多種中草藥[7]，同時也普遍存在于海藻、番石榴葉、洋蔥等植物中[8]。關于桑的用藥最早記載于《神農本草經(jīng)》，之后的本草中也均有收錄[7]。目前多種研究證實桑黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應激等多種活性[9-11]?；邳S酮類化合物多數(shù)具備抗氧化作用的特性，本研究重點從抗氧化應激及凋亡的角度探索了桑黃素對于心肌過氧化損傷的保護作用。

桑黃素通過抗氧化應激對多種器官發(fā)揮保護作用的研究已經(jīng)得到了廣泛驗證[9,12]，Pragna等[13]構建高糖誘導的鼠神經(jīng)損傷模型，發(fā)現(xiàn)桑黃素可調節(jié)Nrf2-NF通路平衡發(fā)揮保護作用，Lee等[14]發(fā)現(xiàn)桑黃素可抑制過氧化氫酶活化從而抑制倉鼠成纖維細胞的氧化損傷，Khalid S. AlNumair等[15-16]通過異丙腎上腺素構建了大鼠心梗模型，通過桑黃素預處理發(fā)現(xiàn)具有心肌細胞的保護作用，但缺乏機制方面的探索。本研究基于以上研究構建了大鼠H9C2心肌細胞的過氧化氫氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)桑黃素預處理可有效減輕心肌細胞的氧化損傷及凋亡，并進一步探討了各組心肌細胞內ROS的表達及凋亡相關通路蛋白的表達。

相關研究顯示：心肌損傷過程中會導致ROS爆發(fā)，ROS的表達過量會引起線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)大量開放，并且該過程不可逆[17],持續(xù)的缺血缺氧、氧化性損傷、鈣離子超載、磷酸鹽濃度增高均會導致線粒體去極化加重，導致MPTP一直處于開放狀態(tài)，導致分子量大于1.5 kd的物質輕易進入線粒體內膜，引起ATP耗竭、線粒體腫脹、離子平衡失調、最終心肌細胞致死[18-19]。MPTP開放的過程中Bcl-2家族蛋白也發(fā)揮了調控作用[20]，Bax作為促凋亡蛋白可與VDAC或ANT結合從而加劇MPTP的開放，而Bcl-2具有競爭性結合ANT的作用發(fā)揮抗凋亡作用[21]，同時，Bcl-2的表達提升具有抑制ROS生成的作用，阻斷下游Caspase級聯(lián)凋亡的活化，進一步發(fā)揮凋亡抑制作用[22]。本研究同時測定了Bax與Bcl-2的表達，結果發(fā)現(xiàn)桑黃素預處理在心肌過氧化損傷過程中可有效降低Bax的表達、提升Bcl-2的表達。

綜合上述，桑黃素可能通過調控凋亡相關通路抑制MPTP開放發(fā)揮對雙氧水致心肌細胞氧化損傷的保護作用。