陳 昊，賈修濱，司艷紅，李彩柳，張 穎

(山東第一醫(yī)科大學·山東 濟南 250117)

目前，非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)發(fā)病率和早期診斷率逐年上升，且呈低齡化趨勢，全球患病率約25%，已成為發(fā)病最為普遍的一種慢性肝臟疾病，是世界性的公共的衛(wèi)生問題[1]。NAFLD與肝損傷和代謝紊亂密切相關(guān)[2]，主要源于肝臟內(nèi)脂肪堆積與變性以及由此引發(fā)的氧化應激和炎癥反應，其中肝臟三酰甘油(TG)的含量增多是NAFLD的標志性特征[3]，而游離脂肪酸(FFA)的過度攝取，最終會導致肝臟TG 增多[4]。NAFLD主要通過改變飲食和生活方式、去除疾病誘因等基礎(chǔ)防治手段進行干預，臨床上仍缺乏特效藥物[5]。因此，NAFLD的新藥開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。

蛹蟲草又稱北蟲草、北冬蟲夏草、蛹草、蛹草菌、東北蟲草等[6]，蛹蟲草多糖(Cordyceps militaris polysaccharide, CMPS)是其主要活性成分，具有多種生物活性。課題組前期研究證實，CMPS可顯著降低細胞膽固醇(TC)水平[7]，促進CETP-tg小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport, RCT)，調(diào)控脂質(zhì)代謝[8]?；谏鲜鲅芯?，提示蛹蟲草多糖對肝臟脂質(zhì)具有調(diào)控作用。本實驗擬選用高脂高膽固醇誘導的肥胖型ob/ob小鼠作為動物模型，評價CMPS純品對脂質(zhì)代謝及肝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級8 周齡雄性ob/ob小鼠購于北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量(40±5)g，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0008。小鼠飼養(yǎng)于濕度50%～60%、溫度(22±1)℃環(huán)境中，12 h/12 h循環(huán)光照。動物實驗遵循山東第一醫(yī)科大學實驗動物道德倫理委員會有關(guān)規(guī)定。蛹蟲草購于泰安市岱珍生物科技有限公司，經(jīng)山東第一醫(yī)科大學藥學院蘇延友教授鑒定為蟲草屬(Cordycps)真菌蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.)Link]的子實體。常溫晾干，粉碎成粗粉(40目)，多糖的提取參照課題組以往方法[6]。非諾貝特購于索萊寶生物科技有限公司(純度≥99%)。小鼠高脂高膽固醇飼料訂制于北京華阜康生物科技有限公司。SOD、MDA、ALT、AST試劑盒：南京建成生物科技有限公司；TG、TC試劑盒：中生北控生物科技有限公司；FFAs試劑盒：朗頓，BPE20248。Hei-VAP Expert Control/Ultimate Control旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph；FD8508真空冷凍干燥機：韓國Ilshin；Varioskan LUX多功能酶標儀：Thermo Fisher；BX51倒置熒光顯微鏡：日本奧林帕斯；F6/10勻漿器：上海氟魯克；CUT4062石蠟切片機：德國萊卡。

1.2 動物分組、造模及給藥 雄性 ob/ob 小鼠40 只隨機分為模型組(Model)、非諾貝特組[20 mg/(kg·d)](Fenofibrate)及蛹蟲草多糖[25、50、100 mg/(kg·d)](Low,Middle,High)組，每組8只，均以高脂高膽固醇飼料(脂肪34.90%，膽固醇26.20%)飼養(yǎng)。藥物采用 3%羧甲基纖維素鈉溶解后，經(jīng)口灌胃給予相應劑量，模型組同時給予一定劑量 3%羧甲基纖維素鈉，連續(xù)用藥12 周后處死小鼠，進行相關(guān)指標檢測。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 小鼠一般情況記錄 記錄小鼠日食量、每周體質(zhì)量變化，用藥末處死小鼠，記錄肝臟重量，計算肝指數(shù)。

1.3.2 血脂檢測 末次給藥后，小鼠禁食12 h，內(nèi)眥取血，酶法檢測血清TC、TG、HDL-C水平，TC 減去 HDL-C即為Non-HDL-C 水平。

1.3.3 肝組織相關(guān)指標檢測 4 ℃條件下，稱取適量新鮮肝臟于PBS中勻漿，離心勻漿液(1 000 g)15 min，取上清液，BCA測定肝組織蛋白含量；賴氏法檢測肝組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)與谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力；分別采用WST-1法和TBA法檢測肝組織(SOD)活性和(MDA)含量；酶法測定上清液中TG、TC含量，ELISA方法檢測游離脂肪酸(FFAS)含量；另取部分新鮮肝臟10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片(5 μm)，HE染色后進行病理學檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學分析采用t檢驗，實驗結(jié)果采用平均數(shù)±標準差表示，P<0.05視為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇ob/ob小鼠日食量和體質(zhì)量的影響 各組小鼠平均日食量基本相同，與模型組相比，無顯著變化。前5周，各組體質(zhì)量差異不明顯。自第6～12周末，多糖高劑量組與非諾貝特組體質(zhì)量明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1～圖2。

圖1 各組ob/ob小鼠日食量變化

注：與模型組比較，*P<0.05圖2 各組ob/ob小鼠體質(zhì)量變化

2.2 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠血脂的影響 見表1。

表1 各組ob/ob小鼠血脂水平比較

2.3 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝臟指數(shù)及脂質(zhì)的影響

2.4 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，模型組肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，部分肝細胞甚至出現(xiàn)壞死。

表2 各組ob/ob小鼠肝臟指數(shù)和肝組織TC、TG、FFA水平比較

蛹蟲草多糖劑量依賴性地改善肝組織脂肪變性，高劑量多糖組肝組織中央靜脈和小葉結(jié)構(gòu)清晰可見。見圖3。

圖3 各組ob/ob小鼠肝組織病理變化(HE，×200)

2.5 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝組織氧化應激的影響 見表3。

表3 各組ob/ob小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的比較

2.6 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝功能的影響 見表4。

表4 各組ob/ob小鼠肝組織ALT、AST水平的比較

3 討論

NAFLD 被認為是代謝性疾病。2020年國際上將 NAFLD 更名為代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease, MAFLD)[9]。肝臟作為脂質(zhì)代謝的重要器官，主要負責脂肪酸的攝取、脂肪酸的合成以及脂肪酸向其他組織的輸出及重新分布[3]。肝臟脂肪變性是導致非酒精性脂肪肝的最主要因素，主要表現(xiàn)為肝臟 TG 增多[10-11]。而肝臟脂肪酸的攝取增多和氧化易導致肝臟 TG 異常增多和脂肪變性，在氧化應激和脂質(zhì)過氧化等作用下肝細胞最終發(fā)生損傷、炎癥、纖維化等病理改變[12]。因此，非酒精性脂肪肝的主要誘因之一就是肝細胞脂肪酸攝取增多導致的脂肪變性。

目前，臨床仍缺乏 NAFLD 的有效治療藥物，主要通過飲食、運動等生活方式調(diào)控和防治。我國地域遼闊，藥用植物資源豐富，部分天然藥物富含活性成分，在調(diào)控脂質(zhì)代謝和非酒精性脂肪肝方面功能顯著[13-16]。本實驗結(jié)果顯示，泰山蛹蟲草多糖可顯著抑制肝臟攝取FFA，降低肝組織TG 含量。另外，通過減少氧化物質(zhì)MDA含量和升高抗氧化物質(zhì)SOD活性抗氧化應激反應。因此，泰山蛹蟲草多糖可通過調(diào)控血脂代謝和氧化應激，改善高脂高膽固醇飲食誘導的脂質(zhì)蓄積和肝臟功能，降低NAFLD患病風險。今后將進一步明確其防治非酒精性脂肪肝的分子機制和作用靶點。