方 杰，吳葉琪，黃雪燕，王 睿

(1杭州醫(yī)學(xué)院，浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室·浙江 杭州 310013；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院·浙江 杭州 310007)

原發(fā)性肝細胞癌具有高發(fā)病率和高死亡率的特點[1]，我國是肝癌高發(fā)地區(qū)[2]，給社會帶來極高的危害和負擔(dān)。手術(shù)、放化療及靶向藥物是治療本病的三大支柱療法，但因肝癌發(fā)病隱匿，部分基層單位醫(yī)療和經(jīng)濟條件有限，缺少有效監(jiān)測手段，故多數(shù)患者在確診時已是中晚期階段[3]。如何有效提高中晚期肝癌病人的生存時間和質(zhì)量，是目前面臨的一個醫(yī)學(xué)難題。相較于腫瘤免疫治療的高昂費用[4]，我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)具有“簡驗效廉”的特色優(yōu)勢，尤其對于部分經(jīng)濟困難的家庭和基層單位，是患者實現(xiàn)“帶瘤生存”的補充替代手段。相關(guān)研究證據(jù)表明，電針療法在腫瘤并發(fā)癥和副作用的改善方面具有明確優(yōu)勢[5-7]，但對于其直接正向調(diào)控腫瘤生長的研究略顯薄弱[8-9]。因此，本研究基于microRNAs(miRNAs)測序技術(shù)，選擇操作標(biāo)準(zhǔn)易于量化的電針作為干預(yù)方法，嘗試發(fā)掘電針延緩HepG2肝細胞癌裸鼠荷瘤生長的效應(yīng)靶點，為后續(xù)探討針灸與腫瘤免疫抑制狀態(tài)的相關(guān)性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 4周齡健康SPF級BALB/c-nude小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g。由杭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心負責(zé)調(diào)劑，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(浙)2019-0002；于該單位屏障室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，動物使用許可證號SYXK(浙)2019-0011。室內(nèi)溫度(24±2)℃，濕度40%～60%，自由飲水，明暗時間各12 h。熒光素酶(Luciferase, Luc)標(biāo)記的人源肝癌細胞株HepG2-Luc購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基：Hyclone公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：Sigma公司；胎牛血清(FBS)： Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)：北京中科邁晨科技有限公司；胰酶消化液：Biosharp公司；異氟烷(R510-22)：深圳市瑞沃德生命科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：廣州市銳博生物科技有限公司；合成引物：廣州市銳博生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器 0.16 mm×7 mm面針(500PCS)：長春愛康醫(yī)療器械有限公司；SDZ-II華佗牌電針儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；ZH-XBQ小鼠固定器、IVIS Spectrum小動物活體成像儀：PerkinElmer公司；RC2嚙齒動物氣體麻醉機：VetEquip公司)；7500 Quantitative PCR(qPCR)儀：ABI公司；Veriti逆轉(zhuǎn)錄儀：ABI公司。

1.4 動物分組和模型制備 造模前予常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按裸鼠體質(zhì)量的順序進行排列，采用隨機數(shù)字法分為電針組(Electroacupuncture group, EG)和對照組(Control group, CG)，剪趾法編號，每組各10只。 HepG2-Luc細胞置于含10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)和傳代，使用RPMI1640培養(yǎng)液配制為2×107/mL細胞。于EG及CG組裸鼠右前肢腋窩下，接種濃度2×107/mL的HepG2-Luc細胞懸液0.2 mL(含有活細胞4×106)。接種細胞后每日定時觀察裸鼠細胞接種部位的成瘤情況，1周后使用小動物活體成像儀確認(rèn)裸鼠模型瘤塊形成情況。

1.5 干預(yù)措施 EG組：1)取穴參考《實驗針灸學(xué)》[10]選取雙側(cè)足三里及三陰交穴。2)操作：呼入式小動物麻醉機麻醉裸鼠5 min后，采用小鼠尾靜脈注射固定器配合雙下肢醫(yī)用膠布捆綁法固定裸鼠，使用15°斜刺法刺入上述穴位。電針儀頻率選擇2/100 Hz疏密波，電流強度從0.1 mA開始逐漸加強，根據(jù)裸鼠耐受情況，以身體開始扭動為度。CG組：使用相同方式進行呼入式氣體麻醉及固定，不予其它特殊處理。確認(rèn)造模成功起，各組每日干預(yù)1次，每次30 min，連續(xù)14 d。

1.6 荷瘤生長效應(yīng)檢測 于干預(yù)開始當(dāng)天至實驗結(jié)束次日，使用電子游標(biāo)卡尺測算EG及CG組裸鼠皮下荷瘤體積(V=ab2/2，a為荷瘤長徑，b為短徑)；在干預(yù)開始當(dāng)天、第5、8、13及結(jié)束次日，使用小動物成像系統(tǒng)采集兩組裸鼠皮下荷瘤的熒光值，以計算荷瘤變化趨勢。

1.7 樣本采集與保存 末次電針干預(yù)后次日處死裸鼠，在冰塊上快速分離荷瘤組織。放入PBS緩沖液將組織洗凈并用濾紙吸干，迅速將所取樣品放入RNA保存液中，并用干冰保存，立即轉(zhuǎn)至廣州銳博生物科技有限公司檢測。

1.8 總RNA提取與RNA-seq高通量測序 Trizol法提取組織總RNA，利用Qubit?2.0和Agilent 2200 TapeStation對總RNA進行質(zhì)檢。利用NEBNext?Multiplex small RNA Library Prep Set for Illumina(NEB, USA)制備小RNA文庫，然后用HiSeq 2500(Illumina, USA)進行SE-50測序。miRNA的表達水平通過RPM(Reads Per Million)值進行標(biāo)準(zhǔn)化[PRM=(映射到miRNA的Reads數(shù)/Clean數(shù)據(jù)中的Reads數(shù))×106]。

1.9 miRNA差異基因篩選及qPCR驗證 以|log2(Fold Change)|≥1，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，采用edgeR算法計算兩組樣本間差異表達量，并利用R軟件中的gplots包對篩選出的差異miRNAs繪制熱圖。同時利用TargetScan、miRDB、miRTarBase和miRWalk預(yù)測差異表達miRNAs的靶基因，以進行GO及KEGG功能富集分析。最后使用qPCR驗證組間樣本差異表達的miRNAs。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠荷瘤生長延緩效應(yīng)比較 電針開始干預(yù)至實驗完成時荷瘤體積每日的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，圖1；小動物活體成像儀采集的成像數(shù)據(jù)顯示兩組裸鼠荷瘤變化趨勢，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，圖2。

圖1 兩組裸鼠荷瘤體積每日變化趨勢比較

圖2 兩組裸鼠荷瘤活體成像熒光值變化趨勢比較

2.2 兩組間表達差異的miRNAs及其靶基因生物信息學(xué)預(yù)測分析 (1)與CG組比較，EG組HepG2裸鼠皮下荷瘤組織差異表達miRNAs有24個，其中上調(diào)的有20個，下調(diào)的有4個；表達變化差異倍數(shù)大于5倍的有17個。(2)對24個miRNAs靶基因預(yù)測進行GO分析的結(jié)果顯示，參與分子功能(molecular function)的基因有9 929個，主要涉及細胞轉(zhuǎn)化(cellular process)等；參與細胞組成(Cellular Component)的基因有11 214個，主要涉及細胞成分(cell part)、細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(intracellular part)及膜結(jié)合相關(guān)的細胞器(membrane-bounded organelle)等；參與生物過程(Biological Process)的基因有5 697個，主要涉及蛋白結(jié)合(protein binding)等。(3)進行KEGG顯著富集通路分析的結(jié)果顯示，主要涉及的通路有30 個，相關(guān)性最強的前三位分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白代謝(Protein processing in endoplasmic reticulum)、胃酸分泌途徑(Gastric acid secretion)、軸突導(dǎo)向過程(Axon guidance)；靶基因聚集數(shù)量排名前三的依次為代謝通路(Metabolic pathways)、腫瘤相關(guān)通路(Pathways in cancer)及MAPK信號通路。見圖3 A/B。

2.3 miRNAs測序結(jié)果分析及qPCR驗證 根據(jù)組間miRNAs的表達量、差異倍數(shù)及查閱現(xiàn)有文獻等綜合方法，繼而選擇15個miRNAs進行qPCR驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)qPCR驗證僅miR-144-3p、miR-486-5p、miR-487b-3p及miR-451a表達水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖3 C/D。

表1 經(jīng)qPCR驗證的差異顯著miRNAs(EG vs.CG)

圖3 A.GO分析；B.KEGG分析；C.miRNAs測序結(jié)果分析熱圖；D.miRNAs組間qPCR驗證結(jié)果比較

3 討論

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌最常見的組織學(xué)類型，嚴(yán)重威脅人類健康，是目前全球面臨的一個重大醫(yī)學(xué)難題[11]。根據(jù)GLOBOCAN 2018年公布的癌癥數(shù)據(jù)，全球肝癌年新發(fā)病例約有84.1萬例，發(fā)病率4.7%，居惡性腫瘤第6 位；死亡病例78.1萬例，死亡率高達8.2%，僅次于肺癌位居世界第二[12]。我國每年約有46.6萬新增肝癌病例，約42.2萬人死于肝癌，占據(jù)全球肝癌死亡人數(shù)一半以上[13]。目前手術(shù)治療依然是早期肝癌獲得根治的主要途徑，而對于中晚期患者多選擇經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)、局部消融治療、系統(tǒng)性治療等各種非手術(shù)治療手段[1]。但大多數(shù)患者在確診時已是晚期或是發(fā)生了轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)根治的機會，且病情進展迅速，即使采用放化療和靶向藥物方案，因副作用大、耐藥性、易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等特點，患者預(yù)后仍不理想[14-15]。

中醫(yī)作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，是腫瘤防治重要的補充替代手段，在國內(nèi)具有極為廣泛的群眾基礎(chǔ)。其作用已不再局限于改善腫瘤兼癥，而是著眼于提高患者“帶瘤生存”能力，尤其是對于無法耐受常規(guī)治療手段的高齡及中晚期患者，可通過中藥內(nèi)服、針灸外治以調(diào)和陰陽、固護正氣，促使機體內(nèi)環(huán)境重新達到平衡狀態(tài)。其中，針灸結(jié)合經(jīng)絡(luò)腧穴的自身特性和針刺補瀉原則，起到補虛瀉實的作用，可以調(diào)整人體異常的臟腑功能，激活疏通經(jīng)氣。課題組選用的足三里和三陰交是經(jīng)典的表里經(jīng)配穴組合，本就是補益脾胃，滋養(yǎng)后天之本的要穴；足三里更是因其獨特的經(jīng)穴效應(yīng)，被用予研究穴位生物學(xué)機理的載體。與其他軟堅散結(jié)、祛濕滌痰或清熱解毒的腫瘤治法不同，針灸可以通過固護正氣，正向調(diào)控機體免疫功能，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境[16-17]，成為發(fā)揮延緩腫瘤生長趨勢效應(yīng)的有效手段。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過監(jiān)測干預(yù)期間皮下荷瘤體積變化情況，證實電針刺激對于延緩HepG2肝癌裸鼠荷瘤的生長趨勢具有一定的效應(yīng)，與課題組前期研究[18]及其他學(xué)者的報道結(jié)果相近[19-20]，部分針灸相關(guān)的臨床研究也間接佐證了其在延長腫瘤患者生存時間上的作用潛力[21-23]。但電針效應(yīng)的發(fā)揮是極為復(fù)雜的網(wǎng)狀調(diào)控關(guān)系，無法通過單一信號通路解釋，除了調(diào)控免疫抑制微環(huán)境外，還可能對腫瘤結(jié)構(gòu)和功能(血管新生)[8]、炎性反應(yīng)[9]及生物節(jié)律[24]等有影響。但電針以其“簡便、安全、經(jīng)濟、操作可標(biāo)準(zhǔn)化”等獨特優(yōu)勢，作為協(xié)同療法或基層適宜技術(shù)輔助推廣，具有重要的生命力。

通過開展電針組和模型組荷瘤組織miRNAs測序分析及qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)4個miRNAs組間表達具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，為開展進一步細胞實驗驗證奠定了基礎(chǔ)。同時，GO分析及KEGG分析結(jié)果，也將電針緩瘤效應(yīng)的生物學(xué)靶點聚焦到了參與細胞組成的蛋白代謝和腫瘤炎癥相關(guān)通路，系統(tǒng)綜合雙方結(jié)果為后續(xù)尋找靶基因提供了重要參考。通過挖掘電針調(diào)控miRNAs的上下游機制，成功挖掘電針延緩HepG2肝癌裸鼠荷瘤生長趨勢的生物學(xué)效應(yīng)原理，是能否在臨床發(fā)揮針灸控瘤，提高患者“帶瘤生存”能力的前提條件之一，亦是課題組后續(xù)重要的研究方向。