劉皓 ，許秋彤 ，王春生 ，荊紅梅

( 1. 中國科學(xué)院深?？茖W(xué)與工程研究所 中國科學(xué)院深海極端環(huán)境模擬重點實驗室，海南 三亞 572000；2. 自然資源部第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3. 中國科學(xué)院三亞海洋科學(xué)綜合（聯(lián)合）實驗室，海南 三亞 572000；4. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（珠海），廣東 珠海 519082；5. 海南省熱帶海洋生物技術(shù)重點實驗室，海南 三亞 572000；6. 中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301)

1 引言

海洋沉積物覆蓋約2/3的地球表面，含有豐富多樣的微生物類群。在沉積物表層，氧氣被快速消耗，隨著海洋深度的增加，絕大部分沉積物處于厭氧環(huán)境[1]。海洋沉積物中的有機(jī)質(zhì)厭氧氧化的終產(chǎn)物甲烷，主要是由微生物驅(qū)動的甲烷循環(huán)代謝過程產(chǎn)生[2]。甲烷所引起的溫室效應(yīng)是等摩爾的二氧化碳的34倍，貢獻(xiàn)了全球變暖的20%[3]，因此海洋沉積物中甲烷的代謝過程對全球氣候變化起著重要的作用。

海洋沉積物中直接參與甲烷代謝的微生物包括產(chǎn)甲烷菌（Methanogens）和厭氧型甲烷氧化菌（Anaerobic Methanotrophs, ANME）。產(chǎn)甲烷菌是形態(tài)結(jié)構(gòu)各異但生理功能非常相近且極端厭氧的一類古菌的總稱，屬于古菌域（Archaea）中的廣古菌門（Euryarchaeota）[4]，廣泛分布于各類氧化還原電位很低的厭氧環(huán)境中。目前已知的主要產(chǎn)甲烷途徑包括：乙酸鹽裂解產(chǎn)甲烷途徑、氫氣還原二氧化碳產(chǎn)甲烷途徑和甲基化合物產(chǎn)甲烷途徑。厭氧型甲烷氧化菌屬于廣古菌門，能夠在厭氧的環(huán)境中將甲烷氧化成二氧化碳。ANME在冷泉、泥火山和麻坑等甲烷富集沉積物中大量存在[5-8]，也存在于熱液噴口的煙囪和巖石的厭氧層[9]。向上的甲烷流體的流速和沉積物中微生物的豐度是影響微生物甲烷氧化（Anaerobic Oxidation of Methane, AOM）過程的主要因素，甲烷流體的流速過快，微生物就不能充分氧化甲烷；微生物含量較低的沉積物，氧化甲烷的效率就較低[10]。海洋沉積物所賦存的環(huán)境條件特殊且十分復(fù)雜，具有溫度、甲烷濃度、氧濃度、微量金屬元素等多種環(huán)境因子差異。這些環(huán)境因子變量不僅影響著甲烷氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)和活性，而且還將進(jìn)一步影響AOM過程[11-13]。

近年來，多采用物種或功能特異的標(biāo)識記基因調(diào)查環(huán)境中甲烷氧化微生物的多樣性。16S rRNA基因是微生物生態(tài)學(xué)研究中最常用的標(biāo)記基因[8,14-15]，但對產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的特異性不高[3,16]。目前，甲烷代謝保守功能基因mcrA是研究甲烷代謝菌的主要功能基因[17]，其編碼甲基輔酶M還原酶并存在于所有已知的產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌中[18-19]。迄今，以16S rRNA基因和mcrA基因相結(jié)合來探究甲烷代謝古菌群落的多樣性和組成與基因豐度已被廣泛應(yīng)用于不同海洋生境，包括加利福尼亞灣瓜伊馬斯盆地?zé)嵋簠^(qū)[20]、南海北部陸坡[21]和大西洋邊緣冷泉區(qū)[22]等區(qū)域。然而，大多數(shù)海洋甲烷代謝微生物類群的生態(tài)學(xué)研究都局限于單一海域，所以本研究通過mcrA基因的高通量測序分析，結(jié)合熒光實時定量PCR技術(shù)，對典型性大洋（大西洋、印度洋和太平洋）表層沉積物樣品中甲烷代謝古菌群落的組成多樣性與基因豐度進(jìn)行了研究，以探究甲烷代謝古菌的生態(tài)分布特征。

2 材料和方法

2.1 樣品采集

沉積物樣品涵蓋大西洋、印度洋和太平洋三大海區(qū)（共計20個樣品，圖1）：包括南大西洋中脊樣品（A1-A9站位）；西北印度洋脊樣品（I10-I14站位）；太平洋樣品包含了馬里亞納海溝（P15-P17站位）和南海北部（P18-P20站位）兩個區(qū)域。樣品所處海區(qū)深度范圍為1 015～7 015 m（表1）。除馬里亞納海溝樣品（P15-P17，柱狀樣）由“蛟龍”號利用Push-Core采集外，其余樣品均為由抓斗或箱式取樣器采集的沉積物表層樣品。樣品采集后于-80℃保存。

圖1 各大洋采樣站位分布Fig. 1 Distribution of sampling stations in different oceans

2.2 DNA 提取、mcrA基因的PCR擴(kuò)增與測序

稱取0.5 g沉積物樣品，采用PowerSoil? DNA Isolation Kit（MOBIO, USA）試劑盒對表1中20個沉積物樣品提取環(huán)境總DNA。提取操作步驟參照廠家說明書，提取后的DNA保存于-20℃。mcrA基因使用引物mcrA-F（5′-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-3′）和mcrA-R（5′-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3′）擴(kuò)增[16]。擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系：2 μL 10×Buffer，2 μL MgCl2（50 mmoL/L），1.5 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1.5 μLmcrA-F (10 μmol/L)，1.5 μLmcrAR (10 μmol/L)，0.3 μL Taq DNA Polymerase （Invitrogen,USA），2 μL模板DNA，補(bǔ)超純水至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性45 s，53～52℃退火45 s，72℃延伸1 min，35～40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后，利用PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit（Invitrogen, 美國）進(jìn)行純化。以等摩爾濃度的擴(kuò)增子構(gòu)建擴(kuò)增子庫，并使用454高通量測序儀GS Junior（Roche,Switzerland）進(jìn)行測序。在本研究所用的20個樣品中，I12和P19因擴(kuò)增mcrA基因片段目的條帶太弱未能達(dá)到建庫要求，因此只對剩余18份樣品進(jìn)行了高通量測序。

表1 沉積物樣品的采樣環(huán)境參數(shù)Table 1 Sampling parameters in different ocean sediments

2.3 實時熒光定量PCR

通過實時熒光定量PCR儀（qPCR，ABI 7500 Fast，USA）對樣本中古菌16S rRNA和甲烷代謝古菌的mcrA基因的豐度進(jìn)行實時定量。古菌16S rRNA基因的引物為344F（5′-ACGGGGCGCAGCAGGCGCGA-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）[16]，反 應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，45個循環(huán)。mcrA基因的引物為mcrA-F（5′-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-3′）和mcrA-R（5′-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3′）[16]，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火30 s，40個循環(huán)。qPCR采用20 μL反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green Premix，0.2 μL ROXⅡ，1 μL前端引物 (10 μmol/L)，1 μL后端引物(10 μmol/L)，1 μL模板DNA，補(bǔ)超純水至20 μL。

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 序列和多樣性指數(shù)分析

通過Roche GS Junior獲得的mcrA基因原始序列利用mothur軟件[23]（http://www.mothur.org/）分析處理序列數(shù)據(jù)。通過去除低質(zhì)量、長度不正確和含有模糊堿基讀數(shù)的序列后，進(jìn)行去噪處理；并與美國生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）數(shù)據(jù)庫中mcrA基因參考序列比對后，移出非mcrA基因序列，最終用97%作為Cutoff值，經(jīng)過分析后得到分類操作單元（Operational Taxonomic Unit, OTU）表格。利用PAST[24]進(jìn)行均勻度指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)（兩者均為α多樣性指數(shù)）分析，用單因素方差分析（One-way ANOVA）來比較大洋沉積物甲烷代謝古菌多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)間的差異性，p＜0.05代表具有顯著差異。將每個站位處于同一分類歸屬的OTU合并匯總，得到各站位甲烷代謝古菌種類與相對豐度。將本研究產(chǎn)生的mcrA基因序列的代表序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，并獲得序列號（PRJNA-846686）。

2.4.2mcrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

用mothur軟件按97%相似度Cutoff值得到的豐度最高的30個OTU進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，這前30個OTU的序列豐度占到了所有樣品中序列的98%以上。將前30個OTU的代表序列上傳至NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行Blast比對，挑選比對結(jié)果中序列同源度最高的mcrA基因序列片段，用Mega 7[25]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹?；跇?gòu)建的進(jìn)化樹，確定前30個OTU的進(jìn)化地位歸屬。OTU1-OTU30是本研究所獲得的大洋沉積物序列，其余序列為NCBI數(shù)據(jù)庫下載的參考序列。采用Kimura2-parameter+Gamma Distributed (K2+G)模型和Maximum Likelihood算法建樹，bootstrap值為1 000。

3 結(jié)果

3.1 各大洋沉積物甲烷代謝古菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)

均勻度指數(shù)顯示，太平洋在所有海區(qū)中多樣性指數(shù)最低；大西洋多樣性指數(shù)跨度最大，大西洋和印度洋的α多樣性指數(shù)顯著高于太平洋（p＜0.05）（圖2）。多樣性指數(shù)趨勢與均勻度指數(shù)趨勢相似，太平洋在所有海區(qū)中最低；大西洋多樣性指數(shù)跨度最大，大西洋和印度洋的α多樣性指數(shù)顯著高于太平洋（p＜0.05）。

圖2 大洋沉積物甲烷代謝古菌群落的α多樣性指數(shù)Fig. 2 α-diversity index of the methane metabolic microbes in different ocean sediments

甲烷微菌目是本研究所發(fā)現(xiàn)的占比最高的類群，其次是甲烷八疊球菌目，甲烷桿菌目僅在馬里亞納海溝P16樣品中被發(fā)現(xiàn)，僅包含一個屬—甲烷短桿菌屬，相對豐度為0.21%（圖3）。各海區(qū)在群落結(jié)構(gòu)上不具有顯著差異。

圖3 大洋沉積物樣品中甲烷代謝古菌的群落結(jié)構(gòu)Fig. 3 Community structure of methane metabolic archaea in different ocean sediments

甲烷微菌目在所有樣品中具有絕對優(yōu)勢（A3除外，55.97%），平均豐度達(dá)到85%以上。各海區(qū)間甲烷微菌目相對豐度存在差異。大西洋海區(qū)平均相對豐度較低（92.10%），不同站位間差異性較大（55.97%～99.98%）。印度洋海區(qū)具有95.25%的相對豐度，各站位間差異較小。太平洋兩個海區(qū)平均相對豐度最高（馬里亞納海溝98.55%；南海北部99.93%），最低的P16也有95.61%的相對豐度。本研究中甲烷微菌目由甲烷繩菌屬（Methanoline）、產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium）和一個未知類群構(gòu)成。分析顯示，該未知類群隸屬于甲烷微菌目，但與其他甲烷微菌目所屬分類單元關(guān)系較遠(yuǎn)。因其在本研究所獲大洋沉積物樣品中的廣泛分布，暫命名為Oceanic Sediments Dominant group（OSD group）。OSD group作為所有大洋沉積物樣品中的最大類群，相對豐度在55.97%～100%之間，其中P15所獲全部序列均由OSD group構(gòu)成。甲烷繩菌屬僅在印度洋（I10、I14），馬里亞納海溝（P16、P17）有極少量發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)甲烷菌屬僅在大西洋（A2、A8），印度洋（I11、I13、I14）和馬里亞納海溝（P16）有少量被發(fā)現(xiàn)，相對豐度均小于0.5%（圖3）。

甲烷八疊球菌目占比第二高，各大洋沉積物中均有發(fā)現(xiàn)（P15除外）。大西洋海區(qū)的平均相對豐度最高，但不同站位間差異性很大。印度洋海區(qū)次之，除I10號站位（1.12%）較低外，其余站位相對豐度較平均（6.73%～8.59%）。太平洋兩海區(qū)的平均相對豐度最低。唯一未檢測到甲烷八疊球菌目的站位就隸屬于太平洋海區(qū)。馬里亞納海溝最高有4.17%的相對豐度，南海北部最高豐度僅0.07%。本研究中甲烷八疊球菌目共發(fā)現(xiàn)3個屬，其中甲烷擬球菌屬（Methanococcoides）占優(yōu)勢。除A6（68.95%）、I11（89.15%）外，在其他站位甲烷擬球菌屬在甲烷八疊球菌目中的占比達(dá)90%以上（圖3）。甲烷葉菌屬（Methanolobus）僅在大西洋和印度洋的部分站位中被發(fā)現(xiàn)，最高相對豐度僅1.04%（A6）。唯一被發(fā)現(xiàn)的厭氧甲烷氧化菌ANME-3類群的相對豐度則更低，僅在A1、A9和I13站位樣品中被發(fā)現(xiàn)。其在印度洋相對豐度最高，但也僅有0.46%，大西洋相對豐度均低于0.1%（圖3b）。

3.2 各大洋沉積物甲烷代謝古菌進(jìn)化地位及系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，占比最高的前30個OTU分屬于甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）和甲烷桿菌目（Methanobacteriales）（圖4）。僅有OTU15隸屬于甲烷桿菌目的甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）。甲烷八疊球菌目則有3個屬被檢測到：OTU10、OTU12、OTU19、OTU23隸屬于甲烷葉菌屬；OTU3、OTU6、OTU13、OTU18、OTU20、OTU24、OTU25、OTU30隸屬于甲烷擬球菌屬。甲烷微菌目包含的OTU數(shù)目最多，共16個，分屬2個屬和1個分類地位不明晰的類群。OTU14屬于甲烷繩菌屬；OTU26、OTU29隸屬于產(chǎn)甲烷菌屬。其余13個OTU屬于一個進(jìn)化地位不明晰的類群。這13個OUT聚為一類，其置信度高達(dá)95%（圖4），但是沒有任何已知序列與該類群有超過90%的相似度。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該類群隸屬于甲烷微菌目，與產(chǎn)甲烷菌屬分支關(guān)系較近。該類群與產(chǎn)甲烷菌屬歸為一個大支的置信度僅有36%?，F(xiàn)有研究尚不能對該類群做出明確的進(jìn)化地位界定。

圖4 基于甲烷代謝古菌mcrA基因核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 The phylogenetic tree based on nucleic acid sequence of mcrA gene of methane metabolizing archaea

3.3 大洋甲烷代謝古菌的豐度

大洋沉積物樣品中古菌16S rRNA基因豐度（濕重，下同）范圍為1.38×106～3.07×107copies/g，基因平均豐度為8.81×106copies/g。其中，大西洋古菌16S rRNA基因平均豐度為3.30×106copies/g，低于印度洋（1.37×107copies/g）和太平洋（1.30×107copies/g）。馬里亞納海溝沉積物樣品中古菌16S rRNA基因平均豐度（3.32×106copies/g）低于南海北部（2.26×107copies/g），且隨著沉積物深度增加呈降低趨勢。所有樣品中，南海北部（P20）的古菌16S rRNA基因豐度最高，而馬里亞納海溝（P17，底層）豐度最低（圖5）。

圖5 大洋沉積物中的古菌16S rRNA和甲烷代謝古菌mcrA基因的豐度分布Fig. 5 Distribution of abundance of the archaeal 16S rRNA gene and methane metabolic mcrA gene in different marine sediments

大洋沉積物中mcrA基因豐度范圍是1.32×103～1.03×105copies/g，平均豐度為1.04×104copies/g。各大洋之間，大西洋平均豐度最高（1.95×104copies/g），太平洋次之（6.30×103copies/g），印度洋最低（6.16×103copies/g），印度洋與太平洋無顯著性差異。其中，大西洋各站位豐度具有明顯差異，A1顯著高于其他站位（p＜0.01），因此大西洋是mcrA基因豐度跨度最大的海區(qū)。太平洋各站位之間基因豐度差異性相對較小，馬里亞納海溝略高于南海北部海區(qū)。馬里亞納海溝沉積物樣品由淺及深的基因豐度呈先降后升的趨勢（圖5）。

4 討論

4.1 甲烷代謝古菌的群落組成

α多樣性指數(shù)顯示，太平洋在所有海區(qū)中最低；大西洋多樣性指數(shù)跨度最大，這可能是由于樣品所采集的平均深度所導(dǎo)致。在太平洋的平均采樣深度（4 914 m）遠(yuǎn)高于大西洋（2 705 m）和印度洋（3 136 m），水深越深，到達(dá)沉積物表層可被微生物利用的有機(jī)物越少，從而導(dǎo)致群落多樣性減少。這一趨勢進(jìn)一步證實了深度是影響微生物多樣性的主要因素之一[26]。同時由于有機(jī)物通量的減少而導(dǎo)致電子受體（氧、硝酸鹽等）消耗速度變慢，使得能夠高效利用這些受體的特定甲烷代謝古菌群落在大洋沉積物中占優(yōu)勢?？傮w而言，所有沉積物樣品的均勻度指數(shù)最高值為0.35，這表明甲烷代謝古菌不同類群的空間分布差異較大，可能存在著某個或某幾個占據(jù)大洋沉積物絕對優(yōu)勢的甲烷代謝古菌類群。

本研究中產(chǎn)甲烷菌的甲烷微菌目在大洋表層沉積物中占有絕對優(yōu)勢，平均豐度達(dá)到95%以上。已有研究表明產(chǎn)甲烷菌在太平洋東岸以甲烷擬球菌屬的Methanococcoides burtonii和Methanococcoides alaskense為主[27-28]，在西岸以甲烷微菌目和甲烷八疊球菌目為主[29-30]；南海南部陸坡表層沉積物以甲烷桿菌目為主[31]。這表明了多樣的產(chǎn)甲烷菌和潛在的甲烷產(chǎn)生途徑廣泛存在于深海沉積物中[32]，該生境相對于熱液、冷泉和近岸河口更不易受到到環(huán)境因素（如溫度、鹽度和pH等）的影響，導(dǎo)致大約有10%的有機(jī)物被產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)化成CH4[33]。此外，不同大洋沉積物中的甲烷代謝古菌群落結(jié)構(gòu)單一。這可能是因為大洋沉積物不具有高甲烷底物的環(huán)境特征，且一般營養(yǎng)物質(zhì)偏低，使得適應(yīng)此種環(huán)境的甲烷代謝古菌的類群組成較為單一。因而與有大量甲烷氣體溢出的冷泉區(qū)中的類群存在明顯不同，形成了源自生境條件的群落差異。

4.2 大洋沉積物古菌的基因豐度

本研究結(jié)果表明，大洋沉積物樣品中古菌16S rRNA基因平均豐度相較于北冰洋（格陵蘭島東岸）、北大西洋、地中海[34]和南海地區(qū)（海馬冷泉、西沙海槽、F冷泉）的表層沉積物[35]低1～2個數(shù)量級。這可能是因為本研究中的樣品采集自寡營養(yǎng)的大洋沉積物，且深度較深所造成的。此外，本研究中馬里亞納海溝的沉積物柱狀樣中古菌的基因豐度與采樣深度呈負(fù)相關(guān)，這與小笠原海溝（位于馬里亞納海溝北部）的研究結(jié)果趨勢相一致[36]，進(jìn)一步證明了有機(jī)物分布的差異可以影響古菌16S rRNA基因豐度分布。

大洋沉積物中檢測到的mcrA基因豐度顯著低于南海槽冷泉區(qū)[37]、海馬冷泉區(qū)[13]、日本海冷泉區(qū)[38]和沖繩熱液區(qū)[39]。這可能是因為冷泉區(qū)和熱液區(qū)具有包含甲烷在內(nèi)的大量氣體不斷涌出，為周邊甲烷代謝古菌提供碳源與能源，促進(jìn)了mcrA基因豐度的顯著增高。

4.3 OSD group在大洋沉積物的分布及近緣類群

OSD group是本研究發(fā)現(xiàn)的一種相對豐度占優(yōu)勢的甲烷代謝古菌類群。與NCBI數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果顯示，其序列與目前已發(fā)表的序列最高相似度都低于90%。NCBI數(shù)據(jù)庫中與OSD group相似度較高的序列，除已獲得基因組全序列的CP002117來源于近海油田外，其余8個所處的生境均為厭氧環(huán)境。CP002117源自人工培養(yǎng)的甲烷盤菌屬菌株（Methanoplanus petroleariustype strain）（SEBR 4847T）[40]。該菌株嚴(yán)格厭氧，屬于CO2/[H]型產(chǎn)甲烷菌，其原始生境與本研究中的大西洋站位處于同一緯度，距離較近。

本研究顯示，OSD group可能廣泛分布于大洋沉積物中，在所有樣品中其相對豐度均過半。甲烷代謝古菌中單個類群具有如此高占比的現(xiàn)象在冷泉沉積物表層中已被報道過[13]，其獨特的生境條件造就了如此單一的群落結(jié)構(gòu)。但大洋沉積物并不具備類似冷泉的條件，因此現(xiàn)有研究還不能找到解釋此現(xiàn)象的有力證據(jù)，該類群在大洋沉積物生境中的生態(tài)功能還需進(jìn)一步探究。

5 結(jié)論

（1）因大洋沉積物具有寡營養(yǎng)特征，特別是甲烷底物偏低，其深海表層沉積物中廣泛存在結(jié)構(gòu)單一的甲烷代謝古菌群落，以及豐度顯著低于其他海洋生境的古菌和甲烷代謝古菌。

（2）甲烷微菌目是大洋表層沉積物中的主要甲烷代謝古菌類群，其中以一簇未知類群（OSD group）占優(yōu)勢；該簇與已知序列均不具有較近親緣關(guān)系，進(jìn)化地位尚不明晰，還需要進(jìn)一步研究。