劉順利,梁萌萌,劉大英,何 偉,王慶金

(1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,河北 滄州 061001;2.滄州師范學(xué)院,河北 滄州 061001)

過(guò)敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)又稱變應(yīng)性鼻炎，是主要由IgE介導(dǎo)的介質(zhì)釋放、并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜變應(yīng)性疾病，其因過(guò)敏源不同分為季節(jié)性AR(多為塵螨、脫屑)和常年性AR(多為花粉)，以陣發(fā)性噴嚏、清涕、鼻塞、鼻癢為主要臨床表現(xiàn)，其病程長(zhǎng)、易反復(fù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前，AR的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但一般認(rèn)為與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/T輔助細(xì)胞17(Treg/Th17)免疫失衡、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3]。Treg、Th17均由 CD4 T細(xì)胞分化形成，Treg具有免疫抑制作用，可維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，可分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和白介素-10(IL-10)；Th17可招募局部炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子(如IL-17)，誘導(dǎo)鼻部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織炎性損傷[4-5]。因此，本病治療過(guò)程中如何調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、降低細(xì)胞因子水平以及緩解癥狀至關(guān)重要。目前西醫(yī)治療AR以藥物(糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、白三烯受體拮抗劑)、免疫、手術(shù)治療，上述療法可緩解患者癥狀，但是遠(yuǎn)期療效不理想，且復(fù)發(fā)率高[6]。中醫(yī)認(rèn)為AR主要為肺氣虛弱、衛(wèi)表不固所致，風(fēng)寒犯肺、上通鼻竅、邪正相搏、肺氣不通、津液停聚、鼻竅壅塞而發(fā)為噴嚏、流涕等癥，治療當(dāng)以補(bǔ)肺固表、宣肺通竅為基本原則。黃芪具有益氣固表的作用，黃芪多糖為其有效成分，可顯著增強(qiáng)非特異性免疫功能和體液免疫功能。本研究通過(guò)建立AR大鼠模型，觀察大鼠行為學(xué)改變，ELISA法檢測(cè)血清免疫指標(biāo)的改變，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞的分布，探討其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：5～6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(200±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2021-0011，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±1)℃，光照12 h，避光12 h，大鼠自由進(jìn)食、水，定期更換墊料。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：黃芪購(gòu)自河北康博藥業(yè)有限公司；氯雷他定購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；卵白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；大鼠IgE、IL-10、IL-17 ELISA試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物；水合氯醛購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鋁購(gòu)自美國(guó)International Laboratory公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：HT-300型電子天平(成都倍賽克儀表研究所);BS224S電子分析天平 (德國(guó)Sartorius公司);離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);HH-S2S型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；NovoCyte流式細(xì)胞儀 (美國(guó)艾森生物)；正置白光拍照顯微鏡Nikon(Japan)；掃描瀏覽軟件3DHISTECH(Hungary)；全景切片掃描儀3DHISTECH(Hungary)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AR大鼠模型的建立：以卵白蛋白10 mg、氫氧化鋁粉10 mg及0.9%氯化鈉溶液1 ml混合后腹腔注射，隔日1次，連續(xù)7次，作為基礎(chǔ)致敏。第15天起進(jìn)行加強(qiáng)免疫，給予5%卵白蛋白50 μl滴鼻和1%卵蛋白噴霧吸入10 min(3 ml/min)，每日1次，連續(xù)9 d。

1.2.2 黃芪多糖的提取方法：取適量黃芪粉碎，過(guò)篩后取100 g粗粉+800 ml水煎煮3次，將水煎液合并，濃縮為200 ml后，加入95%乙醇800 ml，4 ℃過(guò)夜，3000 r/min離心5 min，用水溶解沉淀，定容為200 ml，得黃芪多糖。

1.2.3 分組和給藥：將50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、氯雷他定組(0.90 mg/kg)、黃芪多糖低劑量組(800 mg/kg)、黃芪多糖高劑量組(1600 mg/kg)，每組10只。各藥物組每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，同期空白組和模型組予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃對(duì)照。造模結(jié)束股動(dòng)脈抽取血液進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 行為學(xué)癥狀積分：激發(fā)后60 min評(píng)估大鼠癥狀積分(總分0～9分)。鼻癢：輕擦幾次鼻子1分，一直撓鼻面3分，兩者之間2分；噴嚏：1～3個(gè)1分，4～10個(gè)2分，11個(gè)及以上3分；流涕：流涕至鼻前孔1分，超出鼻前孔2分，流涕滿面3分。癥狀積分≥5分為造模成功[7]。

1.3.2 HE染色：將麻醉的大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，取出新鮮鼻黏膜組織，樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，最后鏡檢。

1.3.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定Treg、Th17占CD4+T細(xì)胞百分比：自股動(dòng)脈取全血2 ml，2 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。在每個(gè)流式上樣管中加入100 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為1×106個(gè)，按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記表面抗原(0.25 μl CD4抗體、1 μl CD25抗體)，用于冷的Buffer或預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，漩渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1 ml的固定液，并在此漩渦混勻，避光4 ℃孵育30～60 min，加入2 ml Buffer工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液，避光4 ℃孵育30～60 min，加入稀釋好的2%的正常大鼠血清100 μl，避光4 ℃孵育15 min，加入稀釋好的熒光標(biāo)記抗體，避光4℃孵育至少30 min，加入2 ml Buffer工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液，重復(fù)洗滌，上機(jī)檢測(cè)，并計(jì)算Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

1.3.4 血清IgE、IL-10、IL-17含量：采集大鼠血液并離心3000 r/min離心15 min，每孔加入200 μl封閉液，37 ℃孵育1～2 h，小心揭掉封板膜，放入洗板機(jī)，洗滌3～5遍。加適當(dāng)稀釋的待檢樣品100 μl于上述已包被的反應(yīng)孔中。用封板膜封板后置37 ℃孵育1～2 h，小心揭掉封板膜，放入洗板機(jī)，洗滌3～5遍。于各孔中加稀釋好的生物素化抗體工作液100 μl，用封板膜封板后置37 ℃孵育1 h，小心揭掉封板膜，放入洗板機(jī)，洗滌3～5遍。也可以手動(dòng)洗板：棄去液體，每孔加入300 μl洗液，浸泡1～2 min，在吸水紙上拍干，重復(fù)3～5遍。于各孔中加稀釋好的酶結(jié)合物工作液100 μl，用封板膜封板后置37 ℃避光孵育30 min，小心揭掉封板膜，放入洗板機(jī)，洗滌3～5遍。于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37 ℃避光反應(yīng)10～30 min，直到倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯的顏色梯度為止，于各反應(yīng)孔中加入2 mmol/L硫酸100 μl，顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，10 min內(nèi)，在酶標(biāo)儀上，于450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)積分評(píng)定 見(jiàn)表1。造模前各組大鼠行為學(xué)積分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后，與空白組比較，其余四組在造模后行為學(xué)積分均明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明AR模型造模成功。治療后，各給藥組與同期模型組比較，行為學(xué)積分均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪多糖低、高劑量組治療效果優(yōu)于氯雷他定組(P<0.05)，黃芪多糖高劑量組優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。

表1 各組大鼠治療前后行為學(xué)積分比較(分)

2.2 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果(圖1)顯示：空白組大鼠鼻黏膜組織無(wú)明顯變化,上皮細(xì)胞完整無(wú)破壞。模型大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞部分脫落，細(xì)胞核被淺染，固有層增厚，細(xì)胞間質(zhì)表現(xiàn)為充血和水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。氯雷他定組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組鼻黏膜組織上皮組織較為完整,有少量的炎性浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠鼻黏膜病理表理(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠血清IgE、IL-10、IL-17含量比較 見(jiàn)表2。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的IgE、IL-17水平升高，IL-10含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，與模型組比較，各給藥組IgE、IL-17含量降低，IL-10含量升高(P<0.05)，黃芪多糖高劑量組治療效果優(yōu)于其他兩組 (P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IgE、IL-10、IL-17含量比較

2.4 各組大鼠全血Treg、Th17細(xì)胞比例比較 見(jiàn)表3。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的Treg降低、Th17升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，與模型組比較，各給藥組Treg升高、Th17降低(P<0.05)，黃芪多糖高劑量組治療效果均優(yōu)于其他兩組 (P<0.05)。

表3 各組大鼠全血Treg、Th17細(xì)胞比例比較(%)

3 討 論

目前，臨床上治療AR多為西常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用中藥治療，中藥復(fù)方、單味中藥、中藥內(nèi)服或外用提取物均取得了不俗的療效，例如玉屏風(fēng)散、桑菊飲、黃芪、蒼耳子等，上述藥物和療法均可有效緩解患者鼻塞、噴嚏、流涕等癥狀[8]。AR的發(fā)病與多重因素相關(guān)，機(jī)體免疫失衡與其密切相關(guān)，其中Th17/Treg失衡在其發(fā)病發(fā)揮重要作用[9]。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞均為人體免疫的重要組成部分，Th17細(xì)胞是可分泌IL-17、IL-22的T細(xì)胞亞群，并可招募炎性細(xì)胞(尤其中性粒細(xì)胞)；Treg細(xì)胞是抑制T細(xì)胞的亞群，起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，可分泌IL-10和TGF-β等，下調(diào)效應(yīng)T細(xì)胞等多種細(xì)胞功能，二者功能大致相反[10]。正常情況下，兩種細(xì)胞維持一定動(dòng)態(tài)平衡從而穩(wěn)固機(jī)體免疫，病理狀態(tài)下，其可促進(jìn)組織損傷、自身免疫病理?yè)p傷或自身免疫性疾病[11]。IL-17是一種具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞功能的前炎性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子，Th17 細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生大量的IL-17，招募中性粒細(xì)胞和誘導(dǎo)趨化因子CXCL8(IL-8)的產(chǎn)生，促使氣道黏液腺分泌大量黏液，增加氣道的高反應(yīng)性，從而在多種氣道變態(tài)反應(yīng)疾病中氣道重塑的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[12]。 IL-10可抑制炎癥因子合成和抑制嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞釋放組胺、白三烯等物質(zhì)，減輕炎癥反應(yīng)[13]。IgE是AR最重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，當(dāng)患者接觸變應(yīng)原后，機(jī)體輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)活化并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，激活B細(xì)胞形成變應(yīng)原特異性IgE，且IgE又與其受體相互交聯(lián)，釋放組胺、緩激肽等炎性介質(zhì)，促使炎細(xì)胞因子和嗜酸性粒細(xì)胞異常表達(dá)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，黃芪多糖低、高劑量組療效均優(yōu)于氯雷他定組。

中醫(yī)認(rèn)為氣虛弱、衛(wèi)表不固、風(fēng)寒乘虛而入為AR的基本病機(jī)，《證治要訣》說(shuō)：“清涕者，腦冷肺寒所致?！敝委熽P(guān)鍵為補(bǔ)肺固表、宣肺通竅。本研究使用的黃芪多糖為黃芪提取物，黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功，《本草匯言》云：“補(bǔ)肺健脾、實(shí)衛(wèi)斂汗、驅(qū)風(fēng)運(yùn)毒之藥也”，《雷公炮制藥性解》云：“味甘，性微溫，無(wú)毒，入肺、脾二經(jīng)，內(nèi)托已潰瘡瘍，生肌收口，外固表虛盜汗，腠理充盈”?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃芪含有多糖、黃酮類、三萜類等多種有效成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和代謝、保護(hù)神經(jīng)和心腦血管系統(tǒng)的作用[16]。黃芪多糖為黃芪的有效成分之一，同樣具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)免疫的功效，且已有研究顯示，黃芪多糖可緩解AR大鼠癥狀和病理改變，從而逆轉(zhuǎn)鼻部黏膜組織的重塑[17]。一項(xiàng)大鼠實(shí)驗(yàn)表明，黃芪甲苷通過(guò)抑制高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4/核因子κB通路降低IL-4、IL-6等多種炎癥因子水平[18]。研究表明，黃芪多糖可改善AR豚鼠模型的癥狀、病理改變，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th17/Treg水平，以及相關(guān)細(xì)胞因子牛叉頭型基因P3和維甲酸相關(guān)孤核受體γt(RORγt)的表達(dá)相關(guān)[19-20]。本研究模擬臨床中、西醫(yī)治療方案，探究了氯雷他定組、黃芪多糖低和高劑量組對(duì)AR模型大鼠的治療作用，結(jié)果顯示黃芪多糖能夠有效緩解大鼠癥狀，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)大鼠Th17/Treg平衡、改善炎癥因子表達(dá)相關(guān)。本研究論證了黃芪多糖對(duì)AR大鼠的治療作用以及其對(duì)機(jī)體免疫和炎癥細(xì)胞表達(dá)的干預(yù)調(diào)控，但對(duì)其免疫和炎癥上下游分子機(jī)制仍不明確，仍需進(jìn)一步設(shè)計(jì)相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具體機(jī)制，為黃芪多糖治療AR的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。