曲 濤, 陳 陽, 楊長軍, 劉其聳, 陳 惠, 何志勇, 王召君, 陳 潔, 曾茂茂*

(1. 江南大學(xué), 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無錫 214122; 2. 煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司, 山東 煙臺 264006)

卵巢早衰是婦科領(lǐng)域的常見病,通常伴隨著閉經(jīng)、雌激素不足、促性腺激素水平升高和不孕癥。中醫(yī)認(rèn)為,腎為先天之本,經(jīng)水的正常與否與腎密切相關(guān),腎的盛衰之變化決定了月經(jīng)能否正常潮至,而肝臟與腎的聯(lián)系密切,李中梓在《醫(yī)宗必讀》中指出肝腎本為同源,“補(bǔ)腎即補(bǔ)肝”[1],因此存在從肝論治卵巢早衰的觀點(diǎn)[2]。西醫(yī)認(rèn)為,卵巢早衰的病因廣泛,可能由染色體缺陷等遺傳性因素、化療等醫(yī)源性因素以及環(huán)境因素等影響造成。肝臟可在碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和微量元素代謝中發(fā)揮重要作用,因此卵巢早衰伴有肝臟功能和代謝層面的改變不足為奇。[3],此外Yomna[4]在其研究中更是證實(shí)了慢性膽汁淤積這一肝病會導(dǎo)致雌性大鼠性腺功能減退和卵巢早衰。

環(huán)磷酰胺是常用的化療藥物和免疫抑制藥物之一,但其使用過程中對女性卵巢的毒性反應(yīng)強(qiáng),易引起卵巢損傷和早衰。實(shí)驗(yàn)表明,環(huán)磷酰胺處理后大鼠的卵巢萎縮,卵泡數(shù)減少,雌激素水平下降,促卵泡素升高,與臨床卵巢早衰患者血清學(xué)表現(xiàn)一致,可為卵巢功能損傷的發(fā)病機(jī)制及藥物保護(hù)機(jī)制的探索提供有效的動物模型[5]。環(huán)磷酰胺在體內(nèi)須經(jīng)過肝臟細(xì)胞色素P450酶代謝后才能發(fā)揮作用,但其代謝產(chǎn)物如丙烯醛[6]或超氧陰離子、過氧化氫等活性氧(reactive oxygen species, ROS)[7]會抑制肝臟的抗氧化防御機(jī)制,從而誘導(dǎo)肝損傷。

無論是出于通過從肝論治卵巢早衰[1],還是抑制環(huán)磷酰胺的肝損傷副作用[8],以往的研究中都有將天然抗氧化劑的攝入當(dāng)作重要的干預(yù)治療手段的報道。松花粉又稱松黃,是我國松科植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PinustabuliformisCarr.)及同屬種植物的雄性生殖細(xì)胞,主要營養(yǎng)成分包括蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等,是我國傳統(tǒng)藥食兩用的花粉品種[9]。最新研究顯示,松花粉中含有雌二醇(E2)、睪酮(T)及孕酮(P)3種性激素、赤霉素類植物激素[10]和多種結(jié)合態(tài)的酚類化合物[9]等多種天然活性物質(zhì),因而在抑制炎癥反應(yīng)[11]、調(diào)節(jié)免疫[12]、延緩睪丸組織衰老[13]和肝損傷保護(hù)[14]等方面都有一定的效果。因此,通過研究松花粉干預(yù)對卵巢早衰動物模型中肝臟代謝的影響對卵巢早衰及其干預(yù)的機(jī)制研究均有重要意義,但目前關(guān)于松花粉干預(yù)卵巢早衰伴隨肝臟表型改變的代謝組學(xué)研究尚未見報道。

代謝組學(xué)的任務(wù)在于研究機(jī)體應(yīng)對精神壓力和疾病等情況時所引起機(jī)體內(nèi)源性小分子代謝物的變化用于理解生物學(xué)機(jī)制,目前多通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振3種技術(shù)平臺實(shí)現(xiàn),因液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高,可分析不穩(wěn)定、不易衍生化和難揮發(fā)代謝物等優(yōu)點(diǎn)成為代謝組學(xué)研究中常用的分析平臺[15]。非靶向代謝組學(xué)不需要化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品,旨在無偏向性地檢測盡可能多的代謝物,通常具有卓越的代謝物覆蓋率以及簡單的方法開發(fā)過程,然而,它在化合物鑒定和量化方面表現(xiàn)不佳。靶向代謝組學(xué)使用化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品來關(guān)注有限的已知代謝物,表現(xiàn)出卓越的定量性能,但涉及復(fù)雜的方法開發(fā),并且具有較差的代謝物覆蓋率。廣泛靶向代謝組學(xué)又稱擬靶向代謝組學(xué),被認(rèn)為是第二代代謝組學(xué)方法,它融合了靶向和非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的采集策略,實(shí)現(xiàn)兼具高覆蓋度和高性能的定量分析[16],具有代謝物特征離子對覆蓋度廣、靈敏度高、穩(wěn)定性好等特征。

本文首先采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)雌性SD大鼠建立卵巢早衰模型,進(jìn)一步采用基于超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜 (UHPLC-MS/MS)的廣泛靶向代謝組學(xué)研究了不同劑量松花粉攝入對卵巢早衰大鼠肝臟代謝的干預(yù)情況,并以雌激素干預(yù)組作為陽性對照,結(jié)合單變量分析與多變量分析來確定環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢早衰模型時與正常組大鼠相比的肝臟差異代謝物,從而以此為參考確定雌激素和不同劑量松花粉對模型組大鼠肝臟代謝物的有效回調(diào)。將雌激素組和松花粉組共同的有效回調(diào)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析,并作為松花粉可以與雌激素發(fā)揮一致作用的干預(yù)機(jī)制。本研究對研究卵巢早衰的代謝機(jī)制及干預(yù)方法提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

選用浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司SPF級10周齡的雌性SD大鼠,飼養(yǎng)于江南大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn),審批號:JN. No20201030S1201203[272],所有動物實(shí)驗(yàn)操作符合江南大學(xué)動物管理與使用委員會的規(guī)定(SYXK 2012-0002)。

破壁松花粉,煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司;環(huán)磷酰胺一水合物,上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司;生理鹽水,四川科倫藥業(yè)股份有限公司;紅麗來結(jié)合雌激素片,新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司,批號為20200404;色譜純甲醇,德國Merck公司;內(nèi)標(biāo):肉堿C2∶0-d3、肉堿C8∶0-d3、肉堿C10∶0-d3、軟脂酸-16,16,16-d3、硬脂酸-18,18,18-d3、苯丙氨酸-d5、色氨酸-d5和鵝去氧膽酸-d4,美國Sigma-Aldrich公司。

SCIENTZ-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司); CentriVap真空離心濃縮儀(美國Labconco公司); Milli-Q超純水儀(美國默克公司); ExionLC AD型超高效快速液相色譜(美國AB SCIEX公司); Triple Quad 5500三重四極桿復(fù)合線性離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1動物造模及分組

SPF級健康雌性SD大鼠36只(10周齡,體重(250±20) g),飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中(無特定病原體,溫度22～24 ℃,濕度55%～70%, 12 h晝夜交替),飼養(yǎng)期間大鼠自由飲食飲水。經(jīng)過一周適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為6組,分別為空白對照組、環(huán)磷酰胺模型組、雌激素陽性對照組(0.075 g/kg)、松花粉低劑量組(0.1 g/kg)、松花粉中劑量組(0.5 g/kg)、松花粉高劑量組(1.5 g/kg)。除空白對照組外的30只大鼠,腹腔注射環(huán)磷酰胺(60 mg/kg)1天+環(huán)磷酰胺(10 mg/kg)14天,建立誘導(dǎo)性卵巢早衰模型。松花粉溶于生理鹽水中制成混懸液,采用灌胃方式給藥,陽性對照組灌胃結(jié)合雌激素溶液,空白對照組和環(huán)磷酰胺模型組大鼠則灌胃等體積的生理鹽水,給藥頻率為每天一次,共4周。

1.2.2代謝物的提取與分析

精密稱取肝臟組織樣本約50.0 mg于2 mL離心管中。精密加入5倍體積含有脂肪酸0.5 μg/mL C16∶0-d3和0.5 μg/mL C18∶0-d3,肉堿0.16 μg/mL C2∶0-d3、0.1 μg/mL C8∶0-d3和0.1 μg/mL C10∶0-d3,氨基酸3.61 μg/mL苯丙氨酸-d5和4.25 μg/mL色氨酸-d5, 含0.3 μg/mL鵝去氧膽酸-d4的75%甲醇溶液。向離心管中加入2粒鋼珠,在4 ℃條件下以66 Hz頻率研磨4 min。在4 ℃條件下以11 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。吸取全部上清液于新的2 mL離心管中,進(jìn)行凍干處理,待樣本凍干后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在進(jìn)行上機(jī)分析前,將凍干后的提取液樣本,用100 μL 20%甲醇水溶液復(fù)溶。將各組待分析的樣品取等體積上清液,混合,渦旋振蕩,制成質(zhì)控(quality control, QC)樣本。

正離子模式分析條件:Waters Acquity BEH C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),柱溫為50 ℃;流動相A為0.1%甲酸水溶液,B為 0.1%甲酸乙腈溶液;線性梯度程序:0～1 min,95%A;1～24 min,95%A～0A;24～28 min,0A;28～28.1 min,0A～95%A;28.1～30 min,95%A。流速0.35 mL/min。噴霧電壓設(shè)置為5.5 kV,碰撞電壓設(shè)置為15、30和45 V。掃描范圍設(shè)置為50～1 250 Da。

負(fù)離子模式分析條件:Waters Acquity HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),柱溫為55 ℃;流動相C為6.5 mmol/L NH4HCO3水溶液,D為6.5 mmol/L NH4HCO395%甲醇水溶液;線性梯度程序: 0～1 min,98%C;1～18 min,98%C～0C;18～22 min,0C；22～22.1 min,0C～98%C;22.1～25 min,98%C。流速0.35 mL/min。噴霧電壓設(shè)置為-4.5 kV,碰撞電壓設(shè)置為-15、-30和-45 V。掃描范圍設(shè)置為50～1 250 Da。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各分組均有6個生物學(xué)重復(fù)以篩選穩(wěn)定的差異代謝物。代謝物的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)在SCIEX OS軟件(美國AB SCIEX公司)上進(jìn)行處理,導(dǎo)出各組代謝物數(shù)據(jù)后使用MetaboAnalyst 5. 0 (https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)對各組樣本采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)、單變量分析和差異代謝物所涉及的代謝通路分析。

2 結(jié)果與討論

通過正負(fù)離子模式共檢測出687種物質(zhì),其中正離子模式檢測出371種,負(fù)離子模式檢測出316種。PCA通過不對樣品加以分組的情況下進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,反映了數(shù)據(jù)的原始狀態(tài),因此可以通過PCA分析觀察不同組間的差異。如圖1和圖2所示,QC樣本在PCA圖中聚集度高,表明本實(shí)驗(yàn)所用的儀器及數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性及重復(fù)性較好。

圖 1 正離子模式下大鼠肝臟代謝物的PCA得分圖及熱圖Fig. 1 Principal component analysis (PCA) score plot and heatmap of the differential metabolites in the positive model

正離子模式PCA得分圖顯示第一和第二主成分可以解釋原始數(shù)據(jù)集68.1%的特征,在第一主成分方向上可以發(fā)現(xiàn),盡管環(huán)磷酰胺模型組與空白對照組及其余組有部分交叉但分離趨勢明顯。聚類熱圖反映了代謝物的積累模式差異,結(jié)果顯示,樣本分組聚類一共分為了2大簇,環(huán)磷酰胺組與其余組別代謝物有明顯差異,不同的生物學(xué)重復(fù)之間也同樣聚成一簇,表明生物學(xué)重復(fù)之間良好的同質(zhì)性和數(shù)據(jù)的高可靠性。負(fù)離子模式PCA結(jié)果(見圖2)也顯示每組的6個樣本可以聚類在95%的置信區(qū)間內(nèi),說明各組樣本的特征相似,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。聚類熱圖中環(huán)磷酰胺組也基本聚成一簇?？偟膩碚f,聚類分析和主成分分析結(jié)果都可以表明本實(shí)驗(yàn)建模成功,環(huán)磷酰胺模型組的代謝物與其余組別的代謝物產(chǎn)生了明顯的差異,滿足探究松花粉干預(yù)卵巢早衰大鼠肝臟代謝的條件。

圖 2 負(fù)離子模式下大鼠肝臟代謝物的PCA得分圖及熱圖Fig. 2 PCA score plot and heatmap of the differential metabolites in the negative model

圖 3 正離子模式下各組的OPLS-DA得分圖、S-plot圖及火山圖Fig. 3 Orthogonal partial least squares-discrimination analysis (OPLS-DA) score plots, S-plots, and volcano maps for the various groups in the positive model Control: control group; Cyclophosphamide: model group; Estrogen: estrogen group; Pine pollen-L: low-dose pine pollen group; Pine pollen-M: medium-dose pine pollen group; Pine pollen-H: high-dose pine pollen group.

圖 4 負(fù)離子模式下各組的OPLS-DA得分圖、S-plot圖及火山圖Fig. 4 OPLS-DA score plots, S-plots, and volcano maps for the various groups in the negative model

為反映不同組別之間的差異關(guān)系,更好地對模型進(jìn)行解釋,進(jìn)一步采用OPLS-DA對空白對照組與環(huán)磷酰胺組,雌激素與環(huán)磷酰胺組,低、中、高松花粉組與環(huán)磷酰胺組之間進(jìn)行兩兩成對的分析并繪制得分圖。在OPLS-DA模型中,R2Y表示所建模型對Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預(yù)測能力。如圖3和圖4所示,不同分組樣本間在OPLS-DA圖上能夠完全分離,R2Y的范圍在0.755～0.946之間,Q2的范圍在0.578～0.911之間,可見OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠,模型的擬合度和預(yù)測能力較好,可以進(jìn)行下一步差異代謝物的尋找。為避免使用一類統(tǒng)計方法帶來的假陽性錯誤或模型過擬合,通過單變量分析中的t檢驗(yàn)(p<0.05)、變異倍數(shù)(FC>2或<0.5)和多變量分析中變量投影重要性(VIP值)>1相結(jié)合的方法確定差異代謝物。

如表1所示,與空白對照組相比,環(huán)磷酰胺模型組上調(diào)了32種差異代謝物,下調(diào)了28種差異代謝物。激素替代治療是為女性因卵巢功能衰退影響健康問題采用的臨床醫(yī)療措施,結(jié)合雌激素單獨(dú)[17]或配合其他藥物一起使用[18]在緩解雌激素缺乏和治療卵巢早衰方面具有不錯的臨床效果。實(shí)驗(yàn)中雌激素組與環(huán)磷酰胺模型組相比,上調(diào)了47種差異代謝物,下調(diào)了29種差異代謝物,與空白對照組相比,回調(diào)了34種差異代謝物。低濃度松花粉組與環(huán)磷酰胺模型組相比,上調(diào)了34種差異代謝物,下調(diào)了30種差異代謝物,回調(diào)了47種差異代謝物;中濃度松花粉組與環(huán)磷酰胺模型組相比,上調(diào)了32種差異代謝物,下調(diào)了37種差異代謝物,回調(diào)了38種差異代謝物;高濃度松花粉組與環(huán)磷酰胺模型組相比,上調(diào)了34種差異代謝物,下調(diào)了24種差異代謝物,回調(diào)了34種差異代謝物。空白對照組、雌激素組及松花粉干預(yù)組與環(huán)磷酰胺模型組的差異代謝物的韋恩圖如圖5所示,可以看出,相對結(jié)合雌激素的使用,松花粉可以在不造成更多代謝物改變的前提下,在回調(diào)環(huán)磷酰胺對肝臟代謝物改變方面有與雌激素相當(dāng)甚至更好的表現(xiàn),并且松花粉與雌激素都可以對2-羥基喹啉和3-吲哚丙酸等23種代謝物向空白對照組代謝物水平調(diào)節(jié)。

表 1 各組大鼠體內(nèi)差異代謝物的變化Table 1 Variations in the differential metabolites in the various rat groups

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

圖 5 各分組差異代謝物的韋恩圖Fig. 5 Venn diagram of the differential metabolites of each group

為了鑒定并可視化松花粉對卵巢早衰大鼠肝臟代謝的影響途徑,使用MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行代謝組學(xué)途徑的分析。結(jié)果顯示,環(huán)磷酰胺通過α-亞麻酸代謝(影響值=0.333 3,p值=0.209 95)、維生素B6代謝(影響值=0.254 9,p值=0.150 35)、嘌呤代謝(影響值=0.187 54,p值=0.005 249)、賴氨酸降解(影響值=0.140 85,p值=0.365 57)和糖酵解/糖異生途徑(影響值=0.105 5,p值=0.398 78)影響肝臟代謝。雌激素通過維生素B6代謝(影響值=0.254 9,p值=0.200 71)、賴氨酸降解(影響值=0.140 85,p值=0.465 1)、精氨酸和脯氨酸代謝(影響值=0.134 48,p值=0.063 537)、糖酵解/糖異生(影響值=0.105 5,p值=0.478 44)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(影響值=0.095 92,p值=0.563 15)等途徑影響著被環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢早衰大鼠肝臟的代謝紊亂。Palmisano等[19]報道了雌激素可以促進(jìn)肝臟脂肪組織代謝,抑制脂肪生產(chǎn)和糖異生。同時,氨基酸與肝臟雌激素受體α(ERα)對生殖功能的調(diào)節(jié)在闡明閉經(jīng)和不孕癥的機(jī)制也具有重要意義[20]。松花粉則通過維生素B6代謝(影響值=0.254 9,p值=0.091 712)、嘌呤代謝(影響值=0.145 78,p值=0.029 752)、糖酵解/糖異生(影響值=0.105 5,p值=0.243 83)等途徑影響被環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢早衰大鼠肝臟的代謝紊亂。嘌呤是存在于生物體內(nèi)的堿基,肝臟是其合成與代謝的重要場所,因而其代謝紊亂現(xiàn)象存在于酒精性肝病[21]等多種肝臟疾病患者中。玄參提取物[22]、川楝子[23]和梔子[24]等中藥都被證明可以通過影響嘌呤代謝這一途徑干預(yù)肝臟代謝。

選擇松花粉與雌激素都參與有效回調(diào)的23種差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析,得到松花粉與雌激素影響肝代謝的相同途徑是維生素B6的代謝(影響值=0.254 9,p值=0.058 236)。維生素B6是2-甲基-3-羥基吡啶酮的衍生物,是一種強(qiáng)抗氧化劑。最新研究顯示維生素B6可通過抑制脂肪酸和膽固醇合成、促進(jìn)脂肪酸分解和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)改善肝臟脂質(zhì)積累[25]。本研究中松花粉與雌激素相同的有效回調(diào)物質(zhì)包含癸?；鈮A等多種酰基肉堿。?；鈮A是肉堿在將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體過程中生成,當(dāng)肉堿與?；鈮A的含量比例失調(diào)時,可以認(rèn)為體內(nèi)發(fā)生代謝紊亂[26],甚至疾病[27]。

3 結(jié)論

綜上,松花粉可以有效回調(diào)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢早衰大鼠的肝臟代謝的變化,在不引起更多代謝物變化時,其回調(diào)效果與結(jié)合雌激素相當(dāng)甚至更好,從代謝通路也可以看出雌激素在干預(yù)肝臟代謝時,存在精氨酸和脯氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝兩種新的代謝途徑,而松花粉回調(diào)代謝物的通路屬于環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的正常大鼠肝臟代謝紊亂時的代謝通路,未對機(jī)體新的代謝通路造成影響,且其影響途徑主要是涉及維生素B6的代謝,主要體現(xiàn)在對酰基肉堿的調(diào)控上。該研究初步探明了松花粉對卵巢早衰大鼠肝臟代謝的干預(yù)機(jī)制,為卵巢早衰的機(jī)制及干預(yù)途徑的探索以及松花粉的功能性應(yīng)用開發(fā)提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。