徐敦明, 吳易峰, 王一帆, 陳芳芳, 張書迪, 賴國銀

(1. 廈門海關技術中心, 福建 廈門 361026; 2. 廈門醫(yī)學院, 福建 廈門 361023; 3. 廣東銘康香精香料有限公司, 廣東 廣州 510530)

近年來,人們的物質(zhì)需求在日益增長,這點在化妝品市場中得到了很好的體現(xiàn),化妝品行業(yè)也成為國民經(jīng)濟發(fā)展最快的行業(yè)之一[1]。從市場規(guī)模來看,2020年中國化妝品市場規(guī)模達到5 000億元,預計到2025年將達到10 000億元;從市場渠道來看,2020年中國化妝品市場零售額增速為9.5%,成為非必需消費品中增速較快的品類[2]。巨大的市場發(fā)展?jié)摿瘖y品產(chǎn)品提出了更高的要求[3]。由于化妝品在使用過程中與人體肌膚直接接觸[1,4],因此化妝品的安全性受到人們的廣泛關注,而其中一部分化妝品的安全性問題實質(zhì)上是化妝品中添加的香料成分的安全問題。李楊杰等[5]就對化妝品中73種常見的禁用物質(zhì)進行了測定,結果表明在多種化妝品中均檢出了禁用物質(zhì),這也正說明化妝品的安全問題不容小覷。香料,包括天然香料和合成香料,是指從帶香物質(zhì)中提取或以人工合成方法得到的致香物質(zhì)的總稱[6]。因具有氣味芳香、自然清新的特點,香料被廣泛添加到各種日常生活用品中[7],如洗衣液、清潔劑、調(diào)味品等,更是化妝品中的重要組成部分。隨著香料在化妝品中的廣泛應用,其安全性問題也逐漸顯露,其中香料過敏問題尤為多見,占到全部化妝品過敏案例的1/3以上[7]。致敏性香料主要包括芳香混合物Ⅰ和芳香混合物Ⅱ,芳香混合物Ⅰ包括:肉桂醇、肉桂醛、戊基肉桂醛、香葉醇、羥基香茅醛、丁香酚、異丁香酚等;芳香混合物Ⅱ包括:檸檬醛、金合歡醇、己基肉桂醛、香豆素、香茅醇[8]。此外,致敏性香料還包括苯甲醇、芳樟醇、水楊酸芐酯、苯甲酸芐酯等[9]。除致敏性外,香料使用不當還可導致中毒等其他不良影響[10,11]。

目前,化妝品中香料成分的分析研究主要集中于GB/T 24800.10-2009《化妝品中19種香料的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[12]中提到的19種香料,測定的方法也多以氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)為主,對茴香醇、甲基丁香酚、異丁香酚甲醚、乙酸丁香酚酯、乙?；惗∠惴?、肉桂酸戊酯、己基肉桂醛、檸檬醛、香豆素的分析測定方法有液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)或氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[13-19]。GC具有技術和設備成熟、分離效率高、分析速度快、靈敏度高、選擇性好及成本低等特點,特別適合易揮發(fā)物質(zhì)的檢測,是食品安全分析檢測領域普適性好、強有力的檢測手段[20]。石玲玲等[21]利用GC同時檢測了化妝品中的苔黑醛、氯化苔黑醛和新鈴蘭醛。但GC不能直接分析難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、強極性、較大相對分子質(zhì)量的物質(zhì)[22]。質(zhì)譜法可以彌補色譜法無法分離復雜組分和假陽性的缺點[23],且對未知化合物具有獨特的鑒定能力。與單極質(zhì)譜相比,串聯(lián)質(zhì)譜對樣品中組成成分的測定更加靈敏[24]。謝建軍等[25]利用分子印跡固相萃取(SPE)-GC-MS對按摩油類化妝品中的16種多環(huán)芳烴進行檢測,樣品經(jīng)正己烷分散,多環(huán)芳烴分子印跡固相萃取柱富集,乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)固相萃取柱凈化,回收率在75.5%～117.2%之間,檢出限為0.3～4.1 μg/kg,該方法靈敏度高、結果良好。吳一鑫等[26]利用GC-MS/MS測定油類嬰兒護理產(chǎn)品中的多環(huán)芳烴,樣品經(jīng)環(huán)己烷溶解,二甲亞砜萃取,環(huán)己烷反萃取,平均回收率在73.3%～125.0%之間,檢出限為0.18～3.13 μg/kg,結果較為理想。謝建軍等[27]利用GC-MS對霜膏類化妝品中16種多環(huán)芳烴進行測定,樣品經(jīng)正己烷提取,復合固相萃取柱凈化,平均回收率在65.4%～129.7%之間,檢出限為0.4～7.9 μg/kg,結果良好。

目前,對于化妝品中同時檢測28種香料成分的研究報道較少。Wang等[28]通過GC-MS/MS同時測定了化妝品中18種代表性的多環(huán)芳烴化合物。Villa等[29]采用HPLC同時測定了化妝品中24種香料成分。本方法通過選擇化妝品中28種香料成分作為研究對象,以面霜、沐浴露、爽身粉、口紅、眼影、潤膚露等不同基質(zhì)的化妝品為試樣,選用甲醇進行提取,采用GC-MS/MS外標法進行分析,建立了一種同時分析28種香料成分的檢測方法,解決了以往檢測難、慢的問題,可節(jié)省檢測成本和檢測時間,提高檢測效率,該法準確靈敏,能為化妝品的質(zhì)量安全提供技術保障。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與設備

TQ-8040氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)(配有電子轟擊(EI)源,日本島津公司); ST16R冷凍臺式離心機(美國ThermoFisher公司); Supelco 24位固相萃取儀(美國Merck公司); N-EVAP-24氮吹儀(美國Organomation公司); SIGMA3-18KS高速離心機(德國Sigma公司); MTV-100多管漩渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司); MS3圓周振蕩器(德國IKA公司); KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波有限公司); CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙酸乙酯(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司);無水硫酸鎂、醋酸鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司),PSA(迪馬科技有限公司),中性氧化鋁小柱(50 mg/3 mL)(Supelco公司)。28種香料成分標準品購自天津阿爾塔公司。

混合標準儲備液:分別準確稱取28種香料成分標準品各1 000 mg置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,配制成28種香料質(zhì)量濃度均為10 g/L的混合標準儲備液,于4 ℃避光保存,可使用3個月。

1.3 樣品前處理

1.3.1固相萃取

稱取2 g(精確至0.01 g)試樣于10 mL具塞比色管中,加入甲醇準確定容至10 mL,超聲提取15 min,上清液待凈化。

用5 mL甲醇潤洗中性氧化鋁柱,取2 mL上述上清液過柱,用10 mL乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液緩慢氮吹近干,用2 mL乙酸乙酯定容,振蕩混勻裝瓶供儀器使用。

1.3.2QuEChERS

稱取2 g(精確至0.01g)試樣于10 mL離心管中,加入甲醇準確定容至10 mL,超聲提取15 min。加入3 g無水硫酸鎂、1 g醋酸鈉搖勻,以不低于1 200 r/min的轉速離心5 min,取上清液2 mL于10 mL離心管中,加入150 mg硫酸鎂和50 mg PSA充分振蕩,以不低于1 200 r/min的轉速離心5 min,取上清液上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Rxi-5sil-Ms 5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度80 ℃,保持5 min,以8 ℃/min升溫至250 ℃,保持1 min;載氣:氦氣(He),流速1.2 mL/min;進樣量:1 μL;進樣方式:不分流進樣。

1.4.2質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源;電離能量70 eV;傳輸線溫度:280 ℃;離子源溫度:230 ℃;質(zhì)譜儀接口溫度:300 ℃;離子監(jiān)測模式:多反應監(jiān)測模式(MRM); 28種香料成分的保留時間、定性離子、定量離子和碰撞能等參數(shù)見表1。

表 1 28種香料成分的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 MS parameters of the 28 fragrance components

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇

針對化妝品樣品所選擇的提取溶劑主要有乙酸乙酯、乙醇、正己烷、甲醇等。本研究分別考察了甲醇、乙酸乙酯、正己烷作為提取溶劑時對化妝品樣品中的香料成分的提取效果。選取沐浴露為基體添加香精香料中烯烴、醇、酚、酯代表性化合物,分別加入甲醇、乙酸乙酯、正己烷至10 mL溶解混勻后,取上清液上機檢測,比較三者之間的回收率,結果如圖1所示,表明以甲醇作為提取溶劑時,提取效果最好。在文獻中,甲醇是化妝品檢測中較為常用的提取溶劑[12,30]。因此,本研究選用甲醇作為化妝品樣品的提取溶劑。

圖 1 不同提取溶劑對香料的提取效果Fig. 1 Effects of different extractants on the extraction of fragrances

2.1.2提取方式的選擇

針對化妝品樣品所采用的提取方法有溶劑溶解提取[30]、振蕩提取[31]、蒸餾提取[32]、超聲提取[33]等方式。本研究分別考察了振蕩提取、超聲提取對化妝品樣品中香料成分的提取效果。選擇烯烴、醇、酚、酯代表性化合物為分析目標物。結果表明,超聲提取效果較振蕩提取效果好,且超聲提取方式利用超聲波的空化作用、機械效應以及熱效應等加速待提取物質(zhì)內(nèi)有效成分的釋放、擴散和溶解,能夠顯著提高提取效率[1]。因此,本研究采用超聲提取的方式進行前處理?？疾炝?種提取時間(5、15、30 min)對化妝品樣品中香料成分提取回收率的影響。結果如圖2所示,當超聲提取15 min和30 min時,其效果相近,且比5 min好。因此,本研究采用提取時間15 min。

圖 2 不同超聲提取時間下代表性化合物的回收率Fig. 2 Recoveries of representative compounds using ultrasound extraction with different extraction times

2.1.3固相萃取前處理的優(yōu)化

李菊等[34]報道了GC-MS快速檢測乳類化妝品中6種合成麝香,根據(jù)其文中闡述,中性氧化鋁小柱對化妝品類樣品的效果更好,因此本研究采用中性氧化鋁小柱作為凈化柱,分別使用10 mL乙腈、乙酸乙酯、正己烷進行洗脫,結果如圖3所示,發(fā)現(xiàn)乙腈極性較強,對弱極性的酯類洗脫能力較差,正己烷屬于非極性有機試劑,對于極性較強的醇、酚類洗脫能力較差,乙酸乙酯極性適中,對于28種香料的回收率整體優(yōu)于乙腈和正己烷,因此洗脫試劑選擇乙酸乙酯。考察了固相萃取洗脫液乙酸乙酯的體積(5、10、20 mL),結果表明洗脫體積為20 mL時回收率沒有明顯提升,洗脫體積為5 mL時回收率較低,因此洗脫時選擇使用10 mL乙酸乙酯。

圖 3 采用不同洗脫試劑時代表性化合物的回收率Fig. 3 Recoveries of representative compounds with different eluting reagents

2.1.4QuEChERS前處理的優(yōu)化

陳岑等[35]報道了QuEChERS-HPLC-MS/MS測定祛痘化妝品中7種硝基咪唑類抗菌藥物,基于文獻中闡述,PSA對目標化合物的回收率影響較小且凈化效果好,因此本研究采用PSA并對PSA用量進行了優(yōu)化,使用色素含量較大的口紅作為基體,分別采用20、50、100 mg PSA對提取液進行凈化,結果如圖4所示,使用50 mg PSA能在確保回收率的情況下達到最好的凈化效果。在QuEChERS的前處理過程中,對于不同分取比例進行凈化效果研究,采用10 mL甲醇提取樣品,分別吸取1、1.5、2、3 mL的上清液進行凈化比對。結果表明,分取2 mL上清液對于28種香精有最好的凈化效果,得到滿足要求的平均回收率。因此,凈化時選擇分取2 mL上清液進行凈化。

圖 4 采用不同質(zhì)量PSA時代表性化合物的回收率Fig. 4 Recoveries of representative compounds with different masses of PSA

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)GC-MS/MS母離子和子離子一一對應的多反應監(jiān)測模式,通過設定多個時間段和掃描通道同時分析多種香精香料成分,先通過GC對其進行分離和全掃描,確定香料成分的出峰時間和一級碎片離子,選擇離子強度高的一級碎片作為母離子,應用電子轟擊掃描模式對母離子在不同碰撞能量下進行二次電離,選擇信號較強的二級碎片離子作為子離子,以產(chǎn)生信號強度最強的碰撞能量作為最終優(yōu)化碰撞能量,優(yōu)化后的條件見表1,在此條件下,28種香料的總離子流圖(TIC)見圖5。

圖 5 28種香料成分的總離子流圖Fig. 5 TICs of the 28 fragrance components 1. limonene; 2. benzyl alcohol; 3. linalool; 4. methyl α-octynoate; 5. citronellol; 6. geraniol; 7. citral; 8. cinnamaldehyde; 9. hydroxycitronellal; 10. anise alcohol; 11. cinnamyl alcohol; 12. eugenol; 13. methyleugenol; 14. coumarin; 15. isoeugenol; 16. α-ionone; 17. methyl isoeugenol; 18. eugenyl acetate; 19. butylphenyl methylpropional; 20. acetyl isoeugenol; 21. amyl cinnamate; 22. lyral; 23. α-amylcinnamyl alcohol; 24. farnesol; 25. hexyl cinnamal; 26. benzyl benzoate; 27. benzyl salicylate; 28. benzyl cinnamate.

2.3 檢出限、定量限與標準曲線

配制系列混合標準溶液,在確定的最佳儀器分析條件下進樣測定,以目標組分的峰面積(Y)對相應的質(zhì)量濃度(X, μg/L)繪制標準工作曲線,結果表明待測香精香料在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系,線性相關系數(shù)(r2)均大于0.999。分別向空白樣品中添加28種香料混合標準溶液,以定量離子信噪比(S/N)大于3確定檢出限,以S/N大于10確定定量限。檢出限、定量限及標準曲線見表2,檢出限為2～20 μg/kg,定量限為5～50 μg/kg。

表 2 28種香料成分的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r2), linear ranges, LODs, and LOQs of the 28 fragrance components

2.4 回收率和精密度

分別在口紅(固體)、護膚膏(半固體)、沐浴露(液體)中添加10、20、100 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準溶液,使樣品中香精的含量為50、100、

500 μg/kg。采用固相萃取前處理方式進行加標回收試驗,每個水平下做6個平行樣。實驗結果表明,目標分析物在口紅中的回收率為71.3%～120.0%,相對標準偏差(RSD)為1.5%～12.4%;在護膚膏中的回收率為80.4%～120.4%, RSD為3.1%～13.7%;在沐浴露中的回收率為75.6%～110.6%, RSD為4.1%～14.6%。待測香精的添加回收率和RSD見表3。

2.5 兩種前處理方式的比較

考慮到市場上化妝品種類繁多,一種前處理凈化方式難以滿足所有類型化妝品的需要,本文采用2種前處理方式以供選擇。SPE前處理方式,凈化效果較好,有較強的除油脂的能力,更適用于含油脂較多的種類,但是前處理的時間相對較長。QuEChERS前處理方式,可以有效去除色素,前處理時間較短,對于大批量的樣品可以節(jié)約前處理的時間。分別在口紅(固體)、護膚膏(半固體)、沐浴露(液體)中添加10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準溶液,使樣品中香精的含量為50 μg/kg,采用兩種前處理方式進行加標回收試驗,比較兩種前處理的回收率,結果如表4所示。兩種方法的回收率均在60%～120%之間,滿足實驗室質(zhì)量控制規(guī)范技術要求。采用SPE凈化的回收率均大于70%,而采用QuEChERS凈化的有部分數(shù)據(jù)小于70%。總體而言,SPE凈化比QuEChERS凈化效果好,今后的研究可以對QuEChERS凈化材料進行進一步優(yōu)化。

表4 SPE和QuEChERS兩種前處理方式下目標物的回收率(n=3)Table 4 Recoveries of the target compounds using two pretreatment methods: SPE and QuEChERS (n=3) %

2.6 實際樣品的測定

按所建立的SPE前處理方法對包括洗發(fā)水、沐浴露、潤膚露、護膚膏、爽膚水、發(fā)膜、按摩油、沐浴鹽晶、爽身粉、護膚精油、潤唇膏、唇彩、眼影、口紅、面膜以及噴霧劑等16種化妝品中的香料成分進行了測定。結果如表5所示,在12種產(chǎn)品中檢出目標物,沐浴露中檢出檸檬烯、芳樟醇、茴香醇、肉桂醇、丁香酚、甲基丁香酚、香豆素、異丁香酚、紫羅蘭酮、異丁香酚甲醚、乙酸丁香酚酯、新鈴蘭醛、金合歡醇、苯甲酸芐酯、水楊酸芐酯、肉桂酸芐酯;爽身粉中有苯甲醇、芳樟醇、香葉醇、茴香醇、肉桂醇、丁香酚、香豆素、紫羅蘭酮、異丁香酚甲醚、乙酸丁香酚酯、苯甲酸芐酯、水楊酸芐酯檢出;發(fā)膜、眼影、潤膚露、唇彩、按摩油、護膚膏、洗發(fā)水中均檢出香豆素,爽膚水、潤唇膏檢出檸檬烯。與沈昊宇等[36]和劉思然等[10]的檢出結果相類似。

表 5 部分化妝品中檢出的香料成分Table 5 Fragrance components detected in several cosmetics

3 結論

本研究建立了化妝品中28種香料成分的GC-MS/MS分析方法,針對大部分化妝品提供了2種不同的前處理方式,含油脂比較多的化妝品,比如洗發(fā)水、按摩油、護膚精油等采用固相萃取的方式,可以很好地除去油脂;對于色素多、基質(zhì)復雜如口紅、唇彩、眼影等可以采用QuEChERS的方式。該方法準確、簡單、可靠、重復性好,適用于各類化妝品中香精香料成分的檢測,可為化妝品的質(zhì)量安全提供技術保障。