瑪依熱·阿不力提甫, 鐘子豪, 白 希

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830054)

制備色譜是一種以分離得到足量的高純度單體化合物為目的的色譜分離技術(shù),現(xiàn)已廣泛用于結(jié)構(gòu)解析、生物活性篩選、感官評(píng)價(jià)及分析對(duì)照品的批量制備等領(lǐng)域。對(duì)于無法用重結(jié)晶及蒸餾純化的熱敏性化合物,高效液相色譜是理想的分離工具。制備液相色譜可通過大直徑柱結(jié)合餾分收集器在室溫下分離富集熱敏性單體化合物,制備規(guī)模可從mg級(jí)至kg級(jí)[1,2]。同時(shí)期發(fā)展起來的氣相色譜技術(shù)對(duì)微量或痕量揮發(fā)性成分具有高效的分離性能,但因其分離后的餾分為氣態(tài),不易收集,制備氣相色譜儀一直未能實(shí)現(xiàn)完全商品化。目前,文獻(xiàn)報(bào)道的制備氣相色譜儀多是在分析型氣相色譜儀色譜柱的末端加裝餾分收集裝置改造而來,采取重復(fù)進(jìn)樣或大體積進(jìn)樣來實(shí)現(xiàn)μg/mg級(jí)別的目標(biāo)化合物的制備[3]。早期制備氣相色譜的餾分收集裝置多為自制冷阱,收集效率較低;而商品化自動(dòng)餾分收集器的問世,極大地改善了分離的效率和精準(zhǔn)度,進(jìn)一步提高了制備氣相色譜儀的自動(dòng)化水平。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在揮發(fā)性有機(jī)化合物的定性方面有著無法比擬的優(yōu)勢(shì),其主要依靠有機(jī)化合物的保留值和標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)定性,而部分同分異構(gòu)體或新化合物可能具有相同的保留值,且它們的質(zhì)譜裂解規(guī)律相似,過度依賴上述兩種方法容易得出錯(cuò)誤的定性結(jié)果。利用制備氣相色譜(Prep GC)結(jié)合現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)(紫外可見吸收光譜、紅外光譜、拉曼光譜、X射線衍射、質(zhì)譜、核磁共振波譜等)對(duì)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中的未知物進(jìn)行分離富集和結(jié)構(gòu)確證則可彌補(bǔ)上述缺陷。隨著樣品的復(fù)雜程度不斷增加,二維或多維Prep GC已逐漸應(yīng)用于揮發(fā)性成分的分離。近年來,Prep GC已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Zuo等[4]在2013年通過查閱1950～2010年間發(fā)表的英文文獻(xiàn),對(duì)Prep GC的結(jié)構(gòu)及其在精油化學(xué)成分、同位素、同分異構(gòu)體、手性化合物的分離應(yīng)用進(jìn)行了綜述;2015年,Sciarrone等[5]綜述了2010～2014年間Prep GC的發(fā)展及應(yīng)用情況,并指出Prep GC在分離純化單體化合物的過程中,溶劑用量少,是一種綠色高效的分離技術(shù);2017年,張海龍等[6]對(duì)Prep GC技術(shù)在生物標(biāo)志物單體放射性同位素分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述;2021年,Kim等[7]綜述了一維和多維Prep GC的結(jié)構(gòu)及它們?cè)诶ハx信息素、藥物雜質(zhì)、環(huán)境污染物分離方面的應(yīng)用進(jìn)展。本文將結(jié)合近年來國(guó)內(nèi)外研究者的相關(guān)研究工作,對(duì)制備氣相色譜儀結(jié)構(gòu)的演變及其多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望。

1 制備氣相色譜系統(tǒng)

典型的制備氣相色譜系統(tǒng)主要由進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器和餾分收集系統(tǒng)構(gòu)成(見圖1)。

圖 1 制備氣相色譜示意簡(jiǎn)圖[8]Fig. 1 Typical scheme of a preparative gas chromatography instrument[8]

1.1 進(jìn)樣系統(tǒng)

常用的制備毛細(xì)管柱氣相色譜的進(jìn)樣方式主要有不分流進(jìn)樣和大體積進(jìn)樣,不分流進(jìn)樣由常規(guī)的分流/不分流進(jìn)樣口實(shí)現(xiàn),大體積進(jìn)樣則通過程序升溫氣化進(jìn)樣口實(shí)現(xiàn)。在分析型毛細(xì)管柱氣相色譜中,不分流進(jìn)樣主要適用于向進(jìn)樣口引入濃度較小的樣品,以達(dá)到檢測(cè)器的靈敏度要求;而對(duì)于制備型毛細(xì)管柱氣相色譜,則需采取過載進(jìn)樣才能夠提高制備效率,因此需要給樣品提供足夠大的氣化空間。如果樣品蒸氣的膨脹體積遠(yuǎn)大于進(jìn)樣口襯管體積,則樣品蒸氣可能會(huì)通過反吹作用從分流出口、隔墊吹掃出口及載氣管線逸散損失,由此也會(huì)造成進(jìn)樣口襯管的污染和分流出口捕集阱、管線的污染。襯管被污染后會(huì)造成色譜峰保留時(shí)間重現(xiàn)性變差,直接影響?zhàn)s分收集器對(duì)色譜峰切割收集的準(zhǔn)確度;而樣品濃度過大,則會(huì)使樣品溶液黏性過大,導(dǎo)致自動(dòng)進(jìn)樣針發(fā)生粘連,進(jìn)樣序列中斷。

上述問題可通過大體積進(jìn)樣加以克服,即可將高濃度的樣品用溶劑稀釋以降低黏性,同時(shí)提高進(jìn)樣量。當(dāng)樣品組分與溶劑之間的沸點(diǎn)之差高于100 ℃時(shí),可采用分流模式下的程序升溫進(jìn)樣口引入樣品,此時(shí)的進(jìn)樣體積可達(dá)100 μL以上;同時(shí),進(jìn)樣口中襯管中應(yīng)有惰性石英棉或吸附劑,以便冷凝的樣品組分停留,而自動(dòng)進(jìn)樣針的推桿速率也應(yīng)與溶劑在襯管中的氣化速率相匹配。在將溶劑用載氣從分流出口中排出后,程序升溫進(jìn)樣口的溫度按既定的升溫程序急速上升,將不同沸點(diǎn)的樣品依次引入色譜柱中進(jìn)行分離,此時(shí)分流出口處于關(guān)閉狀態(tài),以防樣品損失[9]。同時(shí),程序升溫進(jìn)樣口還可以作為制備液相色譜與Prep GC聯(lián)用時(shí)的樣品接口實(shí)現(xiàn)多維色譜分離[10]。

1.2 色譜柱

色譜柱在Prep GC分離中起著至關(guān)重要的作用。在制備過程中,需進(jìn)行過量進(jìn)樣,對(duì)柱容量的要求也隨之提高。填充柱作為經(jīng)典氣相色譜的分離裝置,柱容量較大。Zuo等[11]以石油醚和乙酸乙酯為洗脫劑,利用硅膠柱色譜對(duì)石菖蒲精油進(jìn)行預(yù)分離,收集石油醚/乙酸乙酯為20∶1時(shí)的餾分,將該餾分引入制備氣相色譜,用固定相為10% OV-101的填充柱分離,進(jìn)樣量為5 μL,連續(xù)進(jìn)樣90次后,得到順式細(xì)辛醚178 mg和反式細(xì)辛醚82 mg。王海坤[12]利用配有10% OV-101填充柱的制備氣相色譜,分別對(duì)莪術(shù)和香附精油的化學(xué)成分進(jìn)行分離;從莪術(shù)精油中分離得到5種純度較高的單體化合物,分別是β-欖香烯、莪術(shù)烯、呋喃二烯酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)烯酮;而從香附精油中則富集得到4種單體化合物,分別為香附子烯、β-芹子烯、β-香附酮、α-香附酮。謝雯燕[13]利用固定相為SE-30的填充柱對(duì)煙草中的4種主要生物堿進(jìn)行分離富集,得到產(chǎn)物分別為煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿,純度均在80%以上。盡管填充柱的柱容量大,但其柱效較低,對(duì)復(fù)雜樣品的分離度較差。因此,需要利用硅膠柱色譜作為“準(zhǔn)一維”色譜對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行分段,再利用配有填充柱的制備氣相色譜進(jìn)行純化。

目前,涂壁毛細(xì)管柱已成為應(yīng)用于分離樣品的主流氣相色譜柱,其柱容量較小,柱效高?；谏鲜鰞?yōu)勢(shì),涂壁毛細(xì)管柱已取代填充柱成為制備氣相色譜分離系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)配置。根據(jù)近年來的文獻(xiàn)報(bào)道,應(yīng)用于Prep GC的毛細(xì)管柱一般為低相比(β)的大內(nèi)徑毛細(xì)管柱,其規(guī)格為內(nèi)徑0.32 mm或0.53 mm,固定液的涂漬厚度在0.5～5 μm之間。上述規(guī)格的毛細(xì)管柱具有較高的柱容量,但其分離時(shí)間可能會(huì)相應(yīng)增加。因此,可針對(duì)待分離樣品的性質(zhì)選用涂漬有相同極性固定液的大內(nèi)徑毛細(xì)管色譜柱,以提高分離制備效率。近年來,不同學(xué)者分別利用涂漬有聚乙二醇、5%二苯基-95%甲基聚硅氧烷固定液的大內(nèi)徑毛細(xì)管柱成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)揮發(fā)性成分的分離[14-16]。由于存在色譜峰共流出的情況,配置了大內(nèi)徑毛細(xì)管柱的一維Prep GC的餾出物純度仍不理想。中心切割的多維氣相色譜為復(fù)雜樣品中目標(biāo)化合物的分離提供了高效的解決途徑,因?yàn)槎嗑S色譜的峰容量等于第一維毛細(xì)管柱的峰容量與第二維(或余下多維)毛細(xì)管色譜柱的峰容量的乘積。配置有多根大內(nèi)徑的多維Prep GC兼具高的柱容量和分辨率,可顯著提升分離餾出物的純度[17-19]。涂漬高厚度固定液的大內(nèi)徑毛細(xì)管色譜柱在較高的分離溫度下使用時(shí),固定液會(huì)發(fā)生流失并隨載氣氣流進(jìn)入餾分收集裝置,污染分離純化的產(chǎn)物,致使利用紅外吸收光譜和核磁共振波譜鑒定餾出產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)時(shí)出現(xiàn)干擾峰信號(hào),不利于后續(xù)化合物結(jié)構(gòu)解析鑒定[20]。

1.3 檢測(cè)器

熱導(dǎo)池檢測(cè)器(thermal conductivity cell detector, TCD)和氫火焰離子化檢測(cè)器(hydrogen flame ionization detector, FID)是氣相色譜常用的兩種檢測(cè)器,TCD為非破壞型的通用型檢測(cè)器,其入口可與色譜柱直接相連,出口可直通餾分收集裝置,無需十字分流裝置。陳占營(yíng)等[21]建立了一套配置TCD的制備型氣相色譜系統(tǒng),成功地從氙氡混合樣品中分離得到純度大于85%的氙氣,實(shí)現(xiàn)了氙樣品中氡的高效去除及氙的高效制備。TCD在永久性氣體分離中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),但TCD的靈敏度較低,對(duì)痕量組分可能無響應(yīng)。FID靈敏度高,但為破壞型檢測(cè)器,需要在色譜柱的末端安裝分流裝置,引導(dǎo)少量組分進(jìn)入檢測(cè)器,而大部分樣品則經(jīng)傳輸線進(jìn)入餾分收集器。王海坤[12]在填充柱末端加裝分流器,通過控制分流器兩端的限流閥,設(shè)定收集流量和FID流量之比為95∶5,成功地從莪術(shù)精油中分離到單體化合物。而對(duì)于毛細(xì)管柱來說,通行的做法是在毛細(xì)管末端加裝十字分流閥,在閥的兩端加裝不同內(nèi)徑的毛細(xì)管,一端連接內(nèi)徑為0.1 mm的脫活毛細(xì)管進(jìn)入FID,另一端連接內(nèi)徑為0.32 mm的惰性毛細(xì)管作為傳輸線進(jìn)入餾分收集器。

近年來,隨著聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展,Prep GC與質(zhì)譜、核磁共振波譜儀聯(lián)用也已逐漸成為研究熱點(diǎn)。荷蘭的Jeroen Kool教授課題組已成功將Prep GC與質(zhì)譜、核磁共振波譜儀聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境污染物(如抗雄激素類物質(zhì)、氯化石蠟)的分離制備和結(jié)構(gòu)鑒定[22-24]。

1.4 餾分收集裝置

餾分收集裝置位于制備氣相色譜檢測(cè)器的末端,其主要作用是將分離得到的高純度氣態(tài)單體化合物進(jìn)行濃縮富集。目前,Prep GC的餾分收集裝置主要有商品化的餾分收集器、大內(nèi)徑的毛細(xì)管短柱、吸附劑等。

1.4.1商品化的餾分收集器

目前,配置商品化餾分收集器的制備氣相色譜儀已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品中揮發(fā)性目標(biāo)組分的快速分離[25]。商品化的餾分收集器的生產(chǎn)商全部為國(guó)外公司,各產(chǎn)品之間性能指標(biāo)差異主要在于捕集阱的數(shù)量及冷阱溫度,表1對(duì)部分商品化餾分收集器的性能指標(biāo)進(jìn)行了對(duì)比。

表 1 部分商品化餾分收集器的性能指標(biāo)[26-31]Table 1 Specifications of several commercial fraction collectors[26-31]

其中,德國(guó)Gerstel Preparative Fraction Collector(PFC)是目前應(yīng)用比較廣泛的商品化制備氣相色譜專用收集器,配有6個(gè)樣品收集器和一個(gè)廢棄物收集器。捕集阱的體積為1 μL或100 μL。為了獲得最佳的化合物回收率,PFC可以適配液氮捕集阱冷卻系統(tǒng)或循環(huán)冷浴捕集阱冷卻系統(tǒng)[32]。該餾分收集器可以收集單個(gè)化合物、一系列化合物或特定類別的化合物。經(jīng)過氣相色譜柱高效分離的目標(biāo)有機(jī)化合物單體通過十字分流閥,約有1%經(jīng)內(nèi)徑為0.1 mm的脫活毛細(xì)管進(jìn)入FID,其余99%通過內(nèi)徑0.32 mm的毛細(xì)管傳輸線進(jìn)入八通閥回收裝置,經(jīng)微處理器控制,八通閥的切換時(shí)間可以在0.01 min內(nèi),能夠可靠地收集色譜柱上間隔緊密的單個(gè)化合物。PFC可通過分析型氣相色譜數(shù)百次重復(fù)進(jìn)樣捕獲mg級(jí)別的組分,為后續(xù)利用核磁共振或紅外吸收光譜等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證奠定基礎(chǔ)。盡管PFC已實(shí)現(xiàn)氣相色譜分離組分的自動(dòng)收集,但對(duì)不同類型的化合物其分離條件仍需優(yōu)化。Zhang等[33]以直鏈烷烴、直鏈脂肪酸酯、甾烷和多環(huán)芳烴等11種物理化學(xué)性質(zhì)不同的標(biāo)準(zhǔn)品在制備氣相色譜上的回收效率為考察指標(biāo),對(duì)Prep GC的分離富集條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,制備氣相色譜儀的最優(yōu)分離條件如下:程序升溫進(jìn)樣口的起始溫度為20 ℃(低沸點(diǎn)樣品)或80 ℃,以720 ℃/min的速率升溫到350 ℃,注射速率為300 μL/min,放空流量為20 mL/min,放空時(shí)間為5 s,放空壓力為68.95 kPa (10 psi),載氣(氦氣)流量為5 mL/min, PFC傳輸線和閥箱的溫度分別為280 ℃。而對(duì)于捕集阱冷卻系統(tǒng)的溫度設(shè)定,則無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),高沸點(diǎn)化合物的捕集溫度為45 ℃,低沸點(diǎn)化合物的捕集溫度為-5 ℃。

1.4.2大內(nèi)徑毛細(xì)管短柱

基于大內(nèi)徑毛細(xì)管短柱在頂空富集揮發(fā)性成分時(shí)的優(yōu)異表現(xiàn),其與低溫冷阱耦合已成為制備氣相色譜經(jīng)濟(jì)、高效的餾分收集裝置。大內(nèi)徑毛細(xì)管耦合低溫冷阱裝置利用微板流路控制元件Dean Switch實(shí)現(xiàn)檢測(cè)器與餾分收集流路之間的流量分配,這與Gerstel PFC利用無死體積十字分流閥分配檢測(cè)器與捕集阱傳輸線之間的流量方式有明顯的區(qū)別[34]。Eyres等[35,36]和Rühle等[37,38]用安捷倫微板流路控制系統(tǒng)Dean Switch引導(dǎo)目標(biāo)化合物分別進(jìn)入FID和大內(nèi)徑毛細(xì)管短柱餾分收集裝置。為收到良好的富集效果,該收集裝置適配有干冰捕集阱冷卻系統(tǒng),經(jīng)氣相色譜端多次重復(fù)進(jìn)樣后,將大內(nèi)徑毛細(xì)管短柱從冷阱中取出,用相似極性的溶劑提取后進(jìn)行核磁共振或X-射線衍射分析。Nojima等[39]將40 cm長(zhǎng),內(nèi)徑為0.53 mm的毛細(xì)管柱與氣相色譜分離色譜柱相連作為捕集阱,收集目標(biāo)化合物。為了提高強(qiáng)揮發(fā)性成分的收率,外加熱絕緣貯存槽用于制冷劑的投放;經(jīng)過一段時(shí)間捕集,將大內(nèi)徑毛細(xì)管短柱中的餾分用氘代試劑洗脫入核磁樣品管內(nèi)進(jìn)行核磁共振波譜分析。Nojima等[40]利用制備氣相色譜分離富集C4～C20的正構(gòu)烷烴、直鏈脂肪酸酯、直鏈醇標(biāo)準(zhǔn)品,以回收率為指標(biāo),考察了脫活毛細(xì)管柱、涂漬有甲基聚硅氧烷和聚乙烯醇固定液的毛細(xì)管柱的回收效率。結(jié)果顯示,涂漬有甲基聚硅氧烷的毛細(xì)管柱對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為80%～100%。

1.4.3吸附劑

固體吸附劑對(duì)于樣品中的痕量揮發(fā)性成分具有良好的富集作用,已被用作制備氣相色譜餾分收集。Sciarrone等[17]將填充有2,6-二苯基對(duì)苯醚多孔聚合物(Tenax)的玻璃管置于制備氣相色譜分離毛細(xì)管柱的末端作為餾分收集裝置,以干冰為制冷劑,考察了正構(gòu)烷烴、單萜化合物、內(nèi)酯化合物在該類型制備氣相色譜上的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)于低沸點(diǎn)的正構(gòu)烷烴和單萜化合物,回收率均在95%以上;而對(duì)于高沸點(diǎn)的化合物,在收集玻璃管內(nèi)不填充吸附劑,且不用干冰制冷的條件下,仍可獲得高回收率。Ochiai等[41]將攪拌棒熱脫附-Prep GC與嗅聞/質(zhì)譜系統(tǒng)耦合,以Tenax玻璃管作為單通道PFC的捕集阱,增配PFC氣動(dòng)閥吹掃富集組分快速進(jìn)入吸附管,實(shí)現(xiàn)對(duì)分離得到的痕量風(fēng)味成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)和味覺指認(rèn)。采用上述裝置對(duì)10 ng的15種白葡萄酒的擬香化合物(含醇類、醛類、內(nèi)酯類和酚類化合物)進(jìn)行模擬制備回收,回收率在85%～98%之間。Clery等[14]將5 mg乙基苯乙烯、二乙烯基苯共聚物(Porapak Q)作為吸附劑置于0.5 mm玻璃管作為Prep GC的餾分收集裝置,其末端用截止閥與真空泵相連。利用該裝置對(duì)香附精油中的主要呈香成分進(jìn)行分離富集,成功得到4種含氮二萜類化合物。

2 制備氣相色譜法的應(yīng)用

2.1 在精油單體化合物分離中的應(yīng)用

植物精油具有良好的生物活性,可用于驅(qū)蚊劑、驅(qū)蟲劑及抑菌劑等,但因其沸點(diǎn)較低,且極易發(fā)生氧化,不能直接使用,因此需對(duì)其活性成分進(jìn)行分離。早期的制備氣相色譜大多配置了填充色譜柱,柱容量大,手動(dòng)進(jìn)樣即可從精油中分離出mg級(jí)的單體化合物[42];近年來有關(guān)Prep GC分離精油單體化學(xué)成分的報(bào)道多為毛細(xì)管柱Prep GC,則需配制自動(dòng)進(jìn)樣器,以實(shí)現(xiàn)對(duì)精油中單體化合物的高通量制備。對(duì)于成分較為復(fù)雜的精油樣品,即使使用理論塔板數(shù)較高的毛細(xì)管柱也不可能一步到位進(jìn)行分離制備。因此,Prep GC分離精油組分的策略主要分為兩類:一類是運(yùn)用硅膠柱色譜、逆流色譜或分餾等方法對(duì)精油進(jìn)行粗分,收集餾分經(jīng)減壓濃縮后,引入Prep GC后獲得單體化合物;另一類則是運(yùn)用中心切割多維氣相色譜,對(duì)感興趣的餾分進(jìn)行多維純化后獲得單體化合物。Tissandié等[43]以愈創(chuàng)木油為研究對(duì)象,利用硅膠色譜柱色譜法,以石油醚/乙醚為溶劑體系進(jìn)行梯度洗脫,初步得到愈創(chuàng)木油不同極性部位;再用硝酸銀硅膠柱色譜對(duì)弱極性餾分進(jìn)行二次富集,所得餾分引入制備氣相色譜儀分離,最終分離得到15個(gè)新倍半萜類化合物。Niebler等[44]用Kugelrohr蒸餾對(duì)乳香精油進(jìn)行預(yù)分離,收集沸程在125～170 ℃的餾分,經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定為含氧倍半萜類化合物。將該餾分經(jīng)逆流色譜預(yù)分離后上制備氣相色譜分離純化,最終分離得到2個(gè)含氧倍半萜化合物,分別為莫斯德酮和莎草奧酮。Kambiré等[45]用硅膠柱色譜對(duì)產(chǎn)自科特迪瓦的翼齒六棱菊精油進(jìn)行預(yù)分離,再將收集到的餾分上制備氣相色譜分離得到2個(gè)新的桉葉烷型萜類化合物。Clery等[14]對(duì)用酸提堿沉法得到干膜莎草精油的中性部分和堿性部分,并用Flash柱色譜對(duì)上述兩部分進(jìn)行細(xì)分,其中中性部分經(jīng)梯度洗脫所得餾分經(jīng)氣相色譜嗅聞系統(tǒng)鑒定含有目標(biāo)香氣成分。該部分洗脫物再經(jīng)制備氣相分離純化,得到4個(gè)新的含氧倍半萜類化合物。近年來,隨著多維氣相色譜分析技術(shù)的發(fā)展,多維Prep GC也應(yīng)運(yùn)而生。此項(xiàng)技術(shù)的誕生,可省去龐雜的精油預(yù)分離過程,大大簡(jiǎn)化了分離純化流程。同時(shí),Prep GC與高效液相色譜串聯(lián)后也可達(dá)到事半功倍的效果。Sciarrone等[46]用中心切割二維Prep GC對(duì)一種產(chǎn)自巴西的馬鞭草破布木精油進(jìn)行分離純化,得到反式-檀香醛和反式-佛手柑油烯醛兩種化合物,純度均在90%以上。Pantò等[10]分別采用中心切割三維制備氣相色譜法和液相色譜-中心切割二維制備氣相色譜聯(lián)用法對(duì)檀香木精油進(jìn)行分離純化,得到順式-α-檀香醇等化合物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)液相色譜-中心切割二維制備氣相色譜聯(lián)用法的制備效率較高,且能達(dá)到mg級(jí)制備水平。盡管Prep GC在精油單體化合物的分離中應(yīng)用廣泛,但受制于進(jìn)樣口的高溫,精油中的熱敏感性化合物(如異莪術(shù)呋喃二烯、驅(qū)蟲蛔萜、吉瑪烷型倍半萜等)無法使用Prep GC進(jìn)行制備[47-52]。近幾年來,Prep GC在精油單體化合物分離中的應(yīng)用研究進(jìn)展見表2。

表 2 制備氣相色譜在精油單體化合物分離中的應(yīng)用*Table 2 Application of preparative gas chromatography in the isolation of compounds from essential oil*

2.2 在昆蟲信息素分離中的應(yīng)用

昆蟲信息素是由昆蟲分泌到體外,能在同種個(gè)體間或種間產(chǎn)生生理或行為反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì),對(duì)昆蟲的定向、召喚、交尾、產(chǎn)卵、聚集、追蹤、告警、防御以及種間識(shí)別等行為具有重要的作用。信息素常為昆蟲體內(nèi)分泌的幾種結(jié)構(gòu)類似的化合物的混合物,含量為ng或pg級(jí),大多具有揮發(fā)性,毒性低,可用于制備誘捕劑或迷向劑來防治害蟲。近年來,Prep GC在昆蟲信息素的制備分離和結(jié)構(gòu)鑒定中有較為廣泛的利用。

為了防治棉粉蚧對(duì)植物的傷害,Tabata等[64]采用吹掃捕集法富集未交配的雌性棉粉蚧釋放的性信息素,并以對(duì)雄性棉粉蚧的引誘率為活性分離導(dǎo)向,綜合運(yùn)用經(jīng)典柱色譜、制備液相色譜和Prep GC等分離技術(shù),得到高引誘率(100%)的單體化合物。經(jīng)高分辨質(zhì)譜和核磁共振波譜鑒定,確證該化合物為(1R)-(2,2-二甲基-3-環(huán)丁基)-甲基-異戊烯酸酯,該化合物具有開發(fā)為棉粉蚧誘殺劑的潛力。Tabata等[65]采用吹掃捕集法富集雌性新菠蘿灰粉蚧分泌的性信息素,并以雄性新波羅灰粉蚧的誘捕數(shù)量為活性分離導(dǎo)向,綜合運(yùn)用硅膠柱色譜、制備液相色譜和Prep GC等分離手段,獲得了一種高引誘活性的的單萜化合物,具有與薰衣草醇相似的結(jié)構(gòu)。經(jīng)高分辨質(zhì)譜和核磁共振波譜鑒定,確證該化合物為(E)-2-異丙基-5-甲基-3,5-二烯基己醇乙酸酯。Tabata等[66]運(yùn)用吹掃捕集法富集雌性菠蘿粉蚧的揮發(fā)性成分,綜合運(yùn)用制備液相色譜、Prep GC等手段,獲得了一種刺激雌性菠蘿粉蚧進(jìn)行孤雌生殖的單萜化合物,經(jīng)高分辨質(zhì)譜和核磁共振波譜鑒定,確證該化合物為(2)-(對(duì)-1,2-二甲基-3-亞甲基環(huán)戊基)乙醛。Rahmani等[67]利用Prep GC對(duì)雄性云杉四眼小蠹分泌的信息素進(jìn)行分離,得到兩個(gè)關(guān)鍵活性化合物分別為:(+)-(1R,2S)-誘殺烯醇和(-)-(R)-松油烯-4-醇。通過對(duì)兩種化合物進(jìn)行復(fù)配,進(jìn)行林間誘捕雌性云杉四眼小蠹實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)(+)-(1R,2S)-誘殺烯醇在信息素的功能起效中起主導(dǎo)作用,而(-)-(R)-松油烯-4-醇則居于從屬地位。Millar等[68]以HayeSep?Q為吸附劑,運(yùn)用吹掃捕集法富集雄性長(zhǎng)刺刺腿天牛分泌的揮發(fā)性物質(zhì),經(jīng)二氯甲烷洗脫后,上制備氣相色譜分離,得到對(duì)長(zhǎng)刺刺腿天牛具有專屬特異性誘捕作用的化合物,經(jīng)核磁共振波譜和質(zhì)譜鑒定,確證該化合物為(2E,6Z,9Z)-2,6,9-十五碳三烯醛。Xu等[69]以SuperQ為吸附劑,運(yùn)用吹掃捕集法富集未交配的雌性微紅盤絨繭蜂分泌的信息素,經(jīng)二氯甲烷洗脫后,進(jìn)行Prep GC分離,得到影響微紅盤絨繭蜂交配的性信息素的化合物,經(jīng)質(zhì)譜鑒定為庚醛。象白蟻與進(jìn)入其巢穴的寄居白蟻間互不接觸,且能夠和平共處,二者之間應(yīng)存在種間識(shí)別的信息素。Jiro?ová等[70]用正己烷提取象白蟻頭部分泌物,經(jīng)Prep GC分離結(jié)合電生理研究,分離出兩個(gè)酯類化合物,分別為(3Z,6Z)-二十烷二烯醇脂肪酸酯、十二烷醇脂肪酸酯,經(jīng)活性測(cè)試確認(rèn)上述兩個(gè)化合物為種間識(shí)別信息素,證實(shí)了上述假說。

2.3 在食品和植物揮發(fā)性成分分離中的應(yīng)用

揮發(fā)性成分分離分析是香料香精、食品風(fēng)味研究的先導(dǎo),通過Prep GC結(jié)合嗅覺探測(cè)技術(shù)對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分離和感官評(píng)價(jià),能夠發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),有助于提高食品味覺和口感,為食品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

香氣是酒類的獨(dú)特特征,關(guān)鍵呈香組分是釀酒工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制的重要參考指標(biāo)。Pons等[71]利用Prep GC結(jié)合嗅覺探測(cè)技術(shù)從法國(guó)波爾多紅葡萄酒中分離出具有鮮李香氣味的特征化合物辣薄荷酮。Siebert等[72]利用Prep GC結(jié)合嗅覺探測(cè)對(duì)制備液相色譜預(yù)分離的蘇特恩白葡萄甜酒和維歐尼葡萄酒中的香氣成分分段捕集,進(jìn)行香氣重組和缺失實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),順式-橡木內(nèi)酯、丁香酚、γ-壬內(nèi)酯和2-壬烯-4-內(nèi)酯是“腐橘味”蘇特恩白葡萄甜酒的關(guān)鍵香氣貢獻(xiàn)組分;而芳樟醇、α-松油醇、香葉醇和苯甲醛為“甜杏味”維歐尼葡萄酒的關(guān)鍵香氣貢獻(xiàn)組分,為上述兩種法式葡萄酒的釀制工藝的優(yōu)化提供了參考。酒類的揮發(fā)性物質(zhì)是消費(fèi)者的重要感官成分之一,直接影響著其市場(chǎng)認(rèn)可度。啤酒化發(fā)酵過程中產(chǎn)生的含硫化合物2-巰基-3-甲基-1-丁醇,具有低香氣閾值,常帶有洋蔥氣味,破壞了啤酒的口感。Noba等[16]運(yùn)用Prep GC從發(fā)酵后的啤酒花汁提取物中分離出了形成2-巰基-3-甲基-1-丁醇的前體物質(zhì),經(jīng)核磁共振波譜和質(zhì)譜鑒定為2,3-表-3-甲基丁醛,并闡明了2-巰基-3-甲基-1-丁醇在啤酒花汁發(fā)酵過程中的形成機(jī)制,提出了改進(jìn)發(fā)酵工藝的路徑,從而抑制硫化物的產(chǎn)生,改善啤酒口感。

植物中的揮發(fā)性成分可在一定程度上反映其生理活動(dòng)過程,Prep GC可快速對(duì)其進(jìn)行分離。Kroener等[73]利用Prep GC對(duì)不同品種辣根中的辛辣味成分進(jìn)行分離富集,結(jié)合二維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/嗅聞探測(cè)技術(shù)和波譜技術(shù)對(duì)純化后的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,揭示了不同品種的辣根中共有的低香氣閾值的成分為(3S,3aS,7aR)-葡萄酒內(nèi)酯和3-異丙基-2-甲氧基吡嗪。Maia等[74]對(duì)天南星科的3種夜間開花植物花蕾頂空揮發(fā)性成分進(jìn)行吹掃捕集,經(jīng)Prep GC分離,得到對(duì)授粉昆蟲石雕甲蟲具有引誘作用的4種揮發(fā)性化合物分別為脫氫茉莉酮、異茉莉醇、乙酸異茉莉酯和(E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯-5-醇乙酸酯。Andersen等[75]將調(diào)控萜類合成酶的基因從毒蘿卜新品種ThapsialaciniataRouy提取并插入煙草基因中,利用Prep GC從含有TlTPS509萜類合成酶的煙草葉中分離得到了愈創(chuàng)木醇和布藜醇,闡明了毒蘿卜ThapsialaciniataRouy中調(diào)控產(chǎn)生愈創(chuàng)木醇和布藜醇的酶為TlTPS509萜類合成酶。

2.4 在地質(zhì)生物標(biāo)志物分離中的應(yīng)用

地質(zhì)生物標(biāo)志物是地質(zhì)體中能夠提供有機(jī)質(zhì)生物輸入源、沉積和成巖過程中的環(huán)境條件等信息的特征有機(jī)化合物,這些有機(jī)化合物雖然經(jīng)歷了成巖、成土等地質(zhì)作用影響,但其仍繼承了先驅(qū)物的基本碳骨架,具有重要的地球化學(xué)研究?jī)r(jià)值[76]。地質(zhì)生物標(biāo)志物在自然環(huán)境中的含量很低,需要通過有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提富集后,經(jīng)硅膠柱色譜梯度淋洗預(yù)分離后,再利用Prep GC純化才能獲得高純度的目標(biāo)地質(zhì)生物標(biāo)志物,用于結(jié)構(gòu)鑒定。Wang等[77]利用硅膠柱色譜從多米尼加琥珀萃取物中分離得到直鏈烴餾分,該餾分再經(jīng)Prep GC富集純化,得到反映琥珀形成時(shí)期氣候、植被等地理信息的標(biāo)志物,經(jīng)核磁共振波譜、質(zhì)譜和電子圓二色譜鑒定其絕對(duì)構(gòu)型為15-降-克羅-(3,12)二烯。該化合物結(jié)構(gòu)與豆科孿葉豆屬植物分泌的特征化合物克羅烯酸的骨架結(jié)構(gòu)相似。據(jù)此,從化合物分子結(jié)構(gòu)上證實(shí)了多米尼加琥珀來自豆科樹脂分泌物的論斷。Zhang等[78]利用硅膠柱色譜結(jié)合Prep GC從茂名油頁巖非烴餾分中分離富集單體化合物,經(jīng)核磁共振波譜、紅外光譜、質(zhì)譜等鑒定,確認(rèn)出兩個(gè)含氧的新生物標(biāo)志物,分別為5,9-二甲基-6-異丙基-2-十酮和4,9,11-三甲基-6-異丙基-2-十二酮。Liao等[79,80]利用硅膠柱色譜結(jié)合Prep GC,對(duì)茂名油頁巖中的叢粒藻烷類化合物進(jìn)行分離純化,經(jīng)核磁共振、紅外光譜、質(zhì)譜等儀器分析手段鑒定,確認(rèn)出一個(gè)新的C33叢粒藻烷酮和兩個(gè)新的高支鏈烷烴,分別為C33-叢粒藻烷-24-酮,2,3,6,7,10,12,15,16,19,20-十甲基-10-乙基-二十一烷(C33-新叢粒藻烷), 2,3,6,7,10,12,15,16,19,20-十甲基二十一烷(兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體,C31-叢粒藻烷),同時(shí)闡明了上述化合物在成巖過程中的可能形成機(jī)制。

碳是地球生物圈中分布最廣的元素,14C是碳元素中一種具有放射性的同位素,可發(fā)生β衰變,半衰期為5 730年,是理想的示蹤指標(biāo)?；诖私⒌目傆袡C(jī)物的放射性碳同位素特征分析方法,能夠根據(jù)14C的衰變規(guī)律(碳齡)揭示自然界中有機(jī)碳的遷移、轉(zhuǎn)化和埋藏特征。但自然界中總有機(jī)碳的組成和來源復(fù)雜,各有機(jī)化合物的碳齡不盡相同,使得總有機(jī)物的放射性碳的同位素組成掩蓋了眾多的物源信息,難以進(jìn)行碳源分析。生物標(biāo)志物單體放射性碳同位素分析技術(shù)(compound-specific radiocarbon analysis, CSRA)可提供單一生物標(biāo)志物的碳源信息,有效解決上述瓶頸問題。該方法由英國(guó)有機(jī)地球化學(xué)家Timothy I. Eglinton提出[81],主要是利用Prep GC技術(shù)從環(huán)境樣品中分離出目標(biāo)生物標(biāo)志物單體,再經(jīng)離線的加速器質(zhì)譜儀測(cè)定mg級(jí)的單體化合物中的14C含量,對(duì)自然和人類活動(dòng)產(chǎn)生的有機(jī)碳來源進(jìn)行解析研究。利用該技術(shù),Eglinton團(tuán)隊(duì)[82]還成功分離出了新不列顛海溝水深在8 225、5 920、4 670和4 130 m等4處采集的柱狀沉積物中的正構(gòu)烷烴和脂肪酸,并進(jìn)行14C定年,闡明了新不列顛海溝的碳源主要來自巴布亞新幾內(nèi)亞森林土壤的有機(jī)質(zhì);Ausín等[83]利用硅膠柱色譜、Prep GC分別從葡萄牙伊比利亞邊緣海底巖芯樣品中分離出烯酮和長(zhǎng)鏈脂肪酸,并進(jìn)行14C定年,揭示了末次盛冰期以來北歐海次表層溫度的變化演進(jìn)趨勢(shì)。Gierga等[84]利用Prep GC技術(shù)從瑞士肖松尼湖底部沉積物中分離出正構(gòu)烷烴單體,并進(jìn)行14C定年,據(jù)此推斷出史前時(shí)期肖松尼湖周邊植被變化及早期人類活動(dòng)對(duì)肖松尼湖周邊陸上環(huán)境影響。Eglinton團(tuán)隊(duì)[85]還利用Prep GC從考古文物中分離富集得到高純度生物標(biāo)志物,并對(duì)生物標(biāo)志物中的14C水平進(jìn)行分析,為文物斷代定年奠定基礎(chǔ);但在CSRA技術(shù)應(yīng)用過程中,Prep GC的毛細(xì)管色譜柱固定液涂層流失、洗脫捕集阱餾分的有機(jī)溶劑的不完全脫除、商品化溶劑中的穩(wěn)定劑等都會(huì)引入外源性的碳污染[86],會(huì)給微量樣品14C水平分析結(jié)果帶來正誤差,需加以扣除;為應(yīng)對(duì)上述問題,Eglinton團(tuán)隊(duì)[20]將Gerstel自動(dòng)餾分收集器的捕集阱改為帶玻璃棉的中空石英管,無需溶劑富集餾分,避免從捕集溶劑中引入外源碳,獲得良好的分析效果。

基于Prep GC的CRSA技術(shù)還可用于解析人類活動(dòng)對(duì)地球環(huán)境影響的重要標(biāo)志化合物(多環(huán)芳烴、二元羧酸)來源[87]。押淼磊等[88,89]建立了單體多環(huán)芳烴的二維Prep GC分離和收集方法,并從海水中成功分離得到高純度的芴、菲+蒽、熒蒽和芘,進(jìn)行14C定年,應(yīng)用于臺(tái)灣海峽海水中多環(huán)芳烴的來源解析。中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)所的張干課題組[90,91]結(jié)合丁酯化衍生技術(shù),利用Prep GC技術(shù),成功地從有機(jī)氣溶膠中分離出二元羧酸單體,進(jìn)行14C定年,并應(yīng)用于中國(guó)幾個(gè)典型城市的大氣液相過程前體物來源分析。

2.5 在持久性環(huán)境污染物毒性研究中的應(yīng)用

現(xiàn)有的Prep GC大多依靠冷阱對(duì)單體化合物進(jìn)行捕集,氣態(tài)分析物從高溫管線中直接流入低溫捕集阱中易形成氣溶膠,造成損失;且分離純化餾分個(gè)數(shù)少,無法進(jìn)行后續(xù)的活性篩選分析。荷蘭阿姆斯特丹自由大學(xué)Jeroen Kool教授課題組[22,24,92]對(duì)現(xiàn)有氣相色譜儀流路進(jìn)行改造,分離組分經(jīng)兩個(gè)Y形分離器分流后,一路進(jìn)入FID或質(zhì)譜檢測(cè)器,另一路被恒流泵輸入的溶劑捕集后經(jīng)多功能采樣器順序送入96或384孔板,實(shí)現(xiàn)了對(duì)餾分的實(shí)時(shí)分離收集。96或384孔板中的餾分再進(jìn)行離線生物活性篩選(如抑制乙酰膽堿酯酶活性篩選、雄性激素受體介導(dǎo)酶報(bào)告基因篩選),分離出高毒性的持久性環(huán)境污染物,現(xiàn)已將該技術(shù)成功應(yīng)用于環(huán)境中農(nóng)藥殘留和內(nèi)分泌干擾物的篩查。近期,Jeroen Kool教授課題組[23]將上述分離平臺(tái)與核磁共振波譜儀離線聯(lián)用,成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜環(huán)境污染氯化石蠟的篩查。但上述分離平臺(tái)的結(jié)構(gòu)改造對(duì)儀器設(shè)備配置要求較高,還難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的商品化應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

本文對(duì)Prep GC的結(jié)構(gòu)及其在揮發(fā)性成分分離中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。根據(jù)Prep GC的結(jié)構(gòu),采用優(yōu)化的分離參數(shù)(進(jìn)樣方式、色譜柱類型、檢測(cè)器類型、捕集阱冷卻溫度),才能精準(zhǔn)獲得高純度的目標(biāo)化合物。Prep GC與現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)(紫外可見吸收光譜、紅外光譜、拉曼光譜、X射線衍射、質(zhì)譜、核磁共振波譜等)耦合,可實(shí)現(xiàn)分離單體化合物結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)確證;Prep GC技術(shù)已實(shí)現(xiàn)對(duì)精油單體化合物、昆蟲信息素、食品和植物中揮發(fā)性成分、地質(zhì)生物標(biāo)志物以及環(huán)境污染物等的高效分離富集,在不同領(lǐng)域展現(xiàn)出良好應(yīng)用前景。

Prep GC作為揮發(fā)性成分分離的有力工具,尚存在一些不足。首先,Prep GC無法對(duì)熱敏性化合物進(jìn)行分離制備。部分熱敏性化合物在高溫進(jìn)樣口即發(fā)生裂解,需考慮建立特殊的氣相色譜進(jìn)樣方法加以解決;其次,Prep GC的餾分捕集阱數(shù)量少,體積小,收集時(shí)需要耗費(fèi)大量制冷劑(液氮或干冰),回收率低,需通過對(duì)各種類型化合物對(duì)照品的預(yù)分離來優(yōu)化捕集參數(shù);最后,Prep GC分離過程中所用溶劑、色譜柱固定液的涂層流失都會(huì)引入外源性干擾,對(duì)分離純化得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)確證帶來困擾,需采取措施對(duì)這部分物質(zhì)加以去除。由此可見,Prep GC在揮發(fā)性成分分離應(yīng)用領(lǐng)域中尚有許多可探究的空間。