李 瀟, 顏海鵬, 肖政輝

(南華大學(xué)兒科學(xué)院,湖南省兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,長沙 410007)

膿毒癥（sepsis）是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙［1］。全球流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，膿毒癥和嚴(yán)重膿毒癥住院病死率分別為17%和26%；國內(nèi)多項流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也與之相似，該病是困擾重癥監(jiān)護病房醫(yī)生的棘手問題之一［2-3］。膿毒癥病程受多種因素的影響。為了更好地研究膿毒癥的病理機制，尋找更加合理的臨床診療措施，學(xué)者們嘗試建立各種膿毒癥動物模型以模擬人類膿毒癥的病程。然而膿毒癥的臨床前動物模型很難完全復(fù)制臨床上人類膿毒癥的復(fù)雜性，并受到多種因素的影響和制約，現(xiàn)將這些因素綜述如下。

1 膿毒癥模型的建立方法

結(jié)合近些年研究可知，現(xiàn)有的膿毒癥動物模型制備方法大致分為四類：（1）注射外源性毒素模型；（2）注射外源性活菌模型；（3）腹腔感染模型；（4）腹腔外膿毒癥模型。其中前三種最為常用。

1.1 注射外源性毒素模型

向動物體內(nèi)注射外源性毒素可建立膿毒癥動物模型。例如內(nèi)毒素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎性因子，通過介導(dǎo)適應(yīng)性免疫或產(chǎn)生放大的級聯(lián)反應(yīng)，促使全身炎性反應(yīng)發(fā)生?？赏ㄟ^靜脈、腹腔等不同途徑向動物體內(nèi)輸注LPS，根據(jù)劑量和方法不同，分為小劑量一次性輸注、小劑量持續(xù)輸注和大劑量一次性輸注。小劑量單次輸注LPS，引起宿主的器官功能損傷較輕，自愈率較高。大劑量單次輸注LPS 通常會導(dǎo)致心輸出量降低，血管阻力正?；蛟黾?，與膿毒癥早期高排低阻改變（即全身血管阻力下降，并伴有高心排血量）不符，引起的宿主炎性反應(yīng)過重，死亡率過高，且致死的原因非膿毒癥而是毒血癥，與研究目的不符［4］。持續(xù)小劑量輸注可較好地模擬人類早期高動力和晚期低動力的變化，同時伴有免疫系統(tǒng)的激活，能達(dá)到與臨床膿毒癥相似的死亡率，適于研究抗炎復(fù)合物如炎性小體的作用以及炎性級聯(lián)反應(yīng)的激活機制。但注射LPS 導(dǎo)致細(xì)胞因子短期急速升高，與人類膿毒癥病程中產(chǎn)生低而持久可檢測的細(xì)胞因子水平不符，有一定局限性［5］。

1.2 注射外源性活菌模型

膿毒癥是細(xì)菌及其細(xì)胞壁成分LPS 釋放入血導(dǎo)致的全身炎性反應(yīng)。通過腹腔或靜脈注射細(xì)菌如大腸埃希菌，能引起機體炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β 快速升高，產(chǎn)生的宿主反應(yīng)與毒素中毒模型相似，且腹腔內(nèi)給藥產(chǎn)生的炎性反應(yīng)較靜脈給藥途徑減弱。輸注外源細(xì)菌可導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血，并參與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活動，擾亂抗凝機制，同時可引起低血壓休克，適于研究宿主對病原體的反應(yīng)機制，探討針對組織因子及其受體途徑的干預(yù)方法［5-6］。但該模型缺少類似于臨床膿毒癥的感染源，且膿毒癥通常是多菌性的，單一菌株的使用不能很好地反映膿毒癥的臨床表現(xiàn)。

1.3 腹腔感染模型

腹腔感染是膿毒癥患者最常見的感染源，且腹腔感染模型操作簡便，可重復(fù)性高，得到了廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，64%的高被引膿毒癥動物相關(guān)研究使用了盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）［7］。CLP 模型通過將盲腸結(jié)扎穿孔，使腹腔內(nèi)少量持續(xù)溢入混有多種細(xì)菌的腸內(nèi)容物，重現(xiàn)了多菌性腹膜炎的臨床特點，同時可呈現(xiàn)出促炎和抗炎免疫反應(yīng)的激活、持續(xù)的炎性反應(yīng)、早期高動力和晚期低動力循環(huán)狀態(tài)、多器官功能障礙及細(xì)胞因子反應(yīng)的類似動力學(xué)變化。且通過控制結(jié)扎盲腸的長度及穿孔所用針頭大小、穿孔數(shù)目等因素可調(diào)控膿毒癥模型動物的死亡率，適于評估腹腔內(nèi)感染［5，8-9］。但CLP模型可形成腹腔內(nèi)膿腫和腹膜炎兩種情況，模型的壞死組織也缺少像臨床上手術(shù)切除的干預(yù)方式，所以有研究者提出可通過建立升結(jié)腸支架植入腹膜炎（colon ascendens stent petitonitis，CASP）模型解決這個問題。

CASP 模型是將一個固定管徑的支架植入升結(jié)腸，使腸內(nèi)容物持續(xù)滲漏到腹腔中，造成急性多菌性膿毒癥性腹膜炎。膿毒癥的嚴(yán)重程度可通過改變支架直徑或在二次手術(shù)中移除支架并縫合腸穿孔來調(diào)節(jié)［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)支架在3 h 內(nèi)被移除時，小鼠預(yù)后較佳，而當(dāng)支架植入超過9 h后被移除，小鼠死亡率增加。該模型血流動力學(xué)較穩(wěn)定，炎性因子水平穩(wěn)步、持續(xù)增長，常引起多器官功能障礙，適用于彌漫性腹膜炎新治療方法的評價。但也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞因子的快速升高，大鼠模型肝臟中促炎因子表達(dá)較多，抗炎因子表達(dá)較少，與肺中促炎因子表達(dá)較少而抗炎因子表達(dá)較多的情況相反，可能出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和代償性抗炎反應(yīng)綜合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS）在不同部位同時發(fā)生［12］。有學(xué)者提出盲腸結(jié)扎和切口（cecal ligation and incision，CLI）模型能更好地模擬膿毒癥的急性發(fā)作，適用于膿毒癥血流動力學(xué)改變和血氣分析的短期研究［5］。但CLI 模型的應(yīng)用還不廣泛，其代謝、血流動力學(xué)和免疫反應(yīng)的特征尚未充分闡明。

將實驗動物盲腸內(nèi)容物腹腔注射到其他動物體內(nèi)的盲腸漿液注射模型（cecal slurry injection，CS）是誘導(dǎo)多微生物膿毒癥的另一種方法。新生小鼠器官體積小，腸道發(fā)育不完全，盲腸結(jié)扎和穿刺難度高，故CS模型適用于研究新生兒膿毒癥，且避免了手術(shù)模型造成組織損傷和缺血的影響［13］。

1.4 腹腔外膿毒癥模型

有60%的臨床前膿毒癥模型采用的是腹腔感染模型，但在測試新的治療方法時，腹腔外膿毒癥模型也很重要。通過向氣管或鼻腔內(nèi)注入細(xì)菌，進而誘發(fā)肺部感染的動物模型，可用于研究膿毒癥的局部病理情況。該模型的實驗操作簡單且可重復(fù)性高，能引起多器官損傷；但其細(xì)胞因子水平具有菌株特異性，病程受所選菌株和接種劑量、抗生素的影響，存在一定局限性［5，14］。

2 建立膿毒癥模型的考慮因素

2.1 實驗動物種類和品種品系

膿毒癥動物模型在進一步了解膿毒癥復(fù)雜病理生理機制方面具有重要作用，其中動物的選擇是動物模型建立的首要問題，關(guān)系到模型能否成功復(fù)刻臨床。雖然許多物種與人類有共同的發(fā)病途徑，但在膿毒癥方面，物種間的差異是顯著的。

目前可用于建立模型的動物種類較多，學(xué)者們根據(jù)不同動物種類各自的特點，將其用于不同目的的研究。大型哺乳動物如豬、犬和靈長類，其遺傳背景、生理特點與人類相似，可對血液和組織進行連續(xù)取樣、連續(xù)監(jiān)測器官功能狀態(tài)，適于觀察疾病發(fā)生發(fā)展過程，研究膿毒癥的基本機制，但成本昂貴，常用于新治療藥物和治療模式的最終試驗。如靈長類動物黑猩猩，對于評價膿毒癥免疫炎性反應(yīng)具有重要價值。豬、犬多用于研究多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），也可進行離體細(xì)胞培養(yǎng)。小型哺乳動物如大鼠、小鼠、豚鼠等嚙齒類動物，價格低廉，操作方便，易于進行轉(zhuǎn)基因或基因敲除，用于觀察膿毒癥的病理生理變化，進行生存率及基因相關(guān)疾病機制研究［15-16］。

目前94%的膿毒癥模型相關(guān)研究使用了嚙齒類動物，其中小鼠模型占79%［17］。關(guān)于膿毒癥建模的現(xiàn)有文獻(xiàn)中，大多數(shù)實驗選擇了C57BL/6 小鼠。但小鼠總血容量過少，難以連續(xù)采集血液或組織樣本以評估病理過程的時間依賴性，且有創(chuàng)性監(jiān)測如血流動力學(xué)技術(shù)的使用受限，難以評估膿毒癥的嚴(yán)重程度及所處階段。

2.2 動物年齡

流行病學(xué)調(diào)查表明，年齡是膿毒癥患者死亡率的獨立預(yù)測因素，是決定膿毒癥風(fēng)險和預(yù)后的關(guān)鍵因素，而且在成年人群中膿毒癥病死率隨著年齡的增長呈線性增加。有研究者通過回顧性分析發(fā)現(xiàn)，年齡是小兒膿毒癥嚴(yán)重程度的決定因素，年齡越小，病死率越高，3歲前嬰幼兒死亡率高于3歲后的兒童和青少年［18-19］。小鼠生長周期可分為新生期（1 周齡）、幼齡期（3～8周）、成熟期（2～4 月齡）和中老年期（＞4 月齡），可根據(jù)實驗?zāi)康呐c方法選擇合適發(fā)育周期的小鼠進行實驗。

目前新生小鼠膿毒癥造模推薦選用CS模型，通過腹腔注射盲腸漿液（1.1～1.3 mg/g）模擬新生兒腸穿孔引起的多微生物膿毒癥，其死亡率具有全身炎癥和劑量依賴性的特點。對于幼齡期、成熟期及中老年期小鼠，大多采用注射外源性毒素模型及腹腔感染膿毒癥模型，無論是CLP、CASP 還是CS、LPS，既依賴于劑量，也受多種因素如穿孔數(shù)目、植入支架直徑等影響。目前大多數(shù)實驗選用6～12周齡小鼠。在CLP及LPS模型中均發(fā)現(xiàn)老年小鼠死亡率更高（65%vs 20%），IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子水平更高，對抗炎性刺激的免疫反應(yīng)能力更低，抗生素療效愈差的特點［5，13，20］。

2.3 動物性別

性別差異影響膿毒癥的發(fā)病率和預(yù)后。對2001—2012年包括6 134例成人膿毒癥患者數(shù)據(jù)的回顧性分析表明，男性膿毒癥患者90 d 和1 年死亡率及住院期間死亡率均較女性高，分別為45.1%比42.1%，55.6%比51.4%，33.8%比31.3%，女性臨床結(jié)局優(yōu)于男性患者的原因可能與激素的分泌、調(diào)節(jié)相關(guān)［21］，也可能與X染色體上一些基因參與調(diào)節(jié)免疫相關(guān)蛋白質(zhì)編碼、mRNA 轉(zhuǎn)錄有關(guān)，還可能是因為多態(tài)性X-連鎖基因與細(xì)胞嵌合能使女性更好地對抗感染。同時睪酮可通過激活非基因組途徑調(diào)節(jié)的絲裂原活化蛋白激酶信號等機制起到免疫抑制作用［22-24］。

研究發(fā)現(xiàn)，雌激素水平低下組小鼠巨噬細(xì)胞釋放IL-1β 和IL-6 的量與正常組小鼠相比明顯降低，提示雌激素有利于免疫功能的維持［25］。相對于雌激素變化明顯的雌鼠來說，雄鼠可能更適合大多數(shù)膿毒癥建模相關(guān)研究，而對于研究性激素作用及妊娠、卵巢切除術(shù)后對感染的易感性及其病理生理機制研究，則雌鼠更具價值。

2.4 輔助治療

臨床前膿毒癥模型為了更接近臨床，應(yīng)盡量使用基本的輔助治療，也可根據(jù)實驗?zāi)康亩?。膿毒癥常會導(dǎo)致血壓下降和組織灌注不足。2016 年的膿毒癥和膿毒性休克管理國際指南建議，在確診膿毒癥或膿毒性休克后1 h 內(nèi)應(yīng)開始經(jīng)驗性靜脈注射抗生素，3 h 內(nèi)靜脈注射至少30 mL/kg 的等滲晶體液。早期積極的液體復(fù)蘇可顯著增強膿毒癥小鼠模型的臨床相關(guān)性，并且將CLP小鼠術(shù)后4 d的存活率提高60%。而早期體液復(fù)蘇不足可能無法復(fù)制臨床膿毒癥中出現(xiàn)的血流動力學(xué)異常狀態(tài)。實驗動物可通過靜脈、皮下和腹腔內(nèi)給藥，為了密切模擬臨床，液體復(fù)蘇應(yīng)通過靜脈途徑進行，但在靜脈通路有限的小動物模型中，優(yōu)先選擇腹腔內(nèi)給藥，因此需結(jié)合模型的類型和研究目的選擇合適的給藥途徑［26-27］。

抗生素的使用是早期治療膿毒癥及膿毒性休克的關(guān)鍵步驟，能提高CLP 術(shù)后實驗動物存活率，但不是膿毒癥模型中炎性反應(yīng)和預(yù)后的主要決定因素。而且抗生素劑量需根據(jù)具體實驗?zāi)Ｐ瓦x擇，目前尚無統(tǒng)一的給藥方案。膿毒癥和膿毒性休克管理國際指南建議，經(jīng)驗性使用廣譜抗生素或基于模型和可能或已知的病原體選用抗生素。如對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌可用β-內(nèi)酰胺類治療，對大腸埃希菌用第二代或第三代頭孢菌素或氨基糖苷治療；對多種微生物感染，如腸穿孔（如CLP 和CASP 模型），可以使用廣譜抗生素如碳青霉烯，或覆蓋G+和G-需氧菌和厭氧菌的藥物組合治療。有學(xué)者曾對190 項小鼠膿毒癥研究進行回顧性分析，結(jié)果顯示β-內(nèi)酰胺類使用最頻繁（90%）。另外，感染部位也影響抗生素的選擇，不能有效穿過血腦屏障的抗生素不適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。在大多數(shù)小型嚙齒類動物膿毒癥研究中，抗生素為皮下給藥，大型哺乳動物的研究中推薦靜脈注射給藥［26，28］。

2.5 并發(fā)癥

膿毒癥患者臨床上常伴有如肝腎疾病、糖尿病等慢性病。研究表明膿毒癥患者平均伴有1.07個并發(fā)癥。目前動物模型基本使用健康、年輕的動物，而理想的膿毒癥動物模型應(yīng)能模擬臨床膿毒癥的特點。但合并腎損傷的CLP模型血管通透性增加，細(xì)菌清除率下降，膿毒癥程度比簡單CLP 模型更重，且膿毒癥存在凝血障礙會影響肝素治療的效果。因此，可能復(fù)雜的膿毒癥動物模型更適于評價藥物療效，研究有并發(fā)癥的膿毒癥動物模型更具臨床意義［29］。

3 建立CLP模型的影響因素

大多數(shù)研究采用CLP 建立膿毒癥模型，而在CLP手術(shù)操作過程中還有許多值得考慮的因素。

3.1 鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜方式選擇

在動物模型中，疼痛能影響動物行為和免疫系統(tǒng)功能。膿毒癥模型推薦使用鎮(zhèn)痛藥物，鎮(zhèn)痛藥成為影響膿毒癥模型存活率及炎性反應(yīng)的重要因素。目前對于臨床膿毒癥患者使用鎮(zhèn)痛藥的類型及劑量尚無具體建議，且在臨床前膿毒癥研究中也較少提及。丁丙諾啡是嚙齒類動物模型中最常用的鎮(zhèn)痛藥，在小鼠CLP模型中，通常是腹腔內(nèi)或皮下注射，且尚無推薦劑量，大部分研究所使用劑量為0.05～0.1 mg/kg。研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥免疫相關(guān)機制的研究中應(yīng)用丁丙諾啡對小鼠存活率、細(xì)胞因子水平的影響不大，相比于易導(dǎo)致細(xì)菌移位及促進細(xì)菌生長的嗎啡，免疫抑制作用較弱的阿片類藥物可能更適用于膿毒癥炎癥相關(guān)的研究［30］。

動物實驗常需對動物進行麻醉。有研究表明，揮發(fā)性麻醉劑可增強巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并降低TNFα、IL-1β mRNA 的表達(dá)，在一定程度上保護了體內(nèi)缺血再灌注損傷的組織器官，縮短術(shù)后恢復(fù)時間，延長膿毒癥小鼠的生存期［31-32］。而水合氯醛的麻醉效果僅為催眠鎮(zhèn)靜作用，依據(jù)動物倫理目前已不推薦腹腔注射水合氯醛用于動物麻醉［33］。Herrmann等［32］發(fā)現(xiàn)異氟烷麻醉在小鼠CLP 模型中對器官功能損傷、生存率的改變不明顯，未顯著影響預(yù)后。七氟醚、地氟醚麻醉可顯著提高7 d生存率，減輕器官損傷，降低組織損傷標(biāo)志物的表達(dá)。

目前在膿毒癥模型中，鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜方式的選擇、劑量選定、適用研究方面的文獻(xiàn)不多，還待進一步研究摸索。

3.2 盲腸結(jié)扎長度及穿刺針的大小、數(shù)量

在CLP 模型中，盲腸結(jié)扎長度、穿刺針型號、穿孔數(shù)量都被認(rèn)為與膿毒癥模型損傷嚴(yán)重程度相關(guān)，且作為影響模型死亡率的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，在穿刺針大小和穿孔數(shù)量等影響因素一致的情況下，盲腸結(jié)扎穿孔長度是膿毒癥嚴(yán)重程度的獨立決定因素；結(jié)扎距離大于盲腸長度的5%時（約0.3 cm）才開始出現(xiàn)死亡，膿毒癥嚴(yán)重程度及死亡率隨結(jié)扎長度增加而提高［5，34］。但也有學(xué)者提出，盲腸結(jié)扎長度對膿毒癥小鼠72 h 生存率無明顯影響，生存率取決于盲腸體積而不是長度。因?qū)嶒瀯游锏拿つc形狀不規(guī)則，盲腸長度在結(jié)扎穿刺過程中易發(fā)生變化，所以盲腸體積相對于長度來說能夠更精確地控制感染灶大?。?5］。

使用不同型號的針頭，小鼠7 d 死亡率也不同，18 G 為100%，21 G 為50%，25 G 為5%，膿毒癥的嚴(yán)重程度隨穿刺針頭直徑增加而加重。隨著穿刺針直徑增大和穿孔數(shù)增多，糞便流入腹腔的速度越快，感染越重。因此，實驗中通過把控盲腸結(jié)扎長度、穿刺針型號、穿孔數(shù)量等因素可能使CLP 模型的器官損傷、炎性反應(yīng)、死亡率等得到控制［36］。

4 結(jié)語

綜上所述，腹腔感染模型（如CLP）及注射外源性毒素模型（如注射LPS）是目前較為常用的膿毒癥病理生理機制研究模型。建立穩(wěn)定的動物模型的影響因素包括動物種類、品種品系、年齡、性別、輔助治療等。通過動物模型能夠系統(tǒng)研究膿毒癥期間許多炎性介質(zhì)、通路的作用以及阻止其產(chǎn)生、傳遞后的影響，但其臨床前模型的預(yù)測價值有限，可能與動物和人類對感染反應(yīng)程度不同、細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)相關(guān)性差、模型全身炎性反應(yīng)不重及未出現(xiàn)MODS 等因素有關(guān)。膿毒癥在中后期可出現(xiàn)長期免疫抑制狀態(tài)，這時的死亡率較高，應(yīng)為膿毒癥治療重點。目前，臨床前實驗研究尚缺乏針對膿毒癥致MODS 的病理生理過程及臨床特點的研究模型。有學(xué)者提出使用CLP 模型結(jié)合二次打擊模型，即最初的創(chuàng)傷或感染發(fā)作后誘導(dǎo)繼發(fā)感染，更接近臨床上膿毒癥晚期的實際免疫抑制狀態(tài)，有助于闡明CLP 改變免疫功能的機制。也可嘗試將嚴(yán)重疾病中出現(xiàn)的人類患者來源的病原體植入實驗小鼠，模擬關(guān)鍵宿主的病原體相互作用［37-38］。但這些研究成果尚未轉(zhuǎn)化為有效的新療法，期待在后續(xù)的模型研究中能實現(xiàn)評估膿毒癥治療新策略的突破。

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

李瀟提出文章思路，撰寫、修訂文章；顏海鵬對文章思路有重要建議，對文章框架及內(nèi)容作批評性審閱；肖政輝對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)性支持。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。