張黎杰，周玲玲，劉書(shū)華

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800）

關(guān)鍵字：黃花菜；銹病；病原菌；抗銹性

黃花菜（Hemerocallis citrina），又名金針菜，俗稱(chēng)金針花，百合科（Liliaceae）萱草屬（Hemerocallis）多年生草本植物，是我國(guó)多地重要的特色經(jīng)濟(jì)作物[1-2]。黃花菜古時(shí)被稱(chēng)為“忘憂(yōu)草”，作為食品和傳統(tǒng)藥品已有上千年歷史[3-5]。黃花菜有多種用途，其花型美麗，具有很高的觀賞價(jià)值；黃花菜的花蕾可食用，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；黃花菜含有黃酮類(lèi)、多糖、多酚類(lèi)、生物堿、皂苷等多種化學(xué)成分，據(jù)相關(guān)藥典記載，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁、催乳等多種藥用功能[6-8]。

黃花菜適應(yīng)能力強(qiáng)，在我國(guó)分布廣泛，野生種質(zhì)資源較多。從我國(guó)的湖南、河南到西北的甘肅及東北的黑龍江等地都有黃花菜種植區(qū)，山西大同、湖南祁東、甘肅慶陽(yáng)、寧夏鹽池、陜西大荔為我國(guó)黃花菜有名的五大產(chǎn)區(qū)[9]。從20世紀(jì)90年代以來(lái)，由黃花菜柄銹菌（Puccinia hemerocallidis）引起的黃花菜銹病，危害逐年加重，嚴(yán)重影響黃花菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，成為各黃花菜主產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的三大病害之一，極大地制約了黃花菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[10]。

目前，黃花菜銹病傳統(tǒng)的防治手段是化學(xué)防治，這種防治不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，也會(huì)對(duì)食品安全造成風(fēng)險(xiǎn)。此外，黃花菜柄銹菌具有多個(gè)生理小種且變異速度快，新的變異毒性小種會(huì)對(duì)化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗性，從而進(jìn)一步降低化學(xué)藥劑的防治效果[11]。因此，篩選、培育和利用黃花菜抗銹病品種是防治黃花菜銹病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，也是當(dāng)前生產(chǎn)中急需解決的重要問(wèn)題。本試驗(yàn)從黃花菜銹病病原菌鑒定入手，通過(guò)人工接種鑒定50份國(guó)內(nèi)黃花菜種質(zhì)資源的抗銹性，篩選抗銹種質(zhì)資源，以期為黃花菜抗銹品種選育提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

50份黃花菜種質(zhì)資源取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所黃花菜種質(zhì)資源圃，為各地收集的黃花菜種質(zhì)資源，包括栽培種和野生種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃花菜銹病樣本采集方法

黃花菜銹菌是轉(zhuǎn)主寄生銹菌，主要是通過(guò)夏孢子在黃花菜葉片上進(jìn)行繁殖并不斷侵染，而其冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生的擔(dān)孢子不會(huì)侵染黃花菜，因此，黃花菜銹病抗性鑒定需選用夏孢子的分離菌株進(jìn)行擴(kuò)繁鑒定，在銹病樣本的采集過(guò)程中，主要在各地區(qū)采集夏孢子樣本。于2018年和2019年的7—10月在甘肅、陜西、湖南、江蘇黃花菜主要產(chǎn)區(qū)，從發(fā)生銹病的黃花菜的病葉上采集樣本32份，標(biāo)注品種名稱(chēng)。采摘病斑不相連的新鮮病葉10片左右，采后展平夾入脫水紙或羊皮紙袋，讓病葉迅速脫水，注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、品種名稱(chēng)等（表1），用以觀察及測(cè)量夏孢子堆和夏孢子；2019年11月，再?gòu)慕K省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所的種質(zhì)資源圃中選取黃花菜銹病樣本1份（yx-30），觀察并測(cè)量其冬孢子堆和冬孢子。

表1 黃花菜銹病標(biāo)樣采集明細(xì)

1.2.2 銹病及病原菌形態(tài)觀察

對(duì)采集的銹病標(biāo)樣置于體視顯微鏡（徠卡EZ4W，德國(guó)）下觀察黃花菜柄銹菌夏孢子堆、冬孢子堆的病斑顯微結(jié)構(gòu)；通過(guò)倒置顯微鏡（徠卡DMi1，德國(guó)）觀察夏孢子和冬孢子形態(tài)，并進(jìn)行拍照與測(cè)量。

1.2.3 黃花菜銹病擴(kuò)繁接種方法

（1）培養(yǎng)：先將50份黃花菜的種苗定植于營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)品種3次重復(fù)，然后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持溫度25℃，濕度65%～70%，每天光照培養(yǎng)14 h，暗培養(yǎng)10 h。7 d左右，黃花菜可長(zhǎng)出新葉1～2片，即可接種。（2）保濕：接種前用噴壺噴水，營(yíng)養(yǎng)缽加蓋悶養(yǎng)罩，保濕4～8 h。（3）脫蠟：揭蓋用拇指反復(fù)摩擦黃花菜抽生出的新葉進(jìn)行脫蠟，動(dòng)作要輕，防止撕裂葉片。（4）摩擦：用海綿擦反復(fù)摩擦已脫蠟的黃花菜葉片，使葉片輕微受損。（5）霧化：用霧化加濕器霧化受損葉片表面，以不形成水滴為準(zhǔn)。（6）接種：刮取夏孢子堆上的夏孢子粉，直接涂抹在受損葉片上。（7）加濕：繼續(xù)霧化接種的黃花菜葉片表面。霧化接種好的黃花菜后，加蓋悶養(yǎng)罩。（8）培養(yǎng)：溫度28℃，濕度90%，每天光照培養(yǎng)14 h；溫度22℃，濕度85%，暗培養(yǎng)10 h。保濕48 h，打開(kāi)悶養(yǎng)罩通風(fēng)。接種7 d以后，開(kāi)始觀察接種情況，10 d后鑒定發(fā)病情況。經(jīng)前期菌株活性接種鑒定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)yx-26菌株的活性強(qiáng)、致病力高，因此，本試驗(yàn)選用該菌株作為測(cè)試菌株，參照表2接種黃花菜柄銹菌（yx-26）后進(jìn)行抗性等級(jí)鑒定。

表2 黃花菜銹病抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花菜柄銹菌夏孢子堆和夏孢子的形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)體視顯微鏡觀察了32份樣本的黃花菜柄銹菌夏孢子堆形態(tài)學(xué)特征（表3）：黃花菜柄銹菌的夏孢子堆多生于葉片背面，形成橘紅色或黃褐色皰斑，直徑0.28～1.96 mm（圖1）。初期定殖在葉片表皮下，不斷增生后，表皮破裂，夏孢子溢出隨氣流或雨水?dāng)U散。

圖1 黃花菜銹菌夏孢子堆顯微觀察（25×）

表3 黃花菜柄銹菌夏孢子形態(tài)學(xué)觀察及測(cè)量

黃花菜柄銹菌夏孢子形態(tài)學(xué)特征（圖2）：夏孢子近圓形或橢圓形，黃色、單胞，大小為（16.0～21.5）μm×（17.2～32.4）μm，壁厚1～3 μm，孢子內(nèi)有數(shù)個(gè)黃色圓泡，也有全部溶解在一起的圓泡；有的圓泡伸長(zhǎng)變尖，液泡黃色且向周邊擴(kuò)散，逐漸變透明；后期開(kāi)始伸長(zhǎng)變尖，形狀逐漸不規(guī)則，黃色圓泡逐漸褪色。

圖2 黃花菜銹菌夏孢子顯微觀察（600×）

2.2 黃花菜柄銹菌冬孢子堆和冬孢子的形態(tài)學(xué)鑒定

黃花菜柄銹菌yx-30冬孢子堆的顏色是在夏孢子堆的基礎(chǔ)上變深，形成深褐色，呈絮狀（圖3）。黃花菜柄銹菌冬孢子：橢圓形、棒狀，黃色，雙細(xì)胞，中間有縊縮，形似葫蘆，比萱草冬孢子略大偏長(zhǎng)，大小為（68.0～81.0）μm×（19.4～22.2）μm，孢囊柄長(zhǎng)11～16 μm（圖4）。

2.3 黃花菜品種抗性鑒定

人工接種黃花菜銹病yx-26菌株10 d后（圖5），對(duì)我國(guó)不同地區(qū)收集的50份黃花菜種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定，按照表2對(duì)黃花菜銹病yx-26菌株的抗性等級(jí)進(jìn)行發(fā)病等級(jí)綜合鑒定。結(jié)果表明，四月白、茄子花、茶子花、小黃殼、秋八尺等11個(gè)品種對(duì)yx-26菌株表現(xiàn)為高抗；大烏嘴、長(zhǎng)泰、十八格、渠縣花、臺(tái)東6號(hào)、高山1號(hào)等21個(gè)品種表現(xiàn)為中抗；四月花、五月花、青沖、大同黃花、徐州黃花8個(gè)品種表現(xiàn)為感?。获R蘭花、沙苑花、猛子花、長(zhǎng)嘴子花、線黃花、白花等10個(gè)品種表現(xiàn)為高感（表4）。

表4 國(guó)內(nèi)黃花菜品種抗銹性鑒定

圖5 接種銹菌14 d后不同抗感類(lèi)型

3 結(jié)論與討論

黃花菜柄銹菌屬于“轉(zhuǎn)主寄生型”，病菌需要在黃花菜、敗醬草2種不同的寄主上完成全部生活史，而在黃花菜上只產(chǎn)夏孢子堆和冬孢子堆[12-13]。本試驗(yàn)通過(guò)顯微結(jié)構(gòu)觀察到銹病病原菌的兩種形態(tài)。通過(guò)對(duì)32份銹病樣本的夏孢子堆和夏孢子進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)這些樣本的夏孢子堆形態(tài)特征基本相似，但夏孢子形態(tài)大小略有差別。至于銹病發(fā)生的夏孢子階段為什么夏孢子堆會(huì)呈現(xiàn)橘紅色或黃褐色皰斑，本試驗(yàn)通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)夏孢子內(nèi)有數(shù)個(gè)黃色圓泡，這些黃色圓泡呈不同形態(tài)分散在夏孢子內(nèi)，可能是夏孢子堆呈現(xiàn)為黃色或橘色的原因。

國(guó)外學(xué)者M(jìn)UELLER等[14]和BUCK[15]對(duì)萱草進(jìn)行人工接種鑒定的方法獲得一些抗源材料，國(guó)內(nèi)學(xué)者張瑞陽(yáng)等[10]和邱亨池等[11]只是通過(guò)田間觀測(cè)，調(diào)查黃花菜的抗銹水平。本試驗(yàn)利用人工接種方法鑒定黃花菜種質(zhì)資源抗性水平，對(duì)我國(guó)黃花菜種質(zhì)資源的抗銹性進(jìn)行了科學(xué)評(píng)估，并對(duì)人工接種黃花菜柄銹菌接種擴(kuò)繁的方法進(jìn)行優(yōu)化。因?yàn)辄S花菜柄銹菌屬于活體寄生菌，幾乎無(wú)法進(jìn)行人工培養(yǎng)，所以如何能夠?qū)ⅫS花菜柄銹菌接種到黃花菜植株上，是本試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。本試驗(yàn)在參考了李振岐等[16]小麥銹菌接種方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)黃花菜柄銹菌接種方法的反復(fù)試驗(yàn)優(yōu)化，認(rèn)為濕度保持是黃花菜柄銹菌接種成功的關(guān)鍵，即接種前的保濕、接種時(shí)的霧化和接種后的加濕，因此本試驗(yàn)形成了培養(yǎng)、保濕、脫蠟、摩擦、霧化、接種、加濕、培養(yǎng)的規(guī)范工藝操作流程，大大提高了黃花菜柄銹菌的接種成功率。利用該方法接種黃花菜柄銹菌來(lái)判斷黃花菜品種的抗銹性，只需要15 d左右的時(shí)間，相比田間鑒定，具有培養(yǎng)條件可控、鑒定周期短、成本低、速度快、準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)。

從品種上來(lái)看，50份黃花菜種質(zhì)資源中，抗病品種11份、中抗品種21份、感病品種8份、高感品種10份，中抗以上抗病品種占所有品種的3/5（32份），感及以下材料占1/3（18份），說(shuō)明我國(guó)黃花菜抗病品種資源比較豐富。徐州紅花、新疆引、金菇花、野生種4個(gè)品種是紅花品種，但均是抗銹病品種；黃鶴樓是重瓣品種，也是抗病品種；其余45份是黃花品種，只有四月白、茶子花、茄子花、小黃殼、秋八尺、黃花6個(gè)品種是抗病品種，說(shuō)明紅花品種和重瓣品種較黃花品種更抗銹病。

從地區(qū)來(lái)看，不同地區(qū)主栽品種對(duì)黃花菜的抗銹性是不同的，有些地區(qū)的主栽品種雖品質(zhì)優(yōu)但不抗銹病，如湖南祁東的主栽品種猛子花、沖里花，山西大同的黃花，陜西渭南的沙苑花，甘肅慶陽(yáng)的馬蘭花和線黃花；有些地區(qū)的主栽品種是抗病的，如江蘇宿豫的大烏嘴；但每個(gè)地區(qū)也有其他非主栽的抗銹品種可供選擇，如湖南的四月白、茶子花、茄子花，甘肅的馬蓮黃花等。本試驗(yàn)今后將對(duì)各地區(qū)黃花菜栽培品種的合理選擇和規(guī)劃進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步為各單位開(kāi)展黃花菜抗銹病育種提供科學(xué)依據(jù)。此外，不同黃花菜柄銹菌的致病力不同，而且同一黃花菜對(duì)不同生理小種的抗性表現(xiàn)也不同，本試驗(yàn)只是利用yx-26分離株對(duì)50份黃花菜種質(zhì)資源的抗性進(jìn)行了初步鑒定，后續(xù)試驗(yàn)還應(yīng)該對(duì)銹菌菌株進(jìn)行生理小種分類(lèi)鑒定和毒力測(cè)定，再對(duì)黃花菜種質(zhì)資源抗銹性進(jìn)行綜合評(píng)判。