湯榕津，劉浩然，劉丁丁，張晨禹，龔洋，葉圓圓，陳杰丹，陳亮，馬春雷*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

茶樹(shù)是我國(guó)傳統(tǒng)木本葉用經(jīng)濟(jì)作物，在長(zhǎng)期的自然選擇及人工繁育下發(fā)生了豐富的表型變異，現(xiàn)有的種質(zhì)資源從外形到生化成分等方面各具特色。其中，茶樹(shù)葉色白化突變類型豐富，其研究范圍涵蓋了生理生化、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等多方面。以前的研究表明，茶樹(shù)葉片的白化常常伴隨著葉綠體發(fā)育缺陷現(xiàn)象的發(fā)生，如葉綠體內(nèi)部空泡化，缺乏類囊體片層等，但大多數(shù)茶樹(shù)資源的葉綠體在特定條件下又可恢復(fù)正常[1]。以茶樹(shù)白化葉片與返綠葉片為材料的研究中，轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)基因主要富集于光合作用、葉綠素、活性氧清除等代謝通路[2-4]；而代謝組所獲得的差異代謝物則主要參與了碳水化合物代謝、氨基酸代謝、次級(jí)代謝物合成等通路[5-6]。但白化突變的形成機(jī)理實(shí)際上十分復(fù)雜，除了與葉綠體的異常發(fā)育或葉綠素合成、降解相關(guān)途徑的基因突變有關(guān)之外，核質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控以及表觀遺傳的作用等均有可能引起植株的白化表型[7]。葉色白化突變體在自然界中是較為常見(jiàn)的變異類型，但其他組織或器官出現(xiàn)白化的情況仍較少見(jiàn)，僅少量研究提及玉米籽粒[8]、大麥穎殼[9]、甘藍(lán)形油菜角果[10]和甘藍(lán)種莢[11]的特異性白化。

本課題組在國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃保存的眾多葉色變異資源中發(fā)現(xiàn)了一份葉色呈現(xiàn)出非純色系白化、果皮呈現(xiàn)白色表型的珍貴特異資源——云白1號(hào)，其種子播種后仍可正常發(fā)育，且一年生幼苗未出現(xiàn)任何白化或其他生長(zhǎng)缺陷現(xiàn)象。在茶樹(shù)中，有關(guān)果皮白化的表型目前未能查閱到相關(guān)報(bào)道，為進(jìn)一步探討白化果皮的形成原因，本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)云白1號(hào)、中茶129的果皮、種子進(jìn)行分析，比較兩個(gè)茶樹(shù)品種的不同組織在轉(zhuǎn)錄層面的差異，以期為深入研究白化果皮的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2020年8月上旬在國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃采集云白1號(hào)（YB1）和中茶129（ZC129）的一芽二葉新梢（圖1-A、E）和已成熟的果實(shí)（圖1-B、F），將采集到的果實(shí)剝開(kāi)，留取新鮮果皮組織和種子分別保存，部分果皮切片后放于固定液中保存，用于后續(xù)超微結(jié)構(gòu)的觀察；其余組織用液氮迅速固定并置于-80℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

圖1 中茶129、云白1號(hào)果皮細(xì)胞在不同放大倍數(shù)下的超微結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Ultrastructure of pericarp cells of ‘Zhongcha 129’ and ‘Yunbai 1’ at different magnification

1.2 透射電鏡掃描果皮結(jié)構(gòu)

將果皮切成1 mm×1 mm左右的組織薄片后放入電鏡固定液進(jìn)行前固定，之后組織薄片經(jīng)漂洗、后固定、室溫脫水、滲透包埋、聚合等步驟制成樹(shù)脂塊，使用超薄切片機(jī)切片。切片經(jīng)染色、清洗、干燥等步驟后，放置于透射電子顯微鏡下采集果皮超微結(jié)構(gòu)圖像。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.3.1 文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序及比對(duì)

每個(gè)樣本設(shè)置 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，使用Trizol試劑盒提取總RNA，對(duì)純度、濃度等進(jìn)行檢測(cè)后富集帶有 polyA結(jié)構(gòu)的高質(zhì)量mRNA，采用隨機(jī)引物對(duì)片段化后的 mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，初步構(gòu)建 cDNA文庫(kù)。此后經(jīng)PCR富集、片段篩選、質(zhì)量檢測(cè)、混合稀釋、堿變性等步驟建立單鏈文庫(kù)。在 Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序，去除原始下機(jī)數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量或含有接頭的 reads，將獲得的高質(zhì)量reads比對(duì)至舒茶早茶樹(shù)染色體級(jí)別參考基因組[12]，得到BAM文件。

1.3.2 差異表達(dá)基因的篩選及富集分析

使用HTSeq軟件將BAM文件比對(duì)至參考基因組的結(jié)構(gòu)注釋文件，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到每一個(gè)基因上Read count值，作為基因的原始表達(dá)量，采用FPKM對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用DESeq軟件分析基因的差異表達(dá)，以表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|＞1，P＜0.05 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。以整個(gè)基因組為背景，采用BinGO、R語(yǔ)言、TBtools分別繪制GO柱狀圖、KEGG氣泡圖、表達(dá)倍數(shù)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)的表型及果皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在中茶129和云白1號(hào)果皮的超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖中發(fā)現(xiàn)（圖1），兩者的葉綠體分布情況以及生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，中茶129的綠色果皮細(xì)胞中僅具有少數(shù)葉綠體，其基粒和基粒片層均尚未形成，處于發(fā)育初期，分布于細(xì)胞壁附近（圖1-C，1-D）。相比而言，云白1號(hào)白色果皮細(xì)胞中的質(zhì)體內(nèi)部高度空泡化，缺乏類囊體和基粒等結(jié)構(gòu)，不存在正在發(fā)育或發(fā)育成熟的葉綠體（圖1-G，1-H），這與擬南芥pds3白化突變體[13]、中茶108白化芽變枝條[14]葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)類似，可能意味著云白1號(hào)果皮細(xì)胞中的前質(zhì)體失去正常分化功能，無(wú)法進(jìn)一步形成葉綠體。因此，云白1號(hào)果皮白化表型的產(chǎn)生與其細(xì)胞內(nèi)質(zhì)體階段的發(fā)育缺陷密切相關(guān)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

測(cè)序結(jié)果表明，18個(gè)文庫(kù)的 clean reads比率、Q30均大于 92%（表1），說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量良好。果皮和新梢的clean reads比對(duì)至參考基因組的百分比較高，均達(dá)到87%以上，說(shuō)明這兩個(gè)樣本的測(cè)序質(zhì)量良好；而種子的比對(duì)率則處于67.51%～78.01%，這可能是種子組織作為茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組的研究材料具有一定的特殊性，數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏充分的參考信息所致。

表1 測(cè)序質(zhì)量及參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 1 The statistics of sequencing data and mapping data

2.3 轉(zhuǎn)錄組樣本的主成分分析

對(duì)18個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量信息進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）與聚類分析（圖2），結(jié)果顯示，第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為43.583%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為28.212%，各樣品的重復(fù)性較好，且按照樣本組織類別兩兩相互聚集，而非按照品種類別區(qū)分開(kāi)來(lái)。這表明兩個(gè)主成分所代表的各組織之間的轉(zhuǎn)錄本信息差距大于兩個(gè)品種相同組織之間的轉(zhuǎn)錄本信息差距，反映了茶樹(shù)的組織特異性，推測(cè)與相同組織中的基因執(zhí)行相似的生物學(xué)功能有關(guān)。同時(shí)，此聚類結(jié)果也意味著不同品種的相同組織之間的轉(zhuǎn)錄組比較能夠在一定程度上減少與目標(biāo)表型無(wú)關(guān)的信息噪音，提高樣本比較的可信度。因此，本研究以不同果皮、不同種子作為差異組合，分析組合間的基因表達(dá)差異。

圖2 18個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組PCA得分Fig. 2 Expression data of 18 transcriptome sample analyzed by PCA

2.4 差異表達(dá)基因分析

對(duì)果皮和種子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行差異表達(dá)分析并繪制火山圖（圖3），結(jié)果顯示，云白1號(hào)和中茶129果皮之間的差異基因數(shù)目較多，一共篩選出7 537個(gè)，其中上調(diào)的基因?yàn)? 616個(gè)，包含云白1號(hào)果皮中特異表達(dá)的基因508個(gè)；下調(diào)的基因?yàn)? 921個(gè)，包含中茶 129果皮中特異表達(dá)的基因 639個(gè)（圖3-A）。種子之間的差異基因數(shù)目較少，僅篩選出2 612個(gè)，其中上調(diào)的基因?yàn)? 233個(gè)，包括在云白1號(hào)種子中特異表達(dá)的基因137個(gè)；下調(diào)的基因?yàn)? 379個(gè)，包括在中茶129種子中特異表達(dá)的基因 179個(gè)（圖3-B）。與中茶129相比，云白1號(hào)的果皮以及種子的下調(diào)基因數(shù)目較多，特異性表達(dá)的基因數(shù)目較少，這部分差異基因的表達(dá)模式可能與白化果皮的形成有所關(guān)聯(lián)。

圖3 差異基因火山圖Fig. 3 The volcano plots of DEGs

2.5 GO富集分析

為進(jìn)一步研究差異基因涉及的生物學(xué)功能，將中茶129與云白1號(hào)的果皮差異基因與種子差異基因分別進(jìn)行了GO功能富集分析。結(jié)果顯示，果皮差異基因在細(xì)胞組分類別中主要富集在與葉綠體、質(zhì)體相關(guān)的功能條目中；在生物學(xué)過(guò)程類別中差異基因主要參與有機(jī)酸代謝過(guò)程與小分子代謝過(guò)程；在分子功能類別中，差異基因的功能主要與催化活性相關(guān)（圖4-A）。其中，質(zhì)體相關(guān)功能條目中共富集了269個(gè)上調(diào)基因及327個(gè)下調(diào)基因，這些基因主要參與了光合作用、有機(jī)酸代謝、胺生物合成代謝、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程。說(shuō)明相比于綠色果皮，白化果皮中的光合作用、碳代謝及氮代謝通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了較大的變化，這與果皮超微結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果相符，推測(cè)這一結(jié)果可能是由于白化果皮中呈現(xiàn)異常狀態(tài)的質(zhì)體未能進(jìn)一步形成具有完整結(jié)構(gòu)的葉綠體，使得多數(shù)在葉綠體被膜或類囊體膜上裝載或在葉綠體內(nèi)部行使功能的基因無(wú)法正常表達(dá)而導(dǎo)致的。

圖4 差異表達(dá)基因的GO分析Fig. 4 GO analysis of differentially expressed genes

中茶129與云白1號(hào)種子轉(zhuǎn)錄組GO分析表明（圖4-B），差異基因主要顯著富集在生物學(xué)過(guò)程和分子功能下的氧化還原過(guò)程及氧化還原酶活性條目中，在該條目中植物組織抗氧化相關(guān)的基因如編碼谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶合成、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶合成的基因表達(dá)上調(diào)十分明顯。此外，屬于分子功能的條目大多與離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，表明云白1號(hào)的離子運(yùn)輸方式發(fā)生了改變。在所有離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中，與鎘離子相關(guān)的通路所富集的基因數(shù)目最多，其中包含與植物應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的調(diào)控基因如親環(huán)素編碼基因，受植物激素及鎘離子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子MYB59等，這些基因的表達(dá)量均顯著上升。而為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供必要硫化物的硫酸鹽同化途徑關(guān)鍵酶 ATP-硫化酶的編碼基因表達(dá)量則明顯下降，這些變化趨勢(shì)表明在云白 1號(hào)種子內(nèi)與脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的代謝過(guò)程與中茶129種子存在較大差異。

2.6 KEGG富集分析

KEGG的富集分析顯示（圖5-A），相比于中茶129，在云白1號(hào)果皮中上調(diào)的差異基因主要富集于氨基酸代謝，碳水化合物代謝，半乳糖代謝，谷胱甘肽代謝，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代謝通路中；下調(diào)的差異基因顯著富集于光合器官的碳固定，光合作用蛋白，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，光合作用，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等通路中。這些通路中富集的差異基因主要在質(zhì)體/葉綠體中發(fā)揮功能，不僅參與了光合作用有關(guān)的通路，還參與了在質(zhì)體/葉綠體中發(fā)生的氨基酸代謝、碳代謝等初級(jí)代謝過(guò)程，這些基因的差異表達(dá)極可能與云白1號(hào)質(zhì)體發(fā)育的停滯相關(guān)。

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Fig. 5 The KEGG pathway analysis of DEGs

種子差異基因的KEGG富集結(jié)果顯示（圖5-B），云白1號(hào)種子中上調(diào)的差異基因富集于核糖體，萜類、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，丙酮酸代謝，糖酵解/糖異生等通路；下調(diào)的差異基因富集于β-丙氨酸代謝，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝，甘油酯代謝等通路。茶樹(shù)種子含油率較高，其生命歷程與油料種子相似，常以三酰甘油作為高效儲(chǔ)能形式為萌發(fā)提供必要的碳骨架和能量[15]。一旦種子萌發(fā)的信號(hào)觸發(fā)，三酰甘油將經(jīng)脂肪酸降解途徑轉(zhuǎn)變?yōu)檎崽?，為組織器官的生長(zhǎng)分化提供碳源及能量。因此，差異基因所富集的通路可能反映了云白1號(hào)與中茶129種子在生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程上的不一致。

2.7 差異基因在KEGG通路中的表達(dá)量分析

2.7.1 果皮中與光合作用相關(guān)的差異基因

在光反應(yīng)中（圖6），光合天線蛋白、光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ、光合電子傳遞鏈以及ATP合成酶的相關(guān)調(diào)控基因大多在云白 1號(hào)果皮內(nèi)下調(diào)表達(dá)，這些基因編碼的蛋白包括了捕光色素葉綠素a/b結(jié)合蛋白（Light harvesting chlorophyll a/b binding protein，LHC）、鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶（Ferredoxin-NADP+oxidoreductase，F(xiàn)NR）以及 ATP合成酶亞基蛋白等。光合天線蛋白是光反應(yīng)中不可或缺的部件，LHC表達(dá)量的下調(diào)將阻礙光能在類囊體中的吸收和傳遞，而FNR和ATP合成酶所產(chǎn)生的同化力可直接用于暗反應(yīng)的卡爾文循環(huán)，兩者調(diào)控基因的下調(diào)則意味著碳固定過(guò)程產(chǎn)生了一定的變化。

而在卡爾文循環(huán)中（圖6），上調(diào)的基因主要編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，RCA）、磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase，PGK），這些酶均處于卡爾文循環(huán)的初始反應(yīng)階段；下調(diào)的基因則主要參與編碼卡爾文循環(huán)的中間酶，例如3-磷酸甘油醛脫氫酶A/B（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A/B，GAPA/B）、5-磷酸核糖異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶以及轉(zhuǎn)酮酶等；在非綠色質(zhì)體中調(diào)控3-磷酸甘油醛脫氫酶合成相關(guān)的基因則存在兩種相反的表達(dá)模式。RCA、PGK是卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，在多數(shù)情況下受非生物脅迫的刺激而提升表達(dá)量用以維持植物的碳同化速率，云白1號(hào)果皮中這兩個(gè)酶有關(guān)的基因表達(dá)倍數(shù)的提升可能說(shuō)明了白化果皮正處于抵抗脅迫的狀態(tài)中。

2.7.2 種子中的β-氧化途徑相關(guān)的差異基因

云白1號(hào)和中茶129種子的差異基因在脂肪酸降解途徑中顯著富集，β-氧化是脂肪酸降解的主要途徑，其產(chǎn)物乙酰輔酶 A可為糖異生和三羧酸循環(huán)提供底物，因此脂肪降解途徑對(duì)種子的生長(zhǎng)發(fā)育意義重大。脂肪酸在進(jìn)入降解途徑前，需要經(jīng)過(guò)?；o酶 A合成酶的活化后進(jìn)入β-氧化途徑（圖7），而呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)模式的長(zhǎng)鏈酰基輔酶 A合成酶極可能刺激β-氧化循環(huán)中一系列基因表達(dá)量的調(diào)整變化，導(dǎo)致長(zhǎng)鏈脂肪酸降解過(guò)程發(fā)生異常。此外，β-氧化循環(huán)的限速酶酰基輔酶 A氧化酶、參與反應(yīng)第二三步驟的多功能蛋白以及直接催化乙酰輔酶A生成的3-酮脂酰-CoA硫解酶等基因表達(dá)量均存在一定變化，這可能意味著云白1號(hào)種子中的油脂組成發(fā)生了改變。

圖7 種子差異基因在脂肪酸降解途徑中的表達(dá)情況Fig. 7 The expressions of DEGs of pericarps in the pathway of fatty acid degradation

3 討論

白化突變體的產(chǎn)生大多與葉綠體的非正常發(fā)育有關(guān)，如擬南芥白化突變體的超微結(jié)構(gòu)顯示，葉綠體缺乏基質(zhì)和垛疊的類囊體片層，且其內(nèi)部高度空泡化，聚集了大量球狀結(jié)構(gòu)[16]；玉米光合突變體的葉綠體則存在類囊體發(fā)育不全、片層結(jié)構(gòu)松散的情況[17]；茶樹(shù)白化葉片的葉綠體有體積膨大、類囊體片層缺乏或松散、內(nèi)部空泡化或具有不同程度的降解等現(xiàn)象[18-19]。本研究通過(guò)透射電鏡觀察果皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)綠色果皮細(xì)胞中僅有少數(shù)葉綠體附著于細(xì)胞壁，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)雖然還未發(fā)育完全，但是處于正常的生長(zhǎng)階段；而白化果皮細(xì)胞不存在處于生長(zhǎng)發(fā)育階段或已發(fā)育成熟的葉綠體，其內(nèi)部?jī)H觀測(cè)到高度空泡化的質(zhì)體，這與葉色完全白化突變體的研究結(jié)果相似[13-14]，表明云白 1號(hào)果皮細(xì)胞中的質(zhì)體在發(fā)育的某一個(gè)階段產(chǎn)生停滯、降解，失去形成葉綠體的功能，因而產(chǎn)生特殊的白化表型。

葉綠體是光合作用的主要場(chǎng)所，光反應(yīng)和暗反應(yīng)能為碳代謝和氮代謝提供基本能量和有機(jī)物質(zhì)，碳代謝所生成的中間產(chǎn)物酮酸同時(shí)也為葉綠體中谷氨酸轉(zhuǎn)化成其他氨基酸提供了碳骨架。在茶樹(shù)葉色白化突變體中，異常發(fā)育或嚴(yán)重降解的葉綠體導(dǎo)致光合作用無(wú)法正常運(yùn)轉(zhuǎn)，而光合碳固定的削弱（碳饑餓）會(huì)促使碳-氮代謝的重新平衡，因此相較于正常的綠色品種，白化葉片中的有機(jī)酸和氨基酸會(huì)存在一定程度的積累[20-21]，這也在果皮差異基因的 GO富集和 KEGG富集結(jié)果中得以體現(xiàn)。在白化果皮中，與PSⅡ的光損傷蛋白質(zhì)修復(fù)、類囊體形成相關(guān)的基因FTSH1、FTSH2的表達(dá)量上調(diào)，參與光反應(yīng)的基因LHC、FNR、PSA、PSB的表達(dá)量下調(diào)，LHC負(fù)責(zé)吸收、轉(zhuǎn)移光能至光反應(yīng)中心，是光系統(tǒng)復(fù)合物的重要組成部分，其調(diào)控基因的下調(diào)意味著光能吸收傳遞過(guò)程受阻，長(zhǎng)期可能會(huì)造成葉綠體內(nèi)部活性氧的積累，干擾葉綠體的正常發(fā)育[22]。在光反應(yīng)中，F(xiàn)NR是催化線性電子傳遞的最后一步，其主要功能是轉(zhuǎn)移電子將 NADP+還原為NADPH，為CO2固定提供還原力。因此，F(xiàn)NR的下調(diào)會(huì)直接影響光合作用，從而導(dǎo)致光合碳固定效率的降低[23-24]。RCA、PGK、GAPA/B是卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，其中RCA同時(shí)參與了暗反應(yīng)和光呼吸兩個(gè)代謝路徑，能夠根據(jù)CO2/O2的濃度比值調(diào)整羧化、還原反應(yīng)，對(duì)凈光合速率有著重要的影響[25]；PGK、GAPA/B分別消耗來(lái)自光反應(yīng)的ATP和NAPDH，催化3-磷酸甘油酸生成凈光合產(chǎn)物3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛可經(jīng)過(guò)一系列的后續(xù)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為淀粉、蔗糖或脂肪，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供基本物質(zhì)[26]。在云白1號(hào)果皮中參與卡爾文循環(huán)的大多數(shù)基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生了變化，而RCA、PGK上調(diào)、GAPA/B下調(diào)則可能是白化果皮抵抗脅迫，維持光合碳同化效率的策略。

種子處于植物生命生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)初始階段，涉及能量的儲(chǔ)存轉(zhuǎn)化或物質(zhì)的協(xié)調(diào)分配，因此，中茶129和云白1號(hào)種子的差異基因在碳代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝等初級(jí)代謝通路中有著更為明顯的富集。脂質(zhì)是茶樹(shù)種子儲(chǔ)藏能量的高效形式，種子發(fā)芽前，源器官如葉片、果皮的光合產(chǎn)物蔗糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至種子細(xì)胞中，經(jīng)糖酵解等過(guò)程轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，為脂肪酸的合成提供前體物質(zhì)；發(fā)芽時(shí)，種子中儲(chǔ)存的脂質(zhì)則將經(jīng)β-氧化、乙醛酸循環(huán)、糖異生等途徑轉(zhuǎn)變成蔗糖的形式，為即將生長(zhǎng)分化的其他組織器官提供碳源。在蓖麻和油茶種子中，蔗糖與油脂呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，且兩者的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系在一定程度上反映著種子所處的生長(zhǎng)發(fā)育階段[27-28]。本研究中，云白1號(hào)和中茶 129種子的脂肪酸合成代謝通路中的基因在表達(dá)量上并無(wú)差異，但云白1號(hào)的種子中β-氧化、乙醛酸/二羧酸循環(huán)、糖酵解/糖異生代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中乙醛酸循環(huán)的差異基因以下調(diào)為主，糖酵解/糖異生的差異基因則以上調(diào)為主，表明云白1號(hào)種子中的脂肪酸降解過(guò)程不如中茶 129旺盛。因此，在云白1號(hào)中，用于供應(yīng)種子生長(zhǎng)發(fā)育的能量要低于中茶129，但如果云白1號(hào)用于合成脂肪酸前體所需的蔗糖得到了充足供應(yīng)，則能在一定程度上滿足其種子后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育的需求。

綠色果皮細(xì)胞內(nèi)含有葉綠體，同樣也能進(jìn)行光合作用，屬于非葉光合器官。在甘藍(lán)型油菜和油菜中，其綠色角果同樣可作為源器官向庫(kù)器官（主要為種子）供應(yīng)光合同化物，角果的不良發(fā)育會(huì)對(duì)種子的含油量、粒重等生理指標(biāo)產(chǎn)生較大影響[10,29]。然而在大麥中，其穎殼的白化并不會(huì)導(dǎo)致大麥的結(jié)實(shí)率降低和抗病性減弱，但會(huì)在一定程度上影響籽粒干物質(zhì)的積累[9]；此外，甘藍(lán)種莢白化突變體可產(chǎn)生少量種子，屬于非致死突變[11]。實(shí)際上，葉片是光合作用的主要器官，可作為源器官直接向庫(kù)器官比如種子提供光合同化物，用于滿足種子的基本生長(zhǎng)發(fā)育需求，因此果皮的白化并不意味著種子喪失了發(fā)芽的能力[30]。蔗糖作為光合作用的主要產(chǎn)物，其分解代謝在碳資源、能量的協(xié)調(diào)分配中發(fā)揮重要作用，其中，蔗糖合酶（Sucrose synthase，SUS）、轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）是蔗糖分解代謝的關(guān)鍵酶[31]。SUS可調(diào)控光合同化物從源器官向庫(kù)器官的轉(zhuǎn)運(yùn)，在種子發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫等過(guò)程中發(fā)揮著不可忽視的作用[32]；INV催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，可維持細(xì)胞滲透壓，并調(diào)節(jié)蔗糖在植物體中的運(yùn)輸裝載[33]，其活性的缺失會(huì)降低光合作用的水平，減少庫(kù)器官的庫(kù)強(qiáng)[34]。在本研究中，INV的調(diào)控基因在云白 1號(hào)的種子中特異表達(dá)、SUS相關(guān)編碼基因的表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明蔗糖分解代謝在云白1號(hào)種子中的活性較高，可能是為了滿足種子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存需求，維持其正常生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。因此，盡管茶樹(shù)白化果皮在轉(zhuǎn)錄水平上的異常變化可能會(huì)對(duì)種子不利，導(dǎo)致種子的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制出現(xiàn)調(diào)控差異造成生理指標(biāo)等方面的變化，但并不一定會(huì)影響種子的發(fā)芽能力。為了深入了解白化果皮的遺傳特性，本課題組對(duì)云白1號(hào)的種子進(jìn)行了播種繁育，目前已獲得健康的一年生幼苗，說(shuō)明云白1號(hào)種子具有正常的生長(zhǎng)活力。此外，表型觀察發(fā)現(xiàn)，所有一年生幼苗均未出現(xiàn)任何白化變異，初步推測(cè)云白1號(hào)的白化現(xiàn)象可能是由隱性基因控制。由于茶樹(shù)的自交不親和性，云白1號(hào)接觸外界綠色茶樹(shù)植株傳遞而來(lái)的花粉時(shí)，其控制白化果皮的基因在子代中大概率為雜合基因，因而云白1號(hào)子代果皮表型呈現(xiàn)出綠色的表型，但相關(guān)推測(cè)需通過(guò)進(jìn)一步的表型觀察與雜交試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。