程思遠(yuǎn) 韓子翰 郭曉歡 沈琳 綜述 彭智 審校

以程序性死亡受體(Programmed cell death-1，PD-1)及其配體(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑(Immune checkpoint inhibitors，ICIs)革命性地改變了腫瘤的內(nèi)科治療方式。與化療作用機(jī)制不同，PD-1/PD-L1通路屬于腫瘤免疫逃逸通路，PD-1常表達(dá)于活化的CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)其配體PD-L1和PD-L2，與PD-1結(jié)合后，抑制宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與殺傷。PD-1/PD-L1單抗抑制通路的激活，可恢復(fù)宿主免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷功能。其他免疫檢查點(diǎn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、T細(xì)胞免疫球蛋白-3(T cell immunoglobulin-3，TIM-3)和淋巴細(xì)胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3，LAG-3)等也有相應(yīng)的抑制劑上市或在研，其中PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA-4抑制劑是目前臨床應(yīng)用較為廣泛的ICIs。

免疫耐藥是限制患者取得免疫治療臨床獲益的主要原因。導(dǎo)致免疫耐藥的具體機(jī)制尚不清楚。腸道菌群是哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物等微生物的總稱。近年來，隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，對菌群的研究及認(rèn)識(shí)也愈發(fā)深入。腸道菌群可以通過多種方式影響宿主免疫狀態(tài)，因此與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療應(yīng)答等密切相關(guān)。自2017年起，多項(xiàng)研究顯示腸道菌群組成狀態(tài)在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等癌種中與ICIs治療療效相關(guān)(表1)。本文將對該領(lǐng)域近2年關(guān)鍵性的研究進(jìn)展及相關(guān)不足進(jìn)行系統(tǒng)性綜述，以期為后續(xù)相關(guān)研究提供一定的幫助。

表1 腸道菌群與腫瘤免疫治療療效主要研究結(jié)果總結(jié)

1 腸道菌群及代謝產(chǎn)物可用于預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效

1.1 腸道菌群組成狀態(tài)可以預(yù)測胃腸道腫瘤免疫治療療效

胃腸道是腸道菌群賴以寄生的環(huán)境，原發(fā)于胃腸道的腫瘤破壞了這一寄生環(huán)境，腸道菌群組成狀態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為腸道菌群多樣性的增加及以擬桿菌屬為代表的一些菌株豐度增加[1-2]。因此，菌群對宿主免疫的調(diào)控也更加復(fù)雜，這可能是胃腸道腫瘤免疫治療整體療效不佳的原因之一。北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院團(tuán)隊(duì)的研究首次證實(shí)了腸道菌群狀態(tài)與免疫治療療效有關(guān)。隊(duì)列共納入了74例胃腸道腫瘤患者(包括食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌等)?？傮w而言，普氏菌屬/擬桿菌屬的比值與免疫治療獲益呈正相關(guān)。在一個(gè)特定的治療應(yīng)答亞組中，普氏菌、瘤胃球菌和毛螺菌豐度顯著增加。核苷和核苷酸生物合成、脂質(zhì)生物合成、糖代謝和短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFA)發(fā)酵相關(guān)的通路在不同療效的患者中存在差異?；诰簻y序數(shù)據(jù)，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的療效預(yù)測模型體現(xiàn)了良好的療效預(yù)測價(jià)值[3]，提示腸道菌群是較為可靠的腫瘤免疫治療療效預(yù)測生物標(biāo)記物。

1.2 嗜粘蛋白艾克曼氏菌(Akkermansia muciniphila，Akk)與非小細(xì)胞肺癌免疫治療療效

Akk是近幾年十分熱門的“新型益生菌”，尤其是在非小細(xì)胞肺癌患者中，Akk與免疫治療的關(guān)系似乎更為密切。回顧性研究顯示Akk在非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌患者中與更好的免疫治療療效相關(guān)，Akk相對豐度高的患者更易取得免疫治療獲益[4]。一項(xiàng)前瞻性研究顯示[5]，在接受一線或二線免疫治療的非小細(xì)胞肺癌患者中(n=338)，與Akk未檢出組(Akk-)相比(n=207)，Akk檢出組(Akk+)(n=131)的客觀緩解率(28%vs.18%，P=0.04)和總生存期(18.8vs.15.4個(gè)月，HR=0.72，95%CI：0.73～1.62，P=0.03)更優(yōu)。因此，Akk有潛力成為獨(dú)立的療效預(yù)測生物標(biāo)記物。同時(shí)，該研究通過對腫瘤組織的RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，Akk有助于提升腫瘤免疫微環(huán)境內(nèi)輔助性T細(xì)胞1的募集及再循環(huán)。此外，腸道菌群中Akk陽性的患者，整體菌群α多樣性更高，并有更豐富的瘤胃球菌及毛螺菌科菌株。

1.3 不同的黑色素瘤研究隊(duì)列之間結(jié)果差異較大

黑色素瘤是最早應(yīng)用ICIs的實(shí)體瘤之一，也是腸道菌群相關(guān)研究數(shù)據(jù)最為豐富的癌種。近期發(fā)表的一項(xiàng)研究納入了五個(gè)來自不同國家或地區(qū)的黑色素瘤隊(duì)列，同時(shí)也納入了既往已發(fā)表研究中的147例患者[6]，匯總分析發(fā)現(xiàn)與療效相關(guān)的菌群組成特征具有隊(duì)列特異性。機(jī)器學(xué)習(xí)提示包括假鏈狀雙歧桿菌、羅氏菌屬、Akk在內(nèi)的多個(gè)菌株與免疫治療療效呈正相關(guān)。類似的是，同期發(fā)表的另一項(xiàng)薈萃分析納入了四個(gè)已發(fā)表的黑色素瘤隊(duì)列以及該團(tuán)隊(duì)的研究隊(duì)列[7]，研究發(fā)現(xiàn)毛螺菌屬和鏈球菌屬分別與免疫治療獲益及不獲益相關(guān)，并有助于識(shí)別免疫相關(guān)不良反應(yīng)，盡管隊(duì)列間存在差異，基于批量校正后菌群測序數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型依然顯示出了良好的療效預(yù)測價(jià)值。

1.4 腸道菌群代謝產(chǎn)物可能是更精準(zhǔn)的生物標(biāo)記物

作為腸道菌群的下游產(chǎn)物，腸道菌群代謝產(chǎn)物可能是更精準(zhǔn)的免疫治療療效預(yù)測生物標(biāo)記物。SCFAs是研究較多的菌群代謝產(chǎn)物，碳鏈中碳原子小于6個(gè)的有機(jī)脂肪酸統(tǒng)稱為SCFA，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等。SCFA可能通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞[8]、CD8+T細(xì)胞功能[9-11]、增加腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤[11]等途徑參與調(diào)控抗腫瘤免疫。一項(xiàng)納入了52例接受帕博利珠單抗治療實(shí)體瘤患者的研究顯示，糞便中包括丁酸、丙酸和異戊酸等在內(nèi)的SCFA的豐度與更長的無進(jìn)展生存期(Progression-free survival，PFS)呈正相關(guān)[12]。然而，在接受CTLA-4抑制劑治療的小鼠荷瘤模型中顯示，外周血較高的丁酸和丙酸水平與CTLA-4抑制劑耐藥以及較高水平的Treg相關(guān)。小鼠中，CTLA-4抑制劑可以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞上CD80/CD86和T細(xì)胞上誘導(dǎo)性共刺激分子(Induciblc costimulator，ICOS)表達(dá)的上調(diào)，以及腫瘤特異性T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞的富集，丁酸鹽抑制了上述過程。在黑色素瘤患者中，外周血中丁酸鹽水平較高的患者中和了伊匹木單抗誘導(dǎo)的記憶性和ICOS+CD4+T細(xì)胞富集以及IL-12的浸潤[13]。這種相互矛盾的結(jié)果提示，在SCFA相關(guān)的研究中，研究分層需要更為細(xì)致，機(jī)制探索應(yīng)當(dāng)更加深入。肌苷是假長雙歧桿菌的代謝產(chǎn)物，免疫治療后腸道黏膜屏障功能降低，肌苷異位并激活抗腫瘤效應(yīng)的T細(xì)胞，肌苷的這種效應(yīng)依賴于T細(xì)胞表達(dá)的腺苷A2A受體[14]。除SCFA和肌苷外，有研究顯示吲哚及其衍生物、酮及醛化合物可能也與免疫治療療效相關(guān)，但機(jī)制尚不清楚[15]。

腸道菌群與免疫治療療效的相關(guān)性毋庸置疑，如何將相關(guān)性轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用是目前的研究重點(diǎn)，上述幾項(xiàng)研究初步探索了腸道菌群在免疫治療療效預(yù)測中的價(jià)值。然而，在這幾項(xiàng)研究中，無論是不同癌種之間，還是同一癌種之間，與療效相關(guān)的菌群特征均缺乏可重復(fù)性，這限制了腸道菌群成為一種可行的泛癌種的療效預(yù)測生物標(biāo)記物。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是以下兩點(diǎn)：(1)菌群的影響因素較多。例如，不同的飲食對于菌群的影響是不同的，以脂肪和蛋白質(zhì)為主的動(dòng)物性飲食主導(dǎo)了擬桿菌的定植，碳水化合物則更多的影響普氏菌定植。此外，還有居住環(huán)境、合并用藥等因素，也可能影響菌群的組成，因此，在構(gòu)建臨床隊(duì)列時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡量將上述因素考慮在內(nèi)；(2)缺乏全面而深入的機(jī)制探索。特定菌株在腫瘤免疫治療中調(diào)控宿主免疫的具體機(jī)制、不同菌株對免疫調(diào)控的異同應(yīng)為后續(xù)研究所關(guān)注。此外，菌株與其下游代謝產(chǎn)物對免疫系統(tǒng)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用也應(yīng)當(dāng)予以重視。

2 腸道菌群參與調(diào)控免疫治療相關(guān)不良反應(yīng)

免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有較為獨(dú)特的不良反應(yīng)，由于用藥后激活了自身免疫，且自身正常組織中也會(huì)表達(dá)PD-L1等免疫檢查點(diǎn)，免疫激活可能會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊正常組織進(jìn)而引起包括自身免疫性甲狀腺炎、肺炎、肝炎、腸炎等一系列免疫治療相關(guān)不良反應(yīng)(Immune-related adverse events，irAEs)。大多數(shù)患者的不良反應(yīng)輕微，但小部分患者不良反應(yīng)較重，甚至可能威脅生命。目前，irAEs發(fā)生發(fā)展的影響因素仍不完全清楚，是困擾臨床實(shí)踐的重要問題，目前已有研究報(bào)道了腸道菌群與irAEs具有相關(guān)性。

有研究者探索了發(fā)生irAEs患者的菌群特點(diǎn)。在黑色素瘤患者中，接受伊匹木單抗聯(lián)合納武利尤單抗治療的患者，有高危irAEs風(fēng)險(xiǎn)的患者可見腸道中多氏擬桿菌富集，并存在更多的腺苷代謝相關(guān)通路，而低?；颊咧袆t以普通擬桿菌富集為特點(diǎn)[20]。腸道菌群中雙歧桿菌(P=0.001)和脫硫弧菌(P=0.0002)相對富集的肺癌患者不容易出現(xiàn)irAEs[21]。在一項(xiàng)納入了150例腫瘤(非小細(xì)胞肺癌占68%)患者的真實(shí)世界研究中，研究者比較了發(fā)生不同程度irAEs患者的菌群差異，irAEs根據(jù)不良事件通用術(shù)語評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE V5.0)定義為輕度(CTCAE 1～2級)和嚴(yán)重(3～5級)。其中，發(fā)生嚴(yán)重irAEs的患者，鏈球菌、擬桿菌和窄食單胞菌的豐度顯著增加，發(fā)生輕度irAEs的患者腸道中糞便桿菌、未分類的毛螺菌更富集[22]。

另有研究發(fā)現(xiàn)特定irAEs患者的菌群特征。例如在發(fā)生了免疫相關(guān)急性胰腺炎的患者中，基線腸道菌群在門水平中具有較低擬桿菌/厚壁菌的比例，在屬水平上具有較低水平的擬桿菌、另支菌和較高水平的毛螺菌[23]。黑色素瘤患者中，接受伊匹木單抗治療的患者，基線普拉梭菌和Gemmiger formicilis等厚壁菌門菌與免疫相關(guān)結(jié)腸炎發(fā)生有關(guān)，而擬桿菌門的細(xì)菌則在免疫相關(guān)結(jié)腸炎中起保護(hù)作用[24]。最近另一項(xiàng)研究得到了不同的結(jié)果，在接受CTLA-4抑制劑聯(lián)合PD-1抑制劑治療的黑色素瘤患者中，腸道擬桿菌的豐度與免疫相關(guān)結(jié)腸炎相關(guān)，臨床前模型顯示，腸道擬桿菌可能通過上調(diào)黏膜IL-1β的水平，參與免疫相關(guān)結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展[25]。

3 干預(yù)菌群改善免疫耐藥

隨著腸道菌群與腫瘤免疫治療相關(guān)研究的深入，調(diào)節(jié)腸道菌群是否可以改善免疫耐藥得到了極大的關(guān)注。糞菌移植(Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是最直接的調(diào)節(jié)腸道菌群的方法，可大致分為移植單一菌群和移植整體菌群兩種主要方式。最近，F(xiàn)MT的一項(xiàng)大型Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究公布了結(jié)果，在難治性艱難梭菌感染的患者中，使用SER-109(一種提純的厚壁菌孢子)治療顯著降低了患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，且不良反應(yīng)可控[26]。這一研究進(jìn)一步確認(rèn)了糞菌移植作為一種獨(dú)立治療方法的可行性。在腫瘤領(lǐng)域，一項(xiàng)回顧性研究提示，補(bǔ)充丁酸梭菌MIYAIRI 588菌株可以改善接受免疫治療的晚期非小細(xì)胞肺癌的生存[27]。近期，一項(xiàng)前瞻性Ⅰb期臨床試驗(yàn)研究顯示，轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者中，在伊匹木單抗聯(lián)合納武利尤單抗的基礎(chǔ)上給予MIYAIRI 588，ORR(58%vs.20%，P=0.06)及PFS(12.7個(gè)月vs.2.5個(gè)月，HR=0.15，95%CI：0.05～0.47，P=0.001)增加，且未增加3/4級副反應(yīng)的發(fā)生率[28]。

整體移植有效患者的腸道菌群也是FMT的可行方式。在原發(fā)免疫耐藥的黑色素瘤患者中，將10例接受PD-1抑制劑治療后進(jìn)展的患者隨機(jī)分為兩組，分別移植了來自兩例PD-1抑制劑治療后實(shí)現(xiàn)完全緩解并持續(xù)超過1年的黑色素瘤患者的糞便菌群，同時(shí)進(jìn)行PD-1抑制劑的再挑戰(zhàn)。10例患者移植前基線菌群特征無顯著差異。接受1號供體FMT的5例患者中，共有3例患者達(dá)到了臨床緩解，其中1例達(dá)到了完全緩解，另有1例患者表現(xiàn)為部分病灶緩解、部分其他病灶增大。然而，在接受2號供體移植的患者中，沒有患者達(dá)到臨床緩解。FMT總體安全性良好。研究者對患者移植前后的糞便樣本、腸道和腫瘤組織樣本進(jìn)行了分析，在接受了1號供體的糞便菌群移植的患者中，腸道內(nèi)抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)活性、先天免疫和IL-12相關(guān)基因集表達(dá)上調(diào)，腫瘤組織內(nèi)免疫相關(guān)基因集如T細(xì)胞活化、干擾素γ介導(dǎo)的相關(guān)信號通路等上調(diào)，同時(shí)局部免疫細(xì)胞浸潤增加。在接受2號供體的患者中沒有觀察到類似現(xiàn)象。但是在接受1號供體的5例患者之間，應(yīng)答情況的差異性仍無法得到很好的解釋[29]。另一項(xiàng)研究納入了16例PD-1抑制劑原發(fā)耐藥的黑色素瘤患者，隨機(jī)接受來自7例供體的糞便菌群移植(4例供體接受PD-1治療后疾病完全緩解，3例部分緩解，中位PFS為56個(gè)月)，同時(shí)進(jìn)行PD-1抑制劑的再挑戰(zhàn)。移植后有3例患者實(shí)現(xiàn)了疾病緩解，3例患者疾病控制穩(wěn)定并維持超過12個(gè)月?？傮w安全性良好。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)FMT后免疫治療獲益患者的腸道菌群迅速轉(zhuǎn)化為供體的菌群特征，并產(chǎn)生了供體菌群特異性的IgG。獲益的患者在移植后厚壁菌門和放線菌門增加，擬桿菌門減少。后續(xù)的分析提示獲益患者的循環(huán)CD8+T細(xì)胞更活躍且分化更好，循環(huán)IL-8和IL-18水平下降[30]。

聯(lián)合使用其他抗腫瘤藥物間接改變菌群是改善免疫耐藥的潛在可行方案。聯(lián)合治療是臨床中最常見的改善免疫耐藥的方式，常見的方案包括免疫聯(lián)合化療、免疫聯(lián)合靶向藥物、雙免疫檢查點(diǎn)聯(lián)合治療等，均取得了一定的效果。然而，聯(lián)合藥物的選擇、給藥方式的選擇(同時(shí)給藥、先后給藥)等還存在一定的爭議。上述問題似乎可以從腸道菌群的角度找到答案?；熕幬锖桶邢蛩幬锟梢杂绊懩c道菌群狀態(tài)。如化療藥物紫杉醇用藥后可以導(dǎo)致腸道中艾克曼氏菌的豐度顯著降低[31]。舒尼替尼和卡博替尼是多靶點(diǎn)的小分子絡(luò)氨酸酶抑制劑，廣泛用于腎細(xì)胞癌和肺癌等癌種，研究發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼和卡博替尼治療后，艾克曼氏菌和Alistipes.senegalensis豐度增加，后者也具有調(diào)控免疫系統(tǒng)應(yīng)答的作用[32]。因此，聯(lián)合上述可以促進(jìn)腸道菌群向增敏免疫治療方向改變的藥物是值得探索的方向。在方案實(shí)施時(shí)，嘗試優(yōu)先給予改變菌群的化療/靶向藥物，菌群變化并穩(wěn)定后再給予免疫治療藥物，是否可以更有效地改善免疫耐藥并提升獲益，值得進(jìn)一步研究。具體的聯(lián)合方案以及給藥時(shí)間還需要更多的前瞻性隊(duì)列研究進(jìn)行驗(yàn)證。

此外，有研究顯示我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)也可能通過改善腸道菌群提升免疫治療療效。葛根芩連湯在荷瘤小鼠模型中(BALB/c小鼠，CT26腸癌細(xì)胞系種瘤)可以增加部分?jǐn)M桿菌菌株相對豐度水平，并促進(jìn)甘油磷脂代謝和鞘脂代謝通路富集。研究者認(rèn)為菌群的改變與外周血及腫瘤組織CD8+T細(xì)胞富集有關(guān)[33]。在人體中，葛根芩連湯是否能達(dá)到類似的免疫促進(jìn)效果仍需要進(jìn)一步的研究。

目前已有一系列研究初步證實(shí)了FMT是改善免疫治療耐藥的可行手段，而通過聯(lián)合其他藥物間接調(diào)節(jié)菌群也已有一定的理論基礎(chǔ)。但是，現(xiàn)有的研究中，由于缺乏足夠深入且清晰的機(jī)制研究，仍無法完全實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)治療”，一定程度上也限制了更大規(guī)模的臨床應(yīng)用。

4 小結(jié)與展望

腸道菌群與免疫治療療效及不良反應(yīng)的關(guān)聯(lián)均已得到充分證實(shí)，干預(yù)菌群是可行的增敏免疫治療療效的方法?，F(xiàn)階段，無論是預(yù)測療效、不良反應(yīng)還是菌群移植，均欠缺精準(zhǔn)性?！熬珳?zhǔn)”應(yīng)當(dāng)是圍繞菌群研究的關(guān)鍵詞，一方面，腸道菌群是腫瘤精準(zhǔn)治療的重要組成部分，另一方面，由于腸道菌群的影響因素眾多，腸道菌群相關(guān)的研究需要更加的精準(zhǔn)，也需要更多的關(guān)注機(jī)制。除腸道菌群之外，口腔菌群、腫瘤內(nèi)菌群和腫瘤原發(fā)部位菌群(如支氣管內(nèi)菌群)等也是不容忽視的影響因素。全面而系統(tǒng)的評估菌群狀態(tài)，并在菌群的基礎(chǔ)上結(jié)合包括單細(xì)胞測序、蛋白組學(xué)在內(nèi)的多組學(xué)研究方法，可能是研究者未來關(guān)注的方向。