曹 鵬，王運(yùn)帷，官 浩，陳 陽(yáng)，任麗穎，姚 明

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院燒傷整形美容科，銀川 750004；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院全軍燒傷中心燒傷與皮膚外科，西安 710032）

燒傷或創(chuàng)傷是臨床上常見(jiàn)的一種病癥，重度燒傷或創(chuàng)傷會(huì)引起一系列皮膚和全身系統(tǒng)的病理生理變化。瘢痕組織是燒傷或創(chuàng)傷后創(chuàng)面修復(fù)的必然產(chǎn)物，據(jù)估計(jì)，有超過(guò)70%的人在燒傷或創(chuàng)傷后會(huì)形成增生性瘢痕[1-2]。增生性瘢痕在形成過(guò)程中常伴有瘙癢、疼痛、攣縮等癥狀，出現(xiàn)在關(guān)節(jié)活動(dòng)部位的瘢痕甚至?xí)绊戧P(guān)節(jié)的活動(dòng)，給患者及家人帶來(lái)沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-4]。近年來(lái)，增生性瘢痕的治療和預(yù)防方法取得了明顯的進(jìn)展，但對(duì)于增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。既往研究[1，5-6]表明，創(chuàng)面愈合和瘢痕形成與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）有關(guān)。TGFβ1/Smad 信號(hào)通路調(diào)節(jié)膠原合成，在瘢痕形成過(guò)程中起重要作用，調(diào)控TGFβ1/Smad 對(duì)抑制瘢痕增生十分重要。二甲雙胍是臨床上廣泛應(yīng)用的一種糖尿病經(jīng)典治療藥物，具有抑制肝臟糖異生、增強(qiáng)骨骼肌葡萄糖攝取的作用。作為一種雙胍類口服降糖藥廣泛應(yīng)用于2 型糖尿病患者。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和減少許多器官纖維化的功能，可通過(guò)促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的失活和凋亡而降低肝臟和腎臟纖維化的作用。目前關(guān)于二甲雙胍用于增生性瘢痕的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究以原代培養(yǎng)的增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，給予不同濃度的二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)各組細(xì)胞中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 和CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 及TGFβ1/Smad 信號(hào)通路的磷酸化水平，初步探討二甲雙胍通過(guò)TGFβ1/Smad 信號(hào)通路抑制瘢痕增生的機(jī)制，為增生性瘢痕的預(yù)防、治療及藥物篩選提供新的靶點(diǎn)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2021—2022年在空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷與皮膚外科接受治療并手術(shù)的增生性瘢痕患者，標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除獲得，所有患者均知情同意。本組共4 例，男性2 例，女性2 例，年齡18～35 歲。其中2 例位于上肢，2 例位于下肢。4 例患者均無(wú)其他系統(tǒng)性疾病，手術(shù)前均未接受任何藥物注射、放療或外科治療，符合實(shí)驗(yàn)要求標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2 主要試劑

1 mol·L-1二甲雙胍購(gòu)自西安灝洋生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；兔抗人β-actin、TGFβ1、Smad3、p-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA 多克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PMSF、RIPA裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)密理博公司；RIPA 裂解液均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；TRIzol Reagent 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料試劑盒均購(gòu)自日本Takara 公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；DU800 型分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司；Mini 型蛋白電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；M200 型全波段酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。將增生性瘢痕組織標(biāo)本在無(wú)菌條件下用無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗3 遍，用手術(shù)刀片盡量除去表皮及皮下組織，再次用無(wú)菌PBS沖洗后，切成1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，間隔約1 cm 的距離在培養(yǎng)瓶壁上均勻擺置，加入適量完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、10 g·L-1青霉素、10 g·L-1鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基），接種至底面積為75 cm2的培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊貼壁處朝上，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)，每周換液3 次。倒置顯微鏡下觀察，待原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞爬出，生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。取第3～6 代成纖維細(xì)胞（Fb）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組依據(jù)二甲雙胍濃度分為5、10、20、30 mmol·L-1組，觀察各組給藥刺激24 h 后細(xì)胞形態(tài)變化。空白對(duì)照組加入等體積的PBS 培養(yǎng)液。成纖維細(xì)胞以每孔2×105接種于6 孔板，每組設(shè)置3 個(gè)平行復(fù)孔，分別檢測(cè)。

1.3.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，0.25%胰酶、0.02%EDTA溶液消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，用不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/L，接種于96 孔板中，每個(gè)孔板接種細(xì)胞5 000 個(gè)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的二甲雙胍的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，每孔設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。在加藥培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 液，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)吸光度（A）值，按照CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA 的相對(duì)表達(dá) 按總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA 的純度及濃度，選取A260/A280在1.8～2.0 的組織提取物進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成參照Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)；CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA 序列取自美國(guó)基因庫(kù)，引物采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，采用△循環(huán)閾值（Ct）法處理結(jié)果，計(jì)算CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，即2-△△Ct。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.3.5 Western blot 法檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGFβ1、Smad3 磷酸化水平、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和α-SMA 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平 空白對(duì)照組以及用5、10、20 和30 mmol·L-1二甲雙胍分別刺激細(xì)胞48 h 后均進(jìn)行RIPA 裂解，收集空白對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。采用含有1 mmol·L-1PMSF的RIPA 蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，測(cè)定后加入1/4 樣品體積量的上樣緩沖液，100 ℃金屬浴10 min 后室溫備用。調(diào)整電泳參數(shù)為：濃縮膠80 V、30 min，分離膠120 V、65 min。取出凝膠后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶封閉2 h?？筎GFβ1 抗體、抗Smad3抗體、抗磷酸化Smad3（p-Smad3）抗體、抗CollagenⅠ抗體、抗Collagen Ⅲ抗體、抗α-SMA 抗體（稀釋比均為1∶1 000），抗β-actin 抗體（稀釋比為1∶3 000），4 ℃搖床過(guò)夜。TBST 洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（稀釋比為1∶3 000），37 ℃搖床孵育1 h。TBST 洗滌后，ECL 發(fā)光，應(yīng)用Image J 圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）測(cè)定各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果以目的蛋白與β-actin 的灰度比值表示，計(jì)算TGFβ1、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 的相對(duì)蛋白表達(dá)量；Smad3 磷酸化水平=p-Smad3 相對(duì)表達(dá)量/Smad3 相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Excel、GraphPad Prim 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較行Student-t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組增生性瘢痕組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目較少，排列較稀疏，且呈劑量依賴性，細(xì)胞體積較小，呈長(zhǎng)梭形，核小，輪廓清楚；空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目較多，排列緊密，細(xì)胞體積較大，呈星形扁平細(xì)胞，核大，輪廓清楚（圖1）。

圖1 各組增生性瘢痕組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.2 二甲雙胍對(duì)增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞增殖活力的影響

空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制，不同濃度二甲雙胍處理成纖維細(xì)胞后，各實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞的抑制率依次升高為（52.54±1.56）%、（66.12±1.15）%、（73.00±0.17）%和（79.65±1.18）%，均高于對(duì)照組（P 均＜0.05），抑制率隨著二甲雙胍劑量的增加而增加，呈劑量依賴性（圖2）。

圖2 二甲雙胍對(duì)增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞增殖活力的影響

2.3 不同濃度二甲雙胍對(duì)成纖維細(xì)胞CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 相對(duì)表達(dá)的影響

經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理后，成纖維細(xì)胞中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 相對(duì)表達(dá)水平隨二甲雙胍劑量的增加而降低，均低于空白對(duì)照組（P 均＜0.05），且呈劑量依賴性（圖3）。

圖3 不同濃度二甲雙胍對(duì)成纖維細(xì)胞Collagen I、Collagen III 和α-SMA mRNA 表達(dá)的影響

2.4 不同濃度二甲雙胍對(duì)成纖維細(xì)胞TGFβ1、Smad3 磷酸化、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理后，成纖維細(xì)胞中TGFβ1、Smad3 磷酸化、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均隨著二甲雙胍濃度的升高而降低，且呈劑量依賴性，均低于空白對(duì)照組（P 均＜0.05）（圖4）。

圖4 不同濃度二甲雙胍對(duì)成纖維細(xì)胞TGFβ1、Smad3 磷酸化、Collagen I、Collagen III、α-SMA 的蛋白表達(dá)的影響

3 討論

深度燒傷或創(chuàng)傷患者創(chuàng)面的愈合往往導(dǎo)致增生性瘢痕的形成。HPs 是一種嚴(yán)重的皮膚纖維化疾病，其臨床特征主要表現(xiàn)為局部增厚、表面隆起呈紅色、質(zhì)硬無(wú)彈性、局部癢痛等；其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征主要表現(xiàn)為真皮成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的過(guò)度轉(zhuǎn)化，細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度合成、分泌、沉積、代謝，皮膚組織修復(fù)再塑功能受損[4，10-12]。HPs 不僅影響美觀，還可能出現(xiàn)瘙癢、疼痛等癥狀，攣縮后甚至能引起組織器官的功能障礙，危害患者的生理和心理健康，給患者、家庭、社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)[2-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，增生性瘢痕的治療和預(yù)防方法也取得了很大的進(jìn)步，但目前尚缺乏徹底有效的預(yù)防及治療方案，主要原因是HPs 發(fā)病機(jī)制尚不明確。盡管臨床上有多種治療方案，但因HPs 的發(fā)病率及復(fù)發(fā)率高、周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，加之目前尚未有預(yù)防瘢痕形成及瘢痕改善的特效藥物，因此，深入尋找預(yù)防及治療增生性瘢痕的藥物，初步推測(cè)其機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探索防治新策略，是燒傷整形外科醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)和重點(diǎn)問(wèn)題。

Smad3 是TGFβ1/Smad 信號(hào)通路中的一個(gè)重要中間信號(hào)分子，它的主要作用是介導(dǎo)TGFβ1信號(hào)傳入細(xì)胞核內(nèi)，并進(jìn)一步影響相關(guān)下游基因的表達(dá)，它的高表達(dá)與瘢痕增生形成有著密切關(guān)系[13-15]。CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 是最常用于瘢痕檢測(cè)的指標(biāo)之一。CollagenⅠ是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的主要成分，在增生性瘢痕的形成過(guò)程中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ均有增加，膠原的過(guò)度沉積與增生性瘢痕的形成有著緊密聯(lián)系[5，16]。α-SMA 在肌成纖維細(xì)胞收縮、瘢痕攣縮和傷口過(guò)度愈合的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[5，17]。

二甲雙胍是一種雙胍類口服降糖藥，廣泛應(yīng)用于2 型糖尿病患者；具有抑制肝臟糖異生，增強(qiáng)骨骼肌葡萄糖攝取的作用[18]。并且二甲雙胍還具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化、抗腫瘤和減少許多器官的纖維化功能，已有研究[19-21]表明二甲雙胍通過(guò)促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的失活和凋亡而降低肝臟和腎臟纖維化的作用。目前也有研究[22]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過(guò)抑制TGFβ1/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)減少心臟纖維化的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CCK-8 法檢測(cè)不同濃度二甲雙胍對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制程度與濃度的關(guān)系，qRT-PCR 和Western blot 技術(shù)檢測(cè)不同濃度二甲雙胍對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成及TGFβ1/Smad 信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明：二甲雙胍可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和膠原合成，并且呈劑量依賴性。同時(shí)，本課題組還檢測(cè)了TGFβ1 和Smad3 磷酸化蛋白表達(dá)水平，經(jīng)不同濃度二甲雙胍作用后，TGFβ1 和Smad3 磷酸化蛋白表達(dá)水平降低。由此推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)TGFβ1/Smad 信號(hào)通路來(lái)抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的膠原合成，進(jìn)而抑制增生性瘢痕的形成。

綜上所述，二甲雙胍對(duì)于增生性瘢痕的形成具有抑制作用，為臨床上治療和預(yù)防增生性瘢痕的形成及藥物選擇提供新的思路和方向，為進(jìn)一步深層次研究提供理論指導(dǎo)。