李 丹，朱 曦，鄧曉豐，李 龍

(1.黑龍江神志醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.復旦大學，上海 200433；3.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

腦出血(Intracerebral hemorage，ICH)作為一種非創(chuàng)傷性的因腦內(nèi)血管破裂導致血液聚積在腦實質(zhì)內(nèi)的疾病，是一種以病情兇險、病死率高為特點的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1]。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，我國的腦出血發(fā)病率為0.045%，患病率為0.215%，死亡率為0.060%，而3個月致死致殘率則高達40.4%～59.5%[2]。同時腦出血康復后仍有很高的復發(fā)風險，且其致殘的嚴重程度不一，大多數(shù)表現(xiàn)為行動和意識障礙[3]。高血壓、睡眠呼吸暫停綜合征、年齡、性別與抗凝藥物使用甚至醫(yī)療保險不健全等都可能成為引起腦出血的危險因素[4]。目前內(nèi)科與外科均有一些治療腦出血的方法，但目前尚未明確哪一種方法能夠有效改善腦出血的不良預(yù)后。闡明腦出血損傷的機制，研究有效的治療方法，已成為這一疾病研究需要盡快解決的首要問題。

隨著對腦出血治療機理研究的不斷深化，研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在腦卒中患者血液中的表達上調(diào)[5]，在腦出血大鼠腦組織中，KLF4的表達顯著降低。近年有研究發(fā)現(xiàn)“百會”透“針刺”療法能夠?qū)Υ笫笊窠?jīng)功能學評分產(chǎn)生正向影響[6]。在血管內(nèi)皮中過度表達的miR-34a-5p還會破壞血腦屏障，使線粒體功能發(fā)生障礙[7]。作為一種鋅指蛋白，KLF4能夠通過易位表達促進血管內(nèi)皮生長因子表達，從而促進血管新生[6]。在腦組織中，高表達的KLF4還可抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖與侵襲[8]、調(diào)控上皮細胞-間葉細胞轉(zhuǎn)化[9]和使得支持細胞向神經(jīng)干細胞分化[10]等，可在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中產(chǎn)生影響。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，針刺在治療腦出血這一損傷時具有積極作用[11-12]，但其治療腦出血的機制尚不明確，亟需進一步研究?！鞍贂蓖浮扒W”針刺療法的作用已得到眾多實驗的證實[13-15]，但該療法的具體作用機理還沒有闡釋明確?，F(xiàn)有研究大都從細胞因子表達層面上進行研究[16-17]，但其對于minRNA及mRNA表達的影響尚需進一步闡釋。實驗發(fā)現(xiàn)“百會”透“曲鬢”針刺療法上調(diào)了KLF4表達水平，下調(diào)了miR-34a-5p的表達水平，推測調(diào)節(jié)miR-34a-5p/KLF4信號通路是“百會”透“曲鬢”針刺療法能夠減輕腦出血后神經(jīng)損傷的途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取60只清潔級健康的雄性SD大鼠，實驗動物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，使用許可證號：SCXK(京)2019-0008，3月齡，體質(zhì)量250～300 g，大鼠全部采用分籠飼養(yǎng)于溫度(25±1)℃、濕度45%～55%和明暗周期12 h/12 h循環(huán)環(huán)境下，自由飲食。按隨機數(shù)字表法將SD大鼠隨機均分5組，每組又隨機分1 d和7 d兩個時間點。本實驗經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學學術(shù)委員會實驗動物倫理分委員會審批(編號No:BUVM-4-2021122002-4106)。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 儀器 NW10LVF型超純水系統(tǒng)(香港,Heal Force);H-2050R型超速冷凍離心機(長沙,湖南湘儀);Proline型微量移液器(蘇州,BIOHIT);DZF-6050型真空干燥箱(上海,SYSBERY);NANO 2000型紫外分光光度計(美國,Thermo);PVDF膜(美國,Thermo Fisher Scientific公司);Exicycler 96型熒光定量PCR儀(韓國,BIONEER);WD-9405B型水平搖床、DYY-7C型電泳儀、WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽和DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀(北京,北京六一);DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津,天津泰斯特);ELX-800型酶標儀(美國,BIOTEK)。

1.2.2 試劑 TRIpure、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、2×Power Taq PCR MasterMix及RNase inhibitor(北京,BioTeke)；SYBR Green(北京,Solarbio);ECL發(fā)光液(中國,7 Sea biotech);預(yù)染蛋白分子量標準(加拿大,Fermentas);BSA(中國,Biosharp);RIPA裂解液(強)、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、30% Acr-Bis(29:1)和SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(中國,beyotime);KLF4 antibody、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG和內(nèi)參抗體β-actin(中國,Proteintech)等。

1.3 造模及干預(yù)方法

1.3.1 ICH模型制作 運用自體血注入尾殼核制取腦出血模型。禁食12 h和禁水6 h后造模。采用自體血注射的方法,根據(jù)大鼠的立體定位圖譜，向大鼠腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，以俯臥位的形式將大鼠固定在立體定位儀上，隨后將定位儀兩側(cè)耳桿插入大鼠骨性外耳道，將大鼠門齒定位在門齒孔上，通過調(diào)整高度來保證前囟點和人字點處于水平位置。以兩耳尖連線中點為標志，進行備皮、消毒和切口，鈍性分離皮下骨膜后，將前囟點及冠狀縫充分暴露，用立體定位儀定位坐標點(前囟點為中心，右側(cè)3.5 mm，后側(cè)0.2 mm)，用1.0 mm直徑鉆頭鉆孔至硬腦膜表面，若落空感停止，但要注意避免穿孔過深，從而損傷腦組織。在對鼠尾進行消毒后，由實驗人員在距尾端3 cm處a剪斷，這時采血50 μL，將大鼠重新固定在立體定位儀上，以20 μL/min注入自體血，針頭刺入深度6 mm，進行5 min留針后緩慢出針。最后在大鼠斷尾處進行消毒包扎，在頭部抗菌用牙科水泥密封顱骨鉆孔，使用碘伏消毒，縫合，防止感染。

1.3.2 大鼠隨機分組及干預(yù)方法 本研究選用60只清潔級健康雄性SD大鼠，3月齡，體質(zhì)量約250～300 g，分籠飼養(yǎng)，自由飲食。按體質(zhì)量將健康雄性大鼠隨機平均分為5組，每組6只大鼠，每組再隨機分為1 d、7 d兩個亞組。

假手術(shù)組(Sham)：開皮、鉆孔、注射生理鹽水和縫合，對大鼠進行每天1次與針刺組相同的捆綁，每次30 min。

模型組(ICH)：復制腦出血模型，建模12 h后對大鼠進行每天1次與針刺組相同的捆綁，每次30 min。

模型+針刺治療組(ICH+acupuncture)：腦出血造模后12 h給予針刺治療，每24 h針刺1次。參照《實驗動物穴位圖譜》進行針刺部位選擇，取大鼠百會穴(頂骨正中)、患側(cè)曲鬢穴(眶外緣與外耳口連線的后2/3)。針刺方法:使用由百會向曲鬢穴透刺的方法，針灸針快速刺入并以透刺的手法刺向曲鬢穴，施以捻轉(zhuǎn)速度為200 r/min的快速捻轉(zhuǎn)手法，持續(xù)捻轉(zhuǎn)5 min，后間隔5 min，反復操作，共留針30 min。針刺治療后于腦出血造模后相應(yīng)時間點分別取材。

模型+針刺治療+agomir陰性對照組(ICH+acupuncture+agomir-NC)：將購買的miR-34a-5p agomir-NC稀釋至終濃度為50 μM，取5 μL聯(lián)合12.5 μL轉(zhuǎn)染試劑于建模前3 d行側(cè)腦室(前囟后0.8 mm，中縫右1.5 mm，頭骨表面以下4.5 mm深)注射。復制腦出血模型，建模12 h后給予針刺治療，每24 h針刺1次，具體操作方法同模型+針刺治療組保持一致。

模型+針刺治療+miR-34a-5p agomir組(ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir)：(將購買的miR-34a-5p agomir稀釋至終濃度為50 μM，取5 μL聯(lián)合12.5 μL轉(zhuǎn)染試劑于建模前3 d行側(cè)腦室(前囟后0.8 mm，中縫右1.5 mm，頭骨表面以下4.5 mm深)注射。復制腦出血模型，建模12 h后給予針刺治療，每24 h針刺1次，具體操作方法同模型+針刺治療組保持一致。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 Longa神經(jīng)功能缺損評分 大鼠造模完成，等待大鼠意識清醒后，于建模后1 d、7 d時間點對大鼠進行神經(jīng)功能測評，采用Zea Longa神經(jīng)功能評分方法對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。分為5個等級,0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：病灶對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時，大鼠向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時，大鼠向病灶對側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，存在意識障礙。納入造模時評分為1～3分的大鼠。

1.4.2 Real-time PCR檢測miR-34a-5p和KLF4表達 測定完大鼠Longa評分后，對大鼠腹腔注射200 mg/kg過量戊巴比妥鈉處死，運用高純度總RNA快速提取試劑盒提取小鼠腦部血腫周圍中的總RNA，并且運用紫外分光光度計定量分析。運用miR-34a-5p莖環(huán)RT引物或相應(yīng)的引物將分離的RNA轉(zhuǎn)錄到相應(yīng)的cDNA中去，所用相關(guān)引物為miR-34a-5p：上游5′-GGACTTGGCAGTGTCTTAGCTG-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；5S：上游5′-GATCTCGGAAGCTAAGCAGG-3′，下游5′-TGGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；KLF4 mRNA：上游5′-GGAGCCCAAGCCAAAGAGG-3′，下游5′-CGTCCCAGTCACAGTGGTAAGGT-3′；β-肌動蛋白：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。miR-34a-5p的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，循環(huán)40次；KLF4 mRNA的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，循環(huán)40次。運用SYBR Green進行RT-PCR分析，在Exicycler 96系統(tǒng)中檢測miR-34a-5p和KLF4 mRNA的表達水平。以5S和β-肌動蛋白為內(nèi)參照物，使用2△△CT法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡分析KLF4表達水平 RIPA裂解緩沖液提取大鼠腦內(nèi)血腫周圍的總蛋白，使用BCA蛋白分析試劑盒進行定量分析。進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)移到PVDF膜中，之后封閉。孵育一抗(KLF4 antibody 1∶500)，夜間4 ℃過夜；孵育二抗(羊抗兔IgG-HRP 1∶10 000)，37 ℃ 45 min。 在Gel-Pro分析系統(tǒng)中運用熒光試劑盒進行可視化展示。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參照物。

1.5 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包對本實驗數(shù)據(jù)進行歸納整理，多組之間比較采用單因素方差分析進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差來表示，檢驗水平α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.6 不良事件

在實驗過程中密切觀察大鼠活動情況及生命狀態(tài)，若大鼠特別痛苦或Longa評分被評為4分，則對大鼠實行安樂死。在本研究進行過程中，未觀測到預(yù)期或未預(yù)期的不良事件。

2 結(jié)果

2.1 針刺“百會”透“曲鬢”對腦出血大鼠Longa評分的影響

如表1所示，各時間點，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠Longa評分升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且Sham組腦出血大鼠Longa評分為0。1 d時，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠Longa評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠Longa評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。7 d時，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠Longa評分降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠Longa評分升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明miR-34a-5p可能對針刺緩解腦出血造成的神經(jīng)損傷的療效會起到抑制作用；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠Longa評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學評分結(jié)果

2.2 針刺“百會”透“曲鬢”對腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達的影響

如表2和圖1所示，各時間點，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。1 d、7 d兩個時間點，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 各組腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p水平

圖1 miR-34a-5p溶解曲線及擴增曲線圖

2.3 針刺“百會”透“曲鬢”對腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA水平的影響

如表3和圖2所示，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。1 d、7 d兩個時間點，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 各組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 mRNA水平比較

圖2 KLF4 mRNA溶解曲線及擴增曲線圖

2.4 針刺“百會”透“曲鬢”對腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平的影響

如表4、圖3所示，與Sham組比較，ICH組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。1 d、7 d兩個時間點，與ICH組比較，ICH+acupuncture組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4 蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與ICH+acupuncture+agomir-NC組比較，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討論

針刺療法是中醫(yī)學的重要外治方法，是目前針對治療腦出血疾病的熱點話題。現(xiàn)有研究表明，針刺作為腦出血患者的輔助治療時，不僅具有良好的治療安全性，可以減少長期使用藥物對人體的刺激，保護神經(jīng)功能，抑制全身的炎性反應(yīng)，優(yōu)化腦血流動力學狀態(tài)[18]。在本課題組的前期研究中，針刺能夠通過調(diào)控腦組織內(nèi)神經(jīng)細胞生長因子、巢蛋白[19]，堿性成纖維細胞生長因子[20]，達到促進組織修復并抑制細胞凋亡的效果[21]。

表4 各組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白水平

圖3 各組腦出血大鼠血腫周圍KLF4蛋白表達

在本課題組的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，KLF4在ICH大鼠腦組織中含量顯著下降，而miR-34a-5p的表達含量則顯著上升。本研究旨在明確針刺對于改善腦出血預(yù)后的有效性，探究miR-34a-5p對腦出血疾病發(fā)展及預(yù)后的影響。探討miR-34a-5p對KLF4的調(diào)節(jié)作用，了解頭針治療對miR-34a-5p和KLF4的影響，為針刺治療ICH提供新的理論。

在最近有關(guān)miR-34a-5p以及KLF4的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p在缺血性中風患者的血液中表達升高[22]，且在腦出血大鼠血腫周圍表達升高，過表達的miR-34a-5p則會引起神經(jīng)元的凋亡，同時加重血腫周圍的形態(tài)學改變[23]，這表明miR-34a-5p的過表達可能會引起腦出血后損傷加重；KLF4則在微血管內(nèi)皮中能夠抑制細胞凋亡和炎性反應(yīng)[24]，過表達的KLF4能夠調(diào)節(jié)腦梗死后緊密蛋白的表達[25]，對缺血性腦卒中引起的腦神經(jīng)損傷起到保護作用。除去對于神經(jīng)元的作用外，KLF4也可以在促進血管新生上發(fā)揮積極作用[26]，趙松耀則在其臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，腦梗死預(yù)后不良的患者較腦梗死預(yù)后良好的患者外周血液中KLF4 mRNA表達降低，且KLF4 mRNA表達的情況與溶栓效果成正相關(guān)，可以作為評估溶栓效果的指標[27]。相關(guān)文獻證實了KLF4的3’-UTR區(qū)可以同miR-34a-5p結(jié)合，且存在靶向關(guān)系[28]，miR-34a-5p很可能是通過靶向抑制KLF4，使得KLF4對腦血管及神經(jīng)組織的保護作用下降，進而抑制針刺減輕腦出血損傷的能力。

本研究分為假手術(shù)組、模型組、模型+針刺治療組、模型+針刺治療+agomir陰性對照組與模型+針刺治療+miR-34a-5p agomir組5組，使用Longa評分評定大鼠神經(jīng)功能缺損情況，實驗發(fā)現(xiàn)“百會”透“曲鬢”針刺療法能夠降低大鼠Longa評分，改善大鼠神經(jīng)功能損傷的情況，但miR-34a-5p能夠抑制針刺對損傷的治療效果。同時對腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5p、KLF4 mRNA水平與KLF4蛋白表達進行了測定，發(fā)現(xiàn)針刺“百會”透“曲鬢”能夠下調(diào)腦出血大鼠血腫周圍miR-34a-5的表達，上調(diào)KLF4 mRNA水平與KLF4蛋白表達。筆者發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p表達水平與KLF4的mRNA和蛋白表達趨勢相反，并且KLF4的mRNA和蛋白水平隨著miR-34a-5p的過度表達而降低，這提示KLF4應(yīng)當是miR-34a-5p的靶點之一，也是針刺“百會”透“曲鬢”減輕腦出血大鼠神經(jīng)損害的靶點之一。

綜上所述，此研究驗證了miR-34a-5p/KLF4信號通路是針刺“百會”透“曲鬢”減輕腦出血損傷的靶點之一?！鞍贂蓖浮扒W”針刺可以降低腦出血大鼠Longa評分，抑制miR-34a-5p表達，促進KLF4 mRNA表達，促進KLF4蛋白表達，減輕腦出血后神經(jīng)損害，為今后針刺“百會”透“曲鬢”在腦出血疾病方面提供了理論和實驗基礎(chǔ)。