譚智廣，徐 征，吳夢(mèng)希，劉軍山

（大連理工大學(xué)遼寧省微納米技術(shù)及系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116024）

0 引言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）具有較高的特異性和靈敏度，基于PCR的核酸檢測(cè)已成為病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。PCR通常需要經(jīng)歷30～40次的擴(kuò)增循環(huán)才能達(dá)到檢測(cè)所需的濃度，每次循環(huán)包含變性、退火和延伸3個(gè)反應(yīng)步驟，分別需要在不同溫度下進(jìn)行。因此，基于PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)需要對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行反復(fù)的升降溫控制，無(wú)法快速得到檢測(cè)結(jié)果。為此，研究人員開(kāi)發(fā)了多種基于等溫?cái)U(kuò)增的核酸檢測(cè)技術(shù)，例如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、重組酶聚合酶擴(kuò)增等。基于等溫?cái)U(kuò)增的核酸檢測(cè)過(guò)程不需要進(jìn)行不同溫度之間的調(diào)整，對(duì)溫度控制系統(tǒng)的要求大大降低，并且不需要變溫調(diào)整時(shí)間。美國(guó)疾病控制中心的Calvert等[1]基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開(kāi)發(fā)了快速檢測(cè)尿液或血清中寨卡病毒的分析方法，能夠在20～35 min的時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果。清華大學(xué)的Lin等[2]設(shè)計(jì)了基于微流控芯片的便攜式系統(tǒng)，利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能夠在50 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)4種Ebola病毒。

現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（Point-of-care testing，POCT）[3-4]是指利用便攜式分析設(shè)備，在患者附近即可進(jìn)行的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，在疫情防控、海關(guān)及檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。日本東北大學(xué)的Wakao等[5]搭建了微型裝置的便攜式熒光偏振免疫分析儀，尺寸為35 cm×15 cm×15 cm，能夠同時(shí)對(duì)96個(gè)獨(dú)立樣本中的真菌毒素進(jìn)行熒光偏振免疫分析。德國(guó)杜伊斯堡-埃森大學(xué)的Tran等[6]設(shè)計(jì)了一種便攜式拉曼/SERSLFA讀寫器，采用定制的光纖探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)妊娠激素人絨毛膜促性腺激素（hGG）以及兩種細(xì)胞因子IL6和IL8的檢測(cè)，能夠在數(shù)秒時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果?；诤怂釘U(kuò)增的POCT技術(shù)還相對(duì)較少，這主要是由于大多數(shù)的核酸檢測(cè)系統(tǒng)體積龐大，操作復(fù)雜，無(wú)法滿足便攜化的要求。

為此，本文設(shè)計(jì)制作了一種基于等溫?cái)U(kuò)增的便攜式核酸檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)輕量化設(shè)計(jì)等使其便于攜帶和操作，而且檢測(cè)快速，因此有望用于病原體核酸的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。

1 總體方案設(shè)計(jì)

本文設(shè)計(jì)的核酸檢測(cè)系統(tǒng)主要包括溫度控制模塊、熒光檢測(cè)模塊和樣品移動(dòng)模塊，如圖1所示。其中，溫度控制模塊能夠提供核酸擴(kuò)增過(guò)程所需的溫度，確保反應(yīng)正常高效進(jìn)行。熒光檢測(cè)模塊提供檢測(cè)所需的激發(fā)光，同時(shí)將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)采集后進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換以供后續(xù)處理。樣品移動(dòng)模塊能夠移動(dòng)溫度控制模塊對(duì)16個(gè)PCR管進(jìn)行逐個(gè)掃描，使得檢測(cè)系統(tǒng)最多可實(shí)現(xiàn)16個(gè)樣品的同時(shí)檢測(cè)，提高了檢測(cè)通量。同時(shí)，該系統(tǒng)還配備了一臺(tái)高性能工控一體機(jī)，負(fù)責(zé)進(jìn)行人機(jī)交互，方便操作人員進(jìn)行檢測(cè)條件設(shè)置和實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)分析。如圖1所示，基于STM32單片機(jī)設(shè)計(jì)了帶有多路串口通信和步進(jìn)電機(jī)控制脈沖發(fā)生器的主控板，系統(tǒng)的3個(gè)功能模塊通過(guò)下位主控板進(jìn)行協(xié)調(diào)與控制。其中，溫度控制器、熒光檢測(cè)裝置以及上位工控機(jī)經(jīng)過(guò)RS-232串行接口總線進(jìn)行指令和數(shù)據(jù)傳輸；樣品移動(dòng)模塊通過(guò)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器由STM32單片機(jī)的定時(shí)器外設(shè)產(chǎn)生數(shù)字脈沖信號(hào)進(jìn)行控制。此外，為了使檢測(cè)系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)室外操作的便攜化，設(shè)計(jì)的3個(gè)功能模塊均可以利用24 V直流電池進(jìn)行供電。

圖1 核酸檢測(cè)系統(tǒng)總體框圖

2 功能模塊設(shè)計(jì)與搭建

2.1 溫度控制模塊

半導(dǎo)體制冷片是一種基于帕爾貼效應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)電流的方向能夠?qū)ν饨邕M(jìn)行加熱或制冷的熱電器件。它具有體積小、熱慣性小、無(wú)噪聲、可快速變溫等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于核酸擴(kuò)增儀器的溫度控制[7-10]。本文以半導(dǎo)體制冷片為核心設(shè)計(jì)了溫度控制模塊，如圖2所示。半導(dǎo)體制冷片的非工作面采用定制的全銅針式散熱器進(jìn)行散熱，通過(guò)在散熱器外表面涂敷碳納米管以及安裝風(fēng)扇加速空氣流動(dòng)增強(qiáng)其與空氣換熱。半導(dǎo)體制冷片的工作面直接與可同時(shí)放置16個(gè)PCR管的 加熱 臺(tái) 接觸，實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR管的均勻傳熱。為了提高升降溫速率，對(duì)加熱臺(tái)的體積進(jìn)行了優(yōu)化，使其熱容量盡量減小，從而降低變溫過(guò)程所需的能量。為了保證各PCR管之間溫度分布的均勻性，材料選用了導(dǎo)熱性能優(yōu)良的無(wú)氧銅。此外，為了減小外界環(huán)境對(duì)加熱臺(tái)溫度的影響，同時(shí)減少非必要的熱量散失，利用尼龍外殼對(duì)加熱臺(tái)進(jìn)行了包裹，并在其內(nèi)部填充了納米氣凝膠隔熱氈。

圖2 溫度控制模塊實(shí)物

選用雙通道數(shù)字溫度控制器對(duì)半導(dǎo)體制冷片進(jìn)行控制，采用了開(kāi)關(guān)模式電源技術(shù)，能夠高效地控制電流。控制器的工作電壓為24 V，輸出經(jīng)濾波后電流紋波小，可以減小對(duì)半導(dǎo)體制冷片的電流沖擊，延長(zhǎng)其使用壽命。利用熱電阻進(jìn)行溫度反饋，通過(guò)調(diào)節(jié)控制器的PID參數(shù)，溫度控制模塊的平均升溫速率為2.5℃/s，升溫速率較快可以減小前期預(yù)熱時(shí)間。該溫度控制器的溫度控制精度為±0.1℃，可以滿足等溫?cái)U(kuò)增所需的溫度控制要求。

2.2 熒光檢測(cè)模塊

熒光檢測(cè)模塊主要由具有475 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm探測(cè)波長(zhǎng)的高精度微型熒光探測(cè)器和恒流源組成。該模塊采用了正交式光路，可以避免背景噪聲對(duì)熒光值測(cè)量結(jié)果的干擾。采用LED和硅光電二極管作為激發(fā)光源和光探測(cè)器，有效減小了系統(tǒng)的尺寸和功率。光探測(cè)器和信號(hào)處理電路安裝在同一電路板上，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換后通過(guò)串口輸出。相比于模擬信號(hào)，數(shù)字信號(hào)輸出具有更加優(yōu)秀的抗干擾能力，同時(shí)這種模數(shù)轉(zhuǎn)換的就近設(shè)計(jì)能夠減小噪聲干擾，確保光學(xué)檢測(cè)的可靠性。此外，檢測(cè)的光斑直徑為6.5 mm，比PCR管的管口直徑略大，確保了足夠大的采光面積，能夠有效收集熒光信號(hào)。

2.3 樣品移動(dòng)模塊

樣品移動(dòng)模塊的主要作用是通過(guò)移動(dòng)溫度控制模塊，使得熒光檢測(cè)模塊能夠?qū)?6個(gè)PCR管進(jìn)行并行檢測(cè)。

同步帶傳動(dòng)方式具有平穩(wěn)、靜音等優(yōu)點(diǎn)，非常適合輕便、輕載的應(yīng)用場(chǎng)合，因此本文參考CoreXY平面運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)[11-12]，設(shè)計(jì)了基于同步帶傳動(dòng)的樣品移動(dòng)模塊，如圖3所示。該模塊具有X軸和Y軸兩個(gè)直線運(yùn)動(dòng)自由度，均采用步進(jìn)電機(jī)進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。模塊的傳動(dòng)機(jī)構(gòu)由2條同步帶和7個(gè)同步帶帶輪組成，其中2個(gè)帶輪連接步進(jìn)電機(jī)的輸出軸作為驅(qū)動(dòng)輪。2個(gè)電機(jī)固定在機(jī)架上，移動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)依賴于2個(gè)電機(jī)的協(xié)調(diào)動(dòng)作，這種設(shè)計(jì)顯著減小了移動(dòng)模塊的運(yùn)動(dòng)慣性，使其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)切換更加靈活。規(guī)定電機(jī)順時(shí)鐘轉(zhuǎn)速為正，得到移動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速度為：

圖3 安裝控溫樣品臺(tái)的樣品移動(dòng)模塊局部俯視圖

式中：vx和vy分別為移動(dòng)平臺(tái)沿X軸和Y軸方向的運(yùn)動(dòng)速度；ω1和ω2分別為左右電機(jī)的轉(zhuǎn)速；d為電機(jī)輸出同步帶輪的直徑。

為了保證步進(jìn)電機(jī)的開(kāi)環(huán)控制精度，選用了五相步進(jìn)電機(jī)，其基本步距角為0.36°，可進(jìn)行15級(jí)細(xì)分，有利于在移動(dòng)平臺(tái)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中減弱或消除步進(jìn)電機(jī)的低頻振動(dòng)，同時(shí)也能夠提高電機(jī)的角度定位精度。采用光電開(kāi)關(guān)實(shí)現(xiàn)移動(dòng)平臺(tái)的位置歸零，使用S型加減速算法確保步進(jìn)電機(jī)在啟動(dòng)和停止過(guò)程中速度和加速度的連續(xù)性，減小沖擊，進(jìn)一步提高運(yùn)動(dòng)平穩(wěn)性。

2.4 系統(tǒng)控制軟件

本文采用7 inch的工業(yè)平板電腦作為核酸檢測(cè)系統(tǒng)的上位機(jī)，主要實(shí)現(xiàn)人機(jī)交互功能，其他功能模塊的控制均由下位單片機(jī)實(shí)現(xiàn)。上位機(jī)通過(guò)RS-232總線將反應(yīng)參數(shù)和指令傳遞給下位單片機(jī)，并從下位機(jī)讀取溫度和熒光數(shù)據(jù)。采用Python編程語(yǔ)言，基于PyQt5圖形界面框架，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了系統(tǒng)的圖形化控制軟件。該控制軟件可以顯示檢測(cè)系統(tǒng)的運(yùn)行進(jìn)度和狀態(tài)，以數(shù)值方式實(shí)時(shí)顯示加熱臺(tái)的溫度值，以及繪制熒光強(qiáng)度曲線。操作人員只需手動(dòng)將樣品放置到加熱臺(tái)上，點(diǎn)擊“開(kāi)始”按鈕，即可開(kāi)始自動(dòng)化的核酸檢測(cè)。待檢測(cè)結(jié)束后，控制軟件會(huì)自動(dòng)將溫度和熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)保存至電腦，用于后續(xù)的分析處理。

3 系統(tǒng)的應(yīng)用驗(yàn)證

本文使用濃度為4.4×109copies/μL的黃瓜綠斑駁花葉病毒質(zhì)粒作為測(cè)試樣品，基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)其進(jìn)行核酸檢測(cè)。在加熱臺(tái)上隨機(jī)選擇了4個(gè)位置安放4個(gè)PCR管，其中1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)PCR管內(nèi)裝有病毒質(zhì)粒和擴(kuò)增反應(yīng)試劑，4號(hào)PCR管內(nèi)只有反應(yīng)試劑作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。溫度控制參數(shù)為：63℃，15 s；63℃，45 s，35次溫度循環(huán)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需45 min，獲得的核酸擴(kuò)增曲線如圖4所示。從圖中可以看出，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，從1、2、3號(hào)PCR管中檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，最后趨于平衡；由于4號(hào)PCR管內(nèi)沒(méi)有病毒質(zhì)粒，因此從該管中檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度很弱，且不隨循環(huán)次數(shù)的增加而發(fā)生變化。該實(shí)驗(yàn)證明了本文研制的系統(tǒng)可以很好地用于基于等溫?cái)U(kuò)增的核酸檢測(cè)。

圖4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增曲線

4 結(jié)束語(yǔ)

本文設(shè)計(jì)制造了一種基于等溫?cái)U(kuò)增的便攜式核酸檢測(cè)系統(tǒng)?；诎雽?dǎo)體制冷片構(gòu)建的溫度控制模塊的控溫精度可以達(dá)到±0.1℃；采用LED和硅光電二極管作為激發(fā)光源和光探測(cè)器有效減小了熒光檢測(cè)模塊的尺寸和功率，高度集成的采集電路提高了光學(xué)檢測(cè)的抗干擾能力；參考CoreXY平面運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的樣品移動(dòng)模塊，具有運(yùn)動(dòng)平穩(wěn)、噪聲低等特點(diǎn)，而且顯著減輕了系統(tǒng)的重量。操作人員通過(guò)上位工控機(jī)的控制軟件進(jìn)行檢測(cè)參數(shù)設(shè)置，發(fā)送給下位單片機(jī)控制上述模塊完成檢測(cè)。檢測(cè)系統(tǒng)可以采用24 V直流電池進(jìn)行供電，有利于室外操作的便攜化。利用該系統(tǒng)，基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)黃瓜綠斑駁花葉病毒質(zhì)粒進(jìn)行了核酸檢測(cè)，在45 min內(nèi)獲得了檢測(cè)結(jié)果。