曹林青，詹發(fā)強，楊 蓉，侯新強，包慧芳，侯 敏，王 寧，龍宣杞

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國最大的葡萄產(chǎn)區(qū)，2016年產(chǎn)量達267.6×104t左右，位居全國第一[1]。葡萄灰霉病(gray mold)是由灰葡萄孢(Botrytiscrnerea)引起的一種比較常見且危害嚴重的病害，由于葡萄采后的貯藏環(huán)境利于灰霉菌的生長，每年造成葡萄采后的腐爛損失率達30%以上[2]。國內(nèi)外葡萄保鮮技術(shù)主要是低溫結(jié)合二氧化硫(Sulfur Dioxide，SO2)防腐貯藏[3,4]。SO2的有效殺菌劑量和使葡萄受傷害的劑量相近，所以使用劑量不好控制，當(dāng)SO2劑量過高時，葡萄抗氧化的酶促防御系統(tǒng)會受到損害，果實被漂白并產(chǎn)生異味[5]。嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdussp.)是小卷蛾斯氏線蟲(Steinernemacarpocapsae)的共生細菌，生存于侵染期線蟲前腸的菌囊內(nèi)。該菌隨線蟲的侵染進入寄主血腔，迅速大量增殖并產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，為寄主線蟲的生存提供合適的小生境。嗜線蟲致病桿菌的這一生理代謝特性已引起重視，并已從代謝物中發(fā)現(xiàn)了幾種新結(jié)構(gòu)的抗生素[6]對細菌、酵母菌和真菌的生長具有廣泛抑制活性[7, 8 ]。研究葡萄的采后貯藏保鮮技術(shù)，對提高鮮食型葡萄的貯藏保鮮有重要意義。【前人研究進展】培養(yǎng)的溫度和曝氣影響細菌的生長，影響抗生素的產(chǎn)生[9, 10]。Xenorhabdusspp為兼性厭氧菌，Chirayu Sa-uth等[11]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了XenorhabdusstockiaePB09抗真菌活性的最佳培養(yǎng)基組成(蔗糖、酵母提取物、氯化鈉和磷酸氫二鉀等)。邱德文等[12]對致病桿菌D43菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了研究，同時對該菌代謝過程pH值、還原糖、總糖、氨基氮與抗生素產(chǎn)量的關(guān)系進行了分析。接菌量較低時，菌體生長的遲滯期過長，致使培養(yǎng)發(fā)酵耗時較長。但接入過多體積的菌體時，可能會帶進過多的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物反饋抑制，從而影響抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。在液體發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，裝液量和轉(zhuǎn)速影響著菌株對氧氣的需求程度[14]?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有葡萄灰霉病生防菌Xenorhabdusnematophila-ALL對其抑菌率相對不高且效價不穩(wěn)定。需通過發(fā)酵條件優(yōu)化以期提高其抑菌能力和水平?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對嗜線蟲致病桿菌的液體發(fā)酵進行單因素和響應(yīng)面法發(fā)酵優(yōu)化，研究不同的培養(yǎng)基和不同的培養(yǎng)條件對灰葡萄孢的抑制作用，為開發(fā)和應(yīng)用共生細菌Xenorhabdusnematophila-ALL生物防治葡萄灰霉菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試真菌

灰葡萄孢(Botrytiscinerea，簡稱B.cinerea)。

1.1.2 供試共生細菌

嗜線蟲致病桿菌(ALL)保存于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所農(nóng)用微生物實驗室。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

NBTA:營養(yǎng)瓊脂45 g，溴百里酚蘭 0.025 g，氯化三苯基四氮唑 0.04 g，蒸餾水1 L ；

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L；

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂14.0 g，蒸餾水1 L。1×105Pa滅菌20 min；

TSY培養(yǎng)基：酵母膏5 g，TSB 40 g，蒸餾水1 L，pH7.2～7.4；

TSB培養(yǎng)基：大豆胨5 g，胰蛋白胨15 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH7.2～7.4；

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 0 g，酵母膏 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 L，pH7.2～7.4 ;

NB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH7.2～7.4；

1.1.4 儀器與設(shè)備

MSSPX-250型生化培養(yǎng)箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，Eppendorf5418R離心機，OLYMPUS CX41相差顯微鏡，OLYMPUS SZ61體式顯微鏡，ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器。

1.2 方 法

1.2.1 共生菌分離

無菌操作臺中，將由昆蟲病原線蟲致死的大蠟螟幼蟲放入75%的乙醇中，浸沒10 s左右，無菌濾紙吸去多余的酒精，剪開腹足，接種針沾取或擠出流出的液體至NBTA平板培養(yǎng)基上，28℃條件下暗培養(yǎng)36～48 h，直至出現(xiàn)能夠吸附藍色且周圍有透明圈即為目標菌[15]。

1.2.2 無菌上清液制備

將培養(yǎng)好的藍色Ⅰ型菌接種于NB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 h得到種子液，以1%的比例接種于NB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，在4℃，10 000 r/min，離心10 min，將離心得到的上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

1.2.3 菌絲生長抑制率

將離心過濾處理過的無菌上清液，與已滅菌冷卻至42℃的NA培養(yǎng)基以1∶100的比例混合均勻后倒入一次性培養(yǎng)皿中，每個處理4個重復(fù)。當(dāng)對照組菌絲生長至培養(yǎng)皿邊緣時測定各個處理的抑制率。

抑制率=(對照組菌塊直徑-試驗組菌塊直徑)/(對照組菌塊直徑-菌餅直徑)× 100%。

1.2.4 單因素試驗

不同的培養(yǎng)基(NB、LB、TSB、TSY)，不同的培養(yǎng)時間(24、48、72、96、120、144 h)，種子液培養(yǎng)時間(12、16、20、24、28 h)，接種量(1%，3%，5%，7%，9%)，pH值(5，6，7，8，9)，轉(zhuǎn)速(160、180、200 r/min)，裝液量(10、20、30、40、50 mL/100mL)等因素對葡萄灰霉菌有顯著抑制效果的因素為后續(xù)的響應(yīng)面試驗。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

選取對試驗影響較為顯著的3個因素，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計，進行三因素三水平響應(yīng)面分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010計算數(shù)據(jù)，利用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用Duncan多重比較檢驗法進行顯著性分析。采用軟件Design-Expert V8.0.5進行響應(yīng)面的數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素培養(yǎng)條件對ALL菌株發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

2.1.1 培養(yǎng)基對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，不同的培養(yǎng)基對共生細菌的影響較大，差異性顯著(P<0.05)。TSY培養(yǎng)基對灰葡萄孢(B.cinerea)的菌絲抑制率最高，達48.12%。其次為TSB培養(yǎng)基，其抑制率為27.28%。LB培養(yǎng)基的抑制率最低，僅18.19%。TSB培養(yǎng)基與NB培養(yǎng)基的抑菌活性基本一致。因此將篩選出的TSY培養(yǎng)基作為后續(xù)對目標菌株ALL發(fā)酵條件優(yōu)化的初始培養(yǎng)基。圖1

圖1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液下灰葡萄孢(B. cinerea)的抑制率變化

2.1.2 培養(yǎng)時間對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，培養(yǎng)不同的時間對ALL菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性差異性顯著，24～120 h呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且在72 h表現(xiàn)出最強的抑菌活性。24 h時的抑菌活性最低，呈現(xiàn)這種趨勢的原因可能是在培養(yǎng)初期，搖瓶內(nèi)菌體濃度暫時未達到最高值，隨著時間的延長，菌體濃度升高，次生代謝產(chǎn)物量大幅積累，抑菌活性顯著提高；隨著培養(yǎng)基內(nèi)有限的營養(yǎng)和空間被用完，現(xiàn)抑制率降低。圖2

圖2 不同時間發(fā)酵上清液下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.3 種子液對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，培養(yǎng)不同時間的種子對B.cinerea菌絲的抑制率不同，在12～28 h內(nèi)，種子液的抑制率持續(xù)上升并在28 h抑制率達到最高，在12 h抑制率為0，16～24 h的種子液幾乎無明顯的抑制率，且在28 h的種子液抑制率顯著高于其他時間的抑制率(P<0.05)。圖3

圖3 不同種子上清液下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.4 接菌量對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，不同比例接菌量對灰葡萄孢(B.cinerea)菌絲生長無明顯的顯著差異性(P>0.05)，5%的接菌量時，菌絲抑制率較高。圖4

圖4 不同接菌量下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.5 通氣量對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，各不同的裝液量對灰葡萄孢(B.cinerea)菌絲生長的抑制率有顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)裝液量為50%時，對菌絲抑制率最高，達到51.8%，顯著高于其他不同體積的裝液量。圖5

圖5 裝液量對灰葡萄孢(B.cinerea)抑制率變化

研究表明，轉(zhuǎn)速在180 r/min時，對菌絲生長抑制率最高且顯著高于其它兩個轉(zhuǎn)速的抑制率，達42.76%。圖6

圖6 不同轉(zhuǎn)速下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.1.6 pH對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

研究表明，不同初始pH值對B.cinerea菌絲生長的抑制率不同，在初始pH為7時抑制率最高。起始 pH 直接影響共生細菌的生長環(huán)境，pH過高、過低都不利于菌體的生長。圖7

圖7 不同初始pH值下灰葡萄孢(B.cinerea)的抑制率變化

2.2 響應(yīng)面因素優(yōu)化分析

研究表明，擬合二次回歸方程如下：

Y=+82.65+1.86A+4.59B+7.56C+0.052AB+2.47AC+0.28BC-21.41A2-5.84B2-6.74C2

Y是因變量(抑制率)

R2=0.981 2R2adj=0.957 0

F=40.53，P<0.01，差異極顯著，模型建立有意義；R2=0.981 2，回歸方程擬合度良好，失擬項F=4.06，P>0.05，無顯著性差異，非正常誤差較小，得到灰霉菌的最佳抑制率。培養(yǎng)基初始pH值(A)、培養(yǎng)時間(B)、裝液量(C)對灰霉菌抑制率的主次影響順序:C>B>A。一次項B.C和二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值影響極顯著，其余項對響應(yīng)值影響不顯著。表1～3

表1 因素水平編碼

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計

表3 回歸模型方差

2.3 發(fā)酵時間與初始pH值對灰葡萄孢抑菌活性的影響

研究表明，當(dāng)發(fā)酵時間恒定時，初始pH值在5～7時，抑制率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。同樣地，當(dāng)初始pH值一定時，隨著發(fā)酵時間在60～84 h時，抑制率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。裝液量水平為0時，發(fā)酵時間與pH交互作用的等高線侵向于圓形，二者交互作用無顯著性。

當(dāng)裝液量恒定時，初始pH值在5～7時，抑制率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)初始pH值一定時，裝液量在40～60 mL/100 mL時，抑制率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。發(fā)酵時間水平為0時，裝液量與pH交互作用的等高線更接近于圓形，裝液量與初始pH值的交互作用不顯著。

當(dāng)裝液量不變時，發(fā)酵時間在60 h與84 h之間時，抑制率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間一定時，在裝液量在40與60 mL/100 mL時，抑制率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。初始pH值水平為0時，裝液量與發(fā)酵時間交互作用的等高線非橢圓形，二者交互作用不顯著。圖8

3 討 論

在單因素優(yōu)化試驗中，Xenorhabdusnematophila-ALL在TSY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)48 h后其抑制率最高，其次為TSB培養(yǎng)基，與馬麗麗等[14]研究結(jié)果一致。要篩選出一種培養(yǎng)基作為發(fā)酵優(yōu)化的初始培養(yǎng)基以期得到更多抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量，4種培養(yǎng)基的配料成分分析，判斷大豆胨，胰蛋白胨是產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的關(guān)鍵成分。通過對發(fā)酵時間的優(yōu)化，拮抗菌對灰葡萄孢的抑制率呈現(xiàn)先上升后下降又上升的趨勢，并在72 h時顯示出最高的抑制率，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是與細菌利用營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，影響其抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。接菌量會影響Xenorhabdusnematophila-ALL生長速度，搖瓶內(nèi)細菌起始量越多的可能會較早達到最大值，能早合成細菌的代謝產(chǎn)物，但在研究中，不同的接菌量無顯著差異。溶氧量影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生，在液體搖床發(fā)酵培養(yǎng)過程中，裝液量和轉(zhuǎn)速影響著溶氧量，故兩者需結(jié)合起來分析[16-19]。研究顯示，當(dāng)容積為50%時，轉(zhuǎn)速為180 r/min時抑菌活性最高，表明了此條件為拮抗菌發(fā)酵的最佳通氣量。pH作為共生細菌生長的重要環(huán)境因子，對其生長代謝及抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生有較大影響[20]。pH能影響細胞原生質(zhì)的電荷，引起各種酶活性的變化，影響細菌底物的利用率和細胞結(jié)構(gòu)，最終影響細胞的生長和產(chǎn)物的形成[21, 22]。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，抑制率最高，這與郭薔薇等[23]在相同pH值條件下通過嗜線蟲致病桿菌胞外產(chǎn)物對番茄灰霉病的結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)在中性環(huán)境中，Xenorhabdusnematophila發(fā)酵液能產(chǎn)生一些多肽，水溶性蛋白類抑菌物質(zhì)，而在酸性和堿性環(huán)境中不利于該物質(zhì)的產(chǎn)生。研究經(jīng)過響應(yīng)面分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標菌株發(fā)酵上清液初始pH值，發(fā)酵時間，裝液量等3個因素對灰葡萄孢(B.cinerea)菌絲生長的抑制率較高，通過響應(yīng)面分析發(fā)現(xiàn)裝液量是顯著的影響因子，其次是發(fā)酵時間，而培養(yǎng)基初始pH值不顯著。方香玲[24]對致病桿菌TB菌株進行了RSM發(fā)酵優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，篩選出最佳培養(yǎng)基為蛋白胨，培養(yǎng)條件為發(fā)酵時間(54.07 h)，初始pH值(7.59)以及接菌量(9.95%)等3個因素，優(yōu)化后提高了近73%，Wang等[25]對致病桿菌YL001菌株進行了RSM優(yōu)化，確定了培養(yǎng)基最佳初始pH值7.64，裝液量10%，轉(zhuǎn)速220 r/min，接種量15%等，可達到最大的抗生素活性。

圖8 各因素交互作用下B. cinerea 抑制率響應(yīng)面圖及等高線

4 結(jié) 論

最適培養(yǎng)基為TSY，最適培養(yǎng)時間為72 h，最適種子液為28 h，最適接菌量為5%，最適通氣量為50 mL/100 mL、180 r/min，最適pH值為7.00。該優(yōu)化條件為：培養(yǎng)基初始pH值為7.12，裝液量56%，發(fā)酵培養(yǎng)時間為77 h，經(jīng)驗證抑菌率為87.70%，比優(yōu)化前提高了1.82倍。

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