游 牧，王凱月，李強(qiáng)峰

(1.青海省林木種苗總站，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

柳屬植物多為灌木，稀喬木，無頂芽，是北半球的主要木本樹種之一，具有喜濕、耐寒、喜光亦耐旱等特點(diǎn)[1]。柳屬植物往往分布于氣候惡劣，土壤貧瘠的環(huán)境中，所以形成了易成活、抗性較強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等特有的生理生態(tài)特性[2]。在我國柳屬植物約有250種，主要分布于西北、西南和東北地區(qū)，青藏高原是現(xiàn)代柳屬植物的重要分布中心之一。青海地處青藏高原東北部，是我國柳屬植物較為豐富的地區(qū)之一[3]。

近年來全球氣溫不斷升高[4]，而柳屬植物大多喜濕冷，對(duì)高溫的耐受力不強(qiáng)。高溫條件不但影響柳屬植物的生長(zhǎng)表現(xiàn)，更是制約柳屬植物資源引種的重要因子。而國內(nèi)關(guān)于柳屬植物的耐熱性適應(yīng)研究較少，因此研究青海地區(qū)柳屬植物的耐熱性，建立一套比較完備的耐熱性評(píng)價(jià)指標(biāo)體系是非常重要的基礎(chǔ)工作。本研究以山生柳、烏柳、金絲柳、旱柳這4種青海地區(qū)常見的柳屬植物為試驗(yàn)材料，測(cè)定其在高溫脅迫下葉片的4個(gè)生理指標(biāo)，比較4種柳屬植物的耐熱性，為青海高海拔地區(qū)柳屬植物的引種栽培、園林綠化等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的4個(gè)柳屬植物分別為山生柳、烏柳、金絲柳、旱柳，均來源于青海大通植物園。植物園位于西寧市寧張公路29km處，海拔2460m，年平均降水量532.6mm，年日照時(shí)數(shù)2275.5-2836.8h，年平均氣溫3.9℃，植物生長(zhǎng)期為158d[5]。是一個(gè)集科研、生產(chǎn)、旅游為一體的綜合園林基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取山生柳、烏柳、金絲柳、旱柳4個(gè)柳屬植物1年生扦插苗的苗干截取插穗，于2020年4月上旬扦插在直徑30cm、高30cm的塑料花盆中，每盆一株，盆中裝入耕作土(田間持水量為30%)，期間在室溫條件下進(jìn)行常規(guī)的養(yǎng)護(hù)管理及病蟲害防治，保證其正常生長(zhǎng)。

在8月份將試驗(yàn)材料放入人工氣候箱中進(jìn)行熱脅迫處理，設(shè)置20℃(CK)、30℃、40℃三個(gè)溫度梯度，每個(gè)溫度下恒溫處理三天再依次升高到下一溫度梯度，測(cè)定不同溫度處理下4個(gè)柳屬植物的葉片的SOD(超氧化物歧化酶)活性、脯氨酸(Pro)含量、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化氫(H2O2)含量四個(gè)生理生化指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)三次，采用隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)法對(duì)4個(gè)柳屬植物進(jìn)行耐熱性綜合評(píng)價(jià)。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

(1)SOD(超氧化物歧化酶)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[6]。

(2)Pro(脯氨酸)含量的測(cè)定采用酸性茹三酮法[7]。

(3)CAT(過氧化氫酶)活性測(cè)定采用紫外吸收法[8]。

(4)H2O2(過氧化氫)含量測(cè)定采用分光光度法[9]。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法及數(shù)學(xué)模型

11個(gè)山生柳無性系的葉片指標(biāo)數(shù)據(jù)采用模糊隸屬函數(shù)法[10]進(jìn)行綜合評(píng)判，用隸屬度公式對(duì)試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換，再將各指標(biāo)隸屬函數(shù)值取平均值進(jìn)行無性系間相互比較。使用Excel2010和SPSS23.0進(jìn)行指標(biāo)間的方差分析、相關(guān)性分析。

隸屬函數(shù)公式為：

Xij=(xij-xjmin)/(xjmax-xjmin)

(1)

Xij=(xjmax-xij)/(xjmax-xjmin)

(2)

式中：Xij為i樹種j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xij為i樹種的j性狀值，Xjmin為各樹種j性狀的最小值，Xjmax為各樹種j性狀的最大值。當(dāng)j性狀與植物的耐寒性成正相關(guān)時(shí)用(1)式，當(dāng)j性狀與植物的耐寒性成負(fù)相關(guān)時(shí)用(2)式。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種柳屬植物超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

如圖1所示，供試材料隨著處理溫度的逐漸升高，其SOD活性的變化趨勢(shì)基本相似，均呈現(xiàn)隨溫度升高而逐漸升高的變化趨勢(shì)。烏柳、山生柳、金絲柳SOD活性在高溫脅迫過程中增加的較緩慢，而旱柳SOD活性在20℃(CK)-30℃升高明顯。SOD活性在高溫脅迫過程中的增加反映了四個(gè)樹種隨著溫度的升高，超氧自由基不斷增加，刺激了SOD活性的增強(qiáng)。由圖1可以看出旱柳SOD活性水平偏高，由于SOD活性與抗逆性成正相關(guān)，說明其耐熱性較強(qiáng)。

圖1 高溫處理下四種柳屬植物超氧化物歧化酶活性變化折線圖

2.2 四種柳屬植物脯氨酸(Pro)含量的變化

大量文獻(xiàn)研究表明，溫度脅迫下耐熱的植物體內(nèi)積累的脯氨酸比不耐熱的植物品種多，而且耐熱性強(qiáng)的植物體內(nèi)脯氨酸的含量維持積累時(shí)間長(zhǎng)，維持積累量更大。植物體內(nèi)脯氨酸可以調(diào)節(jié)滲透壓并具有保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用，與植物的抗逆性關(guān)系密切[11-12]。圖2反映了相同溫度處理不同樹種葉片脯氨酸的含量變化，由圖2可以看出，不同樹種的葉片游離脯氨酸變化有兩種類型，一種是先升高后降低，如旱柳，金絲柳，山生柳在20℃(CK)-30℃葉片脯氨酸累積增加，但30℃-40℃脯氨酸累積反而有下降的趨勢(shì)，在30℃達(dá)到峰值，其中山生柳的增幅最大為9.87%，此結(jié)果表明當(dāng)溫度高于30℃時(shí)已不適合旱柳、金絲柳、山生柳的正常生長(zhǎng)。另一種類型就是如烏柳在高溫脅迫整個(gè)過程中脯氨酸含量均呈上升趨勢(shì)，且在整個(gè)高溫脅迫過程中烏柳葉片內(nèi)游離脯氨酸的含量處于較高水平，表明其耐熱性較強(qiáng)。

圖2 高溫處理下四種柳屬植物脯氨酸含量變化折線圖

2.3 四種柳屬植物過氧化氫酶(CAT)活性的變化

CAT活性的大小與植物代謝強(qiáng)度以及抗性有著密切的關(guān)系[13]，如圖3所示，供試材料隨著處理溫度的逐漸升高，其CAT活性的變化趨勢(shì)基本分為兩種，其中山生柳和金絲柳呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢(shì)，而烏柳、旱柳CAT活性在CK-30℃先下降，30℃-40℃再逐漸升高，在整個(gè)高溫處理過程中，明顯可以看出旱柳CAT活性一直處于較高水平，說明其抗熱性較強(qiáng)，而山生柳的CAT活性較低，說明其耐熱性較弱。

圖3 高溫處理下四種柳屬植物過氧化氫酶活性變化折線圖

2.4 四種柳屬植物過氧化氫(H2O2)含量的變化

高溫脅迫對(duì)四種植物葉片過氧化氫含量的影響如圖4所示，四種植物過氧化氫含量均呈現(xiàn)先升高再緩慢降低的變化規(guī)律。在CK-30℃過氧化氫含量上升，升高的原因可能是在CK-30℃過程中過氧化氫酶(CAT)增加緩慢或出現(xiàn)降低；30℃-40℃過氧化氫含量降低，降低的原因是由于高溫脅迫下過氧化氫酶(CAT)活性的增加催化過氧化氫分解成氧和水。四種植物過氧化氫含量均在30℃時(shí)達(dá)到最大值，但增加幅度存在差異，其中山生柳相較于CK過氧化氫含量的增幅最大，增加幅度為138.97%，且在整個(gè)高溫脅迫過程中其過氧化氫含量處于一個(gè)較高水平，由于過氧化氫含量與抗逆性呈負(fù)相關(guān)，所以證明山生柳的耐熱性較差。在整個(gè)高溫脅迫過程中，金絲柳、烏柳的過氧化氫含量處于較低水平，說明其抗熱性較強(qiáng)。在溫度恢復(fù)試驗(yàn)中，四種柳屬經(jīng)過高溫脅迫處理后恢復(fù)至20℃，四種柳屬植物過氧化氫含量均高于高溫處理前水平。

圖4 高溫處理下四種柳屬植物過氧化氫含量變化折線圖

2.5 四種柳屬植物耐熱性的綜合評(píng)價(jià)

由于不同植物的耐熱機(jī)制不同，所以對(duì)耐熱相關(guān)指標(biāo)的響應(yīng)也存在差異，單一指標(biāo)并不能準(zhǔn)確、真實(shí)地反映植物的耐熱性強(qiáng)弱[14]，因此，采用隸屬函數(shù)法得出各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及各材料的平均隸屬度。4個(gè)柳屬植物耐熱性指標(biāo)的隸屬平均值越大則表明該樹種耐熱性越強(qiáng)，由此做出耐熱性排序：旱柳>金絲柳>烏柳>山生柳。

表1 溫度處理下山生柳4個(gè)柳屬植物耐熱性綜合評(píng)價(jià)

2.6 相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS23.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)SOD、CAT活性、過氧化氫含量、脯氨酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析。表2表明，過氧化氫含量與SOD活性顯著相關(guān)，與脯氨酸含量呈極顯著相關(guān)。

表2 四種柳屬植物耐熱性指標(biāo)相關(guān)系數(shù)

3 討論與結(jié)論

植物耐熱性往往是植物與環(huán)境相互作用的結(jié)果[15，16]，不同的植物其耐熱機(jī)制也不盡相同，對(duì)某一特定耐熱指標(biāo)的響應(yīng)也不盡相同，單一的指標(biāo)難以準(zhǔn)確地反映植物的耐熱性強(qiáng)弱，多個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)則較為全面準(zhǔn)確[17]。SOD是植物體保護(hù)系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶之一，在高溫脅迫下，SOD可以通過激活植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，降低膜脂過氧化作用，啟動(dòng)植物的防御系統(tǒng)[18]。SOD的活性可以間接證明植物抗性的強(qiáng)弱，SOD活性的上升證明了高溫脅迫下其清除自由基的能力增強(qiáng)[19]。本研究中，4個(gè)柳屬植物均表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，其中旱柳葉片SOD的活性較高，證明其耐熱性較強(qiáng)；在植物抗逆系統(tǒng)中脯氨酸是一種理想的有機(jī)溶質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物，在植物正常的生理活動(dòng)中，脯氨酸的含量很低，但處于逆境時(shí)，就會(huì)增加脯氨酸的含量來維持植物細(xì)胞體內(nèi)的正常代謝過程[20]，其積累指數(shù)反映了植物逆境條件下的滲透調(diào)節(jié)能力[21]。目前對(duì)植物體中脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)作用研究最多，多數(shù)情況下認(rèn)為，脯氨酸的含量與植物的耐熱性強(qiáng)弱緊密相關(guān)，當(dāng)植物處于高溫脅迫時(shí)脯氨酸含量的上升速率與耐熱性成正比。因此研究環(huán)境因子脅迫可以把脯氨酸的含量變化作為抗性生理指標(biāo)[22，23]。在高溫脅迫過程中旱柳，金絲柳，山生柳在20℃(CK)-30℃葉片脯氨酸累積增加，但30℃-40℃脯氨酸累積反而有下降的趨勢(shì)，而烏柳葉片內(nèi)游離脯氨酸的含量一直表現(xiàn)為升高趨勢(shì)。這與馬寧[24]對(duì)裸仁南瓜及張施君[25]對(duì)百合品種耐熱性研究結(jié)果一致。而4個(gè)柳屬植物在高溫脅迫下葉片中CAT活性的變化存在較大差異，其變化趨勢(shì)基本分為兩種，其中山生柳和金絲柳呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢(shì)，而烏柳、旱柳過氧化氫酶活性在20-30℃先下降，30℃-40℃再逐漸升高，這也說明了無法用單一指標(biāo)來評(píng)價(jià)植物耐熱性的強(qiáng)弱，植物耐熱性是一個(gè)復(fù)雜的綜合性狀。植物在受到高溫脅迫時(shí)，細(xì)胞膜被破壞，膜透性增強(qiáng)，從而發(fā)生過氧化作用，導(dǎo)致葉片中的H2O2含量增加[26]，本研究中，四種植物在高溫脅迫下葉片過氧化氫含量均呈現(xiàn)先升高再緩慢降低的變化規(guī)律。金絲柳、烏柳的過氧化氫含量處于較低水平，說明其抗熱性較強(qiáng)。通過對(duì)4個(gè)柳屬植物運(yùn)用隸屬函數(shù)法以及生理指標(biāo)的相關(guān)性分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：耐熱性排序：旱柳>金絲柳>烏柳>山生柳。

本研究?jī)H對(duì)4個(gè)柳屬植物一年生苗木進(jìn)行了高溫脅迫下生理生化指標(biāo)的測(cè)定，尚不能完全反映4個(gè)柳屬植物的耐熱性。但本文所測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果具有可對(duì)比性，可以體現(xiàn)出4個(gè)柳屬植物耐熱性的強(qiáng)弱，對(duì)今后青海高海拔地區(qū)柳屬植物的引種栽培、園林綠化等提供理論參考。