周瑞鵬，賴澤成1，，張春源1，，呂正陽1，，邵登科1，，王墨羽，王啟月，沈瑜琦，王榮波，葉文雨1，

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350013)

菌草是一種不僅可以用于栽培，還可以應(yīng)用于藥材研究的新型草本植物。優(yōu)良菌草的選育需要通過系統(tǒng)的三級篩選才可得出，該方法最早是由福建農(nóng)林大學(xué)的林占熺教授發(fā)明而來的，選育出來的菌草不僅可以作為藥用菌栽培的基質(zhì)，還對環(huán)境的保護具有重要的作用[1]?！熬G洲一號”(Oasis NO.1)是菌草品種較為重要的一種，它在減少水土流失，鹽堿地的治理，以及防風(fēng)固沙等方面均有廣闊的應(yīng)用前景[2]。植物依賴于土壤才可完成復(fù)雜的生長發(fā)育繁殖等過程，土壤的物理性質(zhì)、化學(xué)成分及生物群落的組成都顯著影響著植物的生長發(fā)育過程[3]。

微生物是土壤的重要組分，它們數(shù)量大、種類多、分布廣、繁殖快，幾乎所有土壤物質(zhì)的轉(zhuǎn)化都需要在土壤微生物的介導(dǎo)下完成，由此可見土壤微生物對土壤的生態(tài)功能具有重要的作用是其它物種所不可取代的[4]。對植物的生長發(fā)育而言，土壤微生物的作用是具有兩面性的，有些土壤微生物對植物具有致病作用，會顯著阻礙植物的生長發(fā)育甚至是導(dǎo)致植物死亡，例如尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)會引起銀杏出現(xiàn)根際腐爛的病癥[5]，立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)會導(dǎo)致高粱出現(xiàn)立枯病，嚴重時可導(dǎo)致其幼苗死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失[6]。而有些微生物對植物的生長則具有顯著的促進作用，如芽孢桿菌屬下的細菌具有分解無機磷的能力，促進植物對土壤無機磷元素的利用[7]；某些細菌在生長過程中可以釋放赤霉素、生長素或激動素類物質(zhì)，從而提高植物的生長[8]；某些真菌的菌絲可以與植物的根系一起成聯(lián)合體，這種結(jié)構(gòu)有利于提高植物對逆境情況的抗性，促進植物生長[9]。由此可見，土壤微生物研究不僅可以減少植物受到病原菌的干擾，對植物生長具有促進作用，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、經(jīng)濟發(fā)展等均具有重要作用[10]。

本研究從內(nèi)蒙古烏蘭察布“綠洲一號”的土壤中分離得到兩株細菌，并對其基本生物學(xué)性質(zhì)、促生能力等方面開展研究，希望能夠為植物促生機理的研究提供一定的理論基礎(chǔ)與研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

供試細菌為內(nèi)蒙古烏蘭察布“綠洲一號”土壤中分離得到，編號為NSL4、NSL16。

供試培養(yǎng)基包括細菌生長培養(yǎng)基：固體LB培養(yǎng)基、液體LB培養(yǎng)基；促生能力培養(yǎng)基：無機磷培養(yǎng)基。

供試玉米品種為“鄭單958”由合肥市合豐種業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 土壤細菌的分離與純化

利用五點取樣法用土鉆采集生長健壯的“綠洲一號”的根際土及非根際土，并將五個樣品混合在一個無菌袋中，后將樣品置于4℃冰箱保存并于1d內(nèi)對樣品進行處理。稱取10g土壤樣品，加入90ml滅菌雙蒸水，將混合懸濁液置于120r/min的搖床上震蕩30min后靜置20min，此時上清液為濃度10-1g/ml的土壤懸濁液，用移液槍吸取1ml上清懸液到試管中，后加入9ml滅菌雙蒸水，制成濃度為10-2的土壤懸濁液，重復(fù)以上步驟分別制得濃度為10-3，10-4、10-5的懸濁液。從濃度為10-3、10-4、10-5土壤懸濁液中分別吸取1ml在固體LB培養(yǎng)基上將懸濁液均勻涂布。每個濃度梯度設(shè)置三個平行。培養(yǎng)1d后挑選適合的單菌落進行轉(zhuǎn)接，連續(xù)純化三次后，挑取生長良好的單菌落至5ml液體LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)16-18h，吸取900μl菌液至凍存管中再加入300μl甘油，后將兩個菌株置于-20℃冰箱對其進行保藏。每個菌株保存三管。

1.2.2 土壤細菌的分子鑒定

用液體LB培養(yǎng)基對分離的細菌活化培養(yǎng)18h，以菌液作為模板，引物為細菌通用引物：27F、1492R[11]，PCR反應(yīng)體系參照蔡文斌[12]等的方法。PCR產(chǎn)物委托北京擎科生物科技有限公司進行測序分析。將測序結(jié)果與NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中記錄的已知序列進行blast比對，后用軟件MEGA7.0采用鄰近相接法分別繪制出菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 土壤細菌的生物學(xué)性質(zhì)分析

以芽孢桿菌的生理生化檢測要求進行接觸酶試驗[13]，用液體LB培養(yǎng)基對分離的細菌活化培養(yǎng)18h后，按照王笠等[14]方法進行革蘭氏染色試驗。

1.2.4 土壤細菌的促生能力分析

用液體LB培養(yǎng)基對分離細菌活化培養(yǎng)18h后，按照張美珍等[15]方法進行無機磷溶解試驗，根據(jù)能否產(chǎn)生溶磷圈初步判別細菌是否具有解磷能力，同時對細菌菌落直徑(d)與溶磷圈直徑(D)進行測量，計算溶磷效率(D/d)從而初步的判斷細菌解磷能力。

1.2.5 土壤細菌的盆栽試驗

取27粒飽滿的玉米種子，充分洗去其包衣后，每盆播種三粒種子。選取6盆將其均分為兩組用于菌液灌根處理。待種子長出第三片真葉時，將生長良好的細菌挑至60ml液體LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)18h后，使用分光光度計調(diào)整菌液OD600于1.000左右，按每盆30ml的量進行第一次灌根處理。剩余三盆作為對照組用等量的液體LB培養(yǎng)基進行灌根處理。后以7d為周期再灌根處理兩次。第三次灌根結(jié)束后一周，以試驗組和對照組植株進行拍照，并對植株的株高、根長、莖粗、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下干重進行測量。同時按照袁越[16]的方法對植物葉綠體色素含量、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)活性進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細菌NSL4和NSL16的形態(tài)學(xué)特征

從內(nèi)蒙古烏蘭察布“綠洲一號”土壤中分離得到兩株細菌，分別編號為NSL4、NSL16。由圖1A、圖1B可以看出，NSL4和NSL16菌落呈淡黃色圓形，邊緣規(guī)則、表面粘稠且濕潤，菌落直徑約為1mm左右。從圖1C、圖1D革蘭氏染色結(jié)果可知NSL4和NSL16均為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀，初步判斷這兩株細菌為芽孢桿菌(Bacillussp.)

圖1 土壤細菌NSL4和NSL16的形態(tài)學(xué)特征

2.2 土壤細菌NSL4和NSL16的分子鑒定

以27F作為正向引物，1492R作為反向引物對菌液進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)marker條帶可以判斷NSL4和NSL16菌株的16srDNA基因片段大約為1600bp。將PCR產(chǎn)物送測后得到16srDNA基因序列，將測序結(jié)果與NCBI中記錄的已知序列進行blast比對，選取并下載同源性較高的序列，采用軟件MEGA7.0進行同源比對，并以鄰近相接法分別構(gòu)建NSL4和NSL16的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2A、圖2B所示。由圖2A、圖2B的結(jié)果可以看出土壤細菌NSL4和NSL16均與阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)匯聚在同一支且置信度分別達到92%，98%，因此可判斷NSL4與NSL16同屬于阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。

圖2 土壤細菌NSL4、NSL16的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 土壤細菌NSL4和NSL16的生物學(xué)性質(zhì)分析

刮取兩份NSL4細菌菌落于載玻片上，一份加入適量的過氧化氫，另一份不做處理。以相同方法對NSL16進行操作，結(jié)果如圖3A、圖3B所示。加入過氧化氫后，菌落周圍迅速產(chǎn)生大量氣泡，并產(chǎn)生氧氣，據(jù)此可判斷這兩株細菌均具有產(chǎn)生過氧化氫酶的能力。

圖3 土壤細菌NSL4、NSL16接觸酶試驗

2.4 土壤細菌NSL4和NSL16的促生能力

在無機磷的培養(yǎng)基上，兩株細菌菌落周圍均產(chǎn)生了透明圈，結(jié)果如圖4A、圖4B所示，這表明了NSL4和NSL16均具有分解無機磷的能力，具有一定的促進植物生長的能力。分別量取NSL4、NSL16的菌落直徑(d)與溶磷圈直徑(D)，計算溶磷效率(D/d)，結(jié)果如表1、圖5所示，NSL4的溶解效率1.22，NSL16的溶解效率1.13。

圖4 土壤細菌NSL4、NSL16溶解無機磷試驗

表1 溶磷圈法測定細菌解無機磷能力

圖5 土壤細菌NSL4、NSL16的溶磷效率

2.5 土壤細菌的盆栽試驗

以NSL4和NSL16作為試驗菌株，采用盆栽灌根法研究其對玉米的生長是否具有促生作用，試驗結(jié)果如圖6、圖7、表2、表3所示。圖7與表2的根系結(jié)果表明與對照組相比NSL4、NSL16菌株處理后的玉米根系較為稀疏松散，并且根系長度也都短于對照組。這可能是因為NSL4、NSL16具有分解無機磷的能力，使土壤上層無機磷含量增多，促進植株根系橫向生長[17]。

表2 菌株NSL4、NSL16對玉米生長的影響

圖6 土壤細菌NSL4、NSL16灌根處理后的玉米形態(tài)

圖7 土壤細菌NSL4、NSL16灌根處理后的玉米根系形態(tài)

表3結(jié)果顯示，NSL4、NSL16菌株處理的試驗組比對照組葉綠體色素含量都有所提高。葉綠體色素對植物光合作用和水分利用等生理生化過程均具有重要作用，同時其還能增強植物在逆境下的生存能力[18]。這表明NSL4、NSL16菌株對玉米光合作用的進行以及抗逆性都具有一定的提升作用。同時，SOD、POD活性結(jié)果顯示，NSL4、NSL16菌株處理的試驗組與對照組相比活性都有所降低。

表3 菌株NSL4、NSL16對玉米生長的影響

3 結(jié)論與討論

土壤微生物因具有固氮、溶磷、產(chǎn)生腐殖質(zhì)酸等改善土壤肥力的功能，從而具有促進植物生長的能力，由此越來越被農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重視[19]。近年來，國內(nèi)不乏微生物對植物促生防病的研究。郝變青等通過研究蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)BC98-Ⅰ對馬鈴薯的促生作用得出BC98-Ⅰ對馬鈴薯促生率最高可達54.74%，最高增產(chǎn)率可達35.51%[20]；易龍等[21]對煙草根際土壤的微生物進行分離得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)R27，并通過研究證明其不僅能夠顯著的抑制煙草根部出現(xiàn)黑腐病，同時通過室內(nèi)盆栽試驗證明其防治效果可高達80.2%；王繼元[22]對河南平頂山、原陽等地生長健壯植株的根際土進行采集，并分離土壤微生物得到蕓苔假單孢菌(Pseudomonasbrassicacearum)G2-1并通過試驗證明其對土壤中速效磷含量的提升率達到99.28%。

本次試驗通過對內(nèi)蒙古烏蘭察布市“綠洲一號”土壤微生物進行分離得到兩株細菌分別編號為NSL4、NSL16，兩株菌均為阿氏芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，接觸酶試驗表明該種菌具有產(chǎn)生過氧化氫酶的能力。并且通過細菌溶解無機磷試驗得出NSL4與NSL16均具有一定的溶解無機磷的能力。盆栽試驗結(jié)果表明，NSL4、NSL16對玉米生長的促進效果并不明顯，但是二者均可以提高植株的葉綠體色素含量以及降低SOD、POD的活性。

促生與防病是生防菌株應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所必備的兩大功能，并且芽孢桿菌與病原菌的競爭作用是防治植物病害發(fā)生的重要原理之一[23]，本試驗僅對NSL4、NSL16菌株的促生效果進行研究，需要進一步研究其對植物病害是否具有較好的抑制作用。