趙里曼，牟美睿，武麗娟，賁蓓倍，楊仁杰，劉海學(xué)

(1. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；3. 北京諾禾致源科技股份有限公司，天津 301700；4. 天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384)

【研究意義】近年來，抗生素被認(rèn)為是環(huán)境中的一種新興污染物，它在人類和獸藥醫(yī)學(xué)中被大量使用，并在環(huán)境中持續(xù)存在[1-2]。抗生素不能被生物充分代謝且不易降解，會對生物產(chǎn)生不良反應(yīng)[3]。通過植物性食物或動物有助于抗生素在食物鏈中的運輸[2]，人們通過長期攝取暴露于低濃度抗生素的食品，會對人體健康產(chǎn)生負(fù)面的影響。環(huán)丙沙星是喹諾酮類抗生素的代表，抗菌譜廣，殺菌力強[4]。環(huán)境調(diào)查顯示，喹諾酮類抗生素在土壤、地表水和動植物體內(nèi)等多種環(huán)境介質(zhì)中都有檢出[5-7]。因此，抗生素的吸收和累積以及對人類的健康威脅亟待人們的重視?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】不同類型作物對抗生素的敏感性明顯不同，Jin等[8]以小麥、大白菜和番茄3種作物為實驗材料，發(fā)現(xiàn)根和莖伸長的敏感性具有顯著差異。顧國平和章明奎[9]研究發(fā)現(xiàn)，土霉素對水稻地上部分的影響明顯小于地下部分， 且低濃度土霉素處理可促進(jìn)水稻根表面積和根系總長的增加，高濃度土霉素會對水稻幼苗產(chǎn)生毒害作用，限制水稻幼苗正常生長。言青云等[10]發(fā)現(xiàn)不同濃度環(huán)丙沙星脅迫條件下，高積累菜心根部及地上部的可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD及POD活性總體大于低積累菜心，對CIP的耐受能力更較強。張?zhí)煊萚11]研究表明低濃度的磺胺二甲嘧啶和環(huán)丙沙星能夠促進(jìn)小麥籽粒根和芽的生長，但達(dá)到抑制臨界濃度后會抑制小麥籽粒的根長生長?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)抗生素在植物食品中的殘留和富集的研究多集中在生長及生理的影響上，但其對代謝組學(xué)的影響鮮見報道。代謝組學(xué)是植物生物技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展迅速的一門學(xué)科，隨著代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集分析工具的進(jìn)步，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)可以覆蓋整個植物代謝組[12]。植物具有對各種逆境的防御機制，能夠適應(yīng)不利的環(huán)境，利用代謝組學(xué)方法研究防御反應(yīng)有助于全面理解植物對逆境脅迫的響應(yīng)[13-14]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以小麥‘百農(nóng)207’幼苗作為試驗材料，從植物的生理和代謝方面分析環(huán)丙沙星對小麥的影響，使小麥耐性品種的研究得到進(jìn)一步完善，該研究對農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)和人類健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用‘百農(nóng)207’小麥品種，由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測試中心提供。選取健康飽滿的小麥種子，曬種一天后用5% NaClO 溶液浸泡20 min消毒，并用超純水大量沖洗至無味后浸泡一晚。將吸脹的種子溝腹向下，均勻放置于發(fā)芽盒密網(wǎng)盤上。用蒸餾水培養(yǎng)5 d后，更換為Hoagland營養(yǎng)液。待幼苗長至兩葉一心時，從中篩選出長勢一致的麥苗，將其分為對照組和處理組，以不添加CIP的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)設(shè)置為對照組(0 mg/L，CK)，處理組CIP梯度設(shè)定為5、10、25、50、100、200 mg/L。連續(xù)5 d培養(yǎng)后結(jié)束處理，收集小麥幼苗，洗凈、吸干水分后進(jìn)行生理指標(biāo)及代謝物的測定。材料培養(yǎng)全程于天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)實驗教學(xué)中心實驗室人工氣候箱中進(jìn)行，設(shè)置(23±1)℃恒溫，每日光照時間為12 h。所有試驗共進(jìn)行3個重復(fù)，每個重復(fù)以10～20個植株為樣本。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理指標(biāo)測定 葉綠素含量采用丙酮、無水乙醇混合浸提法[15]測定。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法[16]測定，過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用分光光度法[16]測定，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[16]測定。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法[16]測定。

1.2.2 代謝物提取和鑒定 萃取衍生化：小麥葉片樣本經(jīng)液氮研磨后，取150 mg于2 mL離心管里，加入1 mL體積比為1∶1∶1的乙腈-異丙醇-水提取劑，40 kHz超聲波提取，在4 ℃下持續(xù)35 min。再將樣本離心1 min(4 ℃，10 000 r/min)，移取150 μL上清液至2 mL離心管，在11 ℃下使用全自動氮吹儀將提取物吹干。緊接著向每個樣品中加入10 μL衍生試劑(鹽酸甲氧胺-吡啶混合溶液)，充分搖勻混合后于30 ℃恒溫水浴鍋中衍生90 min；然后加入30 μL 衍生試劑[N-甲基N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺]+1%三甲基氯硅烷，37 ℃恒溫水浴鍋中衍生30 min，衍生過程中搖晃3次，使提取液衍生完全。最后加入1 mL正庚烷溶劑(內(nèi)含20 μg/mL的內(nèi)標(biāo)物十一烷)，過0.22 μm濾膜后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶，上機測定。

上機檢測：氣相分析衍生提取物用7890A-5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。色譜條件：采用HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量 0.5 μL，不分流進(jìn)樣；氦氣作為載氣，并設(shè)定壓力，使氦氣流量保持在64 mL/min的恒定流速。溶劑延遲：270 s。升溫程序：初始溫度設(shè)置為60 ℃，保持1 min，以10 ℃/min提高到280 ℃后保持5 min。質(zhì)譜條件：四級桿溫度設(shè)置為150 ℃，離子源溫度設(shè)置為230 ℃；電離電壓：70 eV；掃描方式(全掃描)：50～500 m/z；掃描速度：2 scan/s。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 結(jié)果建立在至少3組獨立試驗基礎(chǔ)之上，生理指標(biāo)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Office Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算后，采用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖；代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)經(jīng)Agilent-MassHunter工作站進(jìn)行特征提取后，通過Microsoft Office Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行定性和定量分析，采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(PCA和OPLS-DA)分析和差異代謝物篩選，通過MetaboAnalyst 5.0 平臺對差異代謝物進(jìn)行通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CIP對小麥生理指標(biāo)的影響

2.1.1 CIP對小麥葉綠素含量的影響 如圖1所示，隨著CIP濃度的升高，小麥幼苗葉片葉綠素a、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量呈先升后降的變化趨勢，葉綠素b含量呈逐漸降低趨勢。5 mg/L時CIP脅迫下小麥幼苗葉片葉綠素a、類胡蘿卜和總?cè)~綠素素含量最高，較對照分別提高2.7%、3.0%和0.7%(P>0.01)。50～200 mg/L CIP脅迫使小麥幼苗葉片葉綠素a和葉綠素b含量極顯著降低，較對照分別降低15.8%、20.1%、22.9%和29.9%、40.1%、45.0%(P<0.01)；25～200 mg/L CIP脅迫極使小麥幼苗葉片總?cè)~綠素含量極顯著降低，較對照分別降低7.8%、19.1%、24.7%和28.0%(P<0.01)；25～100 mg/L CIP脅迫使小麥幼苗葉片類胡蘿卜素含量顯著降低，200 mg/L時含量最低，較對照降低12.2%(P<0.01)，達(dá)到極顯著水平。

*表示處理與對照間差異顯著(P<0.05)，**表示處理與對照間差異極顯著(P<0.01),下同

2.1.2 CIP對小麥抗氧化系統(tǒng)的影響 如圖2所示，隨著CIP濃度的增加，小麥幼苗葉片POD活性降低，200 mg/L CIP脅迫下小麥幼苗葉片POD活性降低13.9%(P<0.05)。小麥幼苗葉片的CAT和SOD活性呈先升高后下降的變化趨勢。在10 mg/L CIP脅迫下CAT活性達(dá)到最高，較對照組增加89.52%(P<0.01)。在50 mg/L CIP脅迫下SOD活性達(dá)到最高，較對照增加37.77%(P<0.01)，5、10、25、200 mg/L CIP脅迫下處理與對照間SOD活性差異不顯著(P>0.05)。隨著CIP濃度的增加，麥幼苗葉片的MDA含量呈先上升后降低的變化趨勢。5～25 mg/L CIP脅迫使MDA含量極顯著增加，其分別較對照增加40.26%、178.28%和147.46%(P<0.01)，100～200 mg/L CIP脅迫則降低了MDA含量，較對照下降8.51%和15.06%。MDA含量在10 mg/L CIP脅迫下達(dá)到最高。

圖2 CIP脅迫對小麥幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2 CIP脅迫下小麥代謝物定性分析

對CIP脅迫下小麥幼苗樣品的GC-MS總離子流圖進(jìn)行預(yù)處理后，通過NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行譜庫比對，結(jié)合各代謝物的保留時間和峰面積，確定各代謝物衍生化后的分子式和含量。結(jié)果共鑒定出代謝物55個(表1)，包括有機酸16種、氨基酸14種、糖類化合物10種、多元醇3種和其他物質(zhì)12種，分別占總代謝物個數(shù)的29.1%、25.5%、18.2%、5.5%和21.8%。

表1 經(jīng)GC-MS鑒定出的小麥幼苗代謝物

2.3 CIP脅迫下小麥代謝組學(xué)的PCA分析

通過SIMCA-P 14.1軟件的主成分分析 (Principal component analysis, PCA) 進(jìn)行無監(jiān)督識別，以確定一般的代謝趨勢和可能的異常值[17]。PCA得分圖表示了每個樣本在主成分空間中的相對位置，并通過樣本特征的線性組合使所有樣本之間的方差最大化，揭示了相似樣本的聚類和具有不同特征的個體樣本(離群值)[18]。PCA結(jié)果中提取前3個主成分，貢獻(xiàn)率分別為39%、18%和12%，繪制三維得分圖(圖3)。所有樣本都在95%置信區(qū)間的Hotelling’s T2 橢圓內(nèi)，每組的3次重復(fù)聚在一起，表明實驗重復(fù)性較好。不同處理聚為不同的簇，說明各組間的整體的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)出一定程度的差異性。

圖3 CIP脅迫下小麥幼苗主成分三維得分

2.4 CIP脅迫下小麥代謝組學(xué)PLS-DA分析

由于PCA分析對于相關(guān)性較小的變量不敏感，且無法消除與研究目的無關(guān)的隨機誤差和組內(nèi)誤差，可通過偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis， PLS-DA)對不同處理組小麥幼苗代謝物進(jìn)行分析。PLS-DA得分圖(圖4)顯示高CIP脅迫處理組(濃度>10 mg/L)和低CIP脅迫處理組(濃度≤10 mg/L)被分布在PC1左右兩側(cè)，說明小麥葉片受到不同濃度環(huán)丙沙星脅迫后，代謝物質(zhì)發(fā)生顯著性變化。為驗證PLS-DA模型是否過擬合，對模型進(jìn)行n=200的置換檢驗，其中R2和Q2表示擬合優(yōu)度系數(shù)(建模有效性得分值R2=0.88，Q2=0.46)。如圖4所示，置換檢驗圖中R2和Q2左邊的點都低于最右邊的點，且直線斜率都大于1，說明模型可靠，可用于差異代謝物的篩選。

圖4 不同CIP處理下小麥幼苗代謝物PLS-DA得分及置換檢驗

2.5 CIP脅迫下小麥差異代謝物及代謝通路分析

對GC-MS檢測的55種代謝物，通過PLS-DA分析中得到的VIP值結(jié)合單因素方差分析的P值(VIP>1，P<0.05)，共篩選出10種差異代謝物(表2)。包括4種氨基酸及其衍生物(甘氨酸、谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-丙氨酸)、2種有機酸(2-丙酸、2-戊烯酸)、2種糖類及其衍生物(塔洛糖、阿拉伯糖)和2種其他有機物(苯酚、2-吡咯烷酮)。氨基酸及其衍生物占40%，比重最大。其中差異最明顯的為L-天冬酰胺，各處理組倍數(shù)變化在1.5～5.8，可見不同CIP濃度脅迫下小麥幼苗中相同代謝物的代謝水平上有明顯差異，氨基酸類為小麥幼苗響應(yīng)CIP的關(guān)鍵代謝物。此外， 利用MetaboAnalyst 5.0 平臺對差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，得到13條代謝通路，其中顯著變化的有5條通路(P<0.05或Impact>0.2，圖5)，5條通路分別為：甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，氰基氨基酸代謝，氨酰-tRNA生物合成。

圖5 差異代謝物通路影響因子

表2 CIP脅迫下小麥幼苗中的差異代謝物

3 討 論

3.1 CIP對小麥幼苗生理的影響

光合作用是所有綠色植物的重要生理過程，葉綠素是參與光合作用中光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的重要光合色素，植物葉綠素含量是評價光合活性的一個重要參數(shù)[19]。從本試驗結(jié)果可以看出，低濃度抗生素脅迫對小麥幼苗葉片葉綠素未造成明顯破壞，但是當(dāng)抗生素濃度超過25 mg/L后，小麥幼苗的各葉綠素組分及總?cè)~綠素含量均明顯降低。這可能是由于高濃度抗生素可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成而抑制葉綠素的合成，同時對葉綠素合成過程中的關(guān)鍵酶類產(chǎn)生抑制，進(jìn)而影響葉綠素的合成。Rydzyński等[20]研究了在含鎘和四環(huán)素土壤中生長的菠菜葉片中葉綠素的降解，結(jié)果表明植物暴露于最高水平的四環(huán)素和最高水平的鎘，葉綠素含量分別降低64%和68%，葉綠素降解速率常數(shù)隨四環(huán)素和鎘濃度的增加而增加。廖德潤等[21]考察了土霉素、磺胺二甲基曉啶和環(huán)丙沙星3種獸用抗生素對空心菜葉綠素含量的影響，發(fā)現(xiàn)抗生素濃度低于100 μg/L處理的空心菜葉片中葉綠素含量沒有顯著變化，但抗生素濃度高于100 μg/L的處理中，葉綠素含量顯著下降。SOD、POD和CAT是與植物抗氧化應(yīng)激相關(guān)的重要酶[22]，有助于消除外部環(huán)境脅迫引起的氧化干擾，屬于活性氫清除劑。本試驗結(jié)果可以看出，各處理組POD活性值降低但不顯著，CAT和SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢，CAT的變化趨勢更明顯。整體上看POD和SOD活性對抗生素環(huán)丙沙星的影響作用弱于CAT活性。不同的環(huán)境逆境中，抗氧化酶的響應(yīng)存在差異[21]。在抗生素環(huán)丙沙星的脅迫下，3種抗氧化酶敏感度由強到弱依次為:CAT>SOD>POD。

以往的研究表明，高濃度抗生素會導(dǎo)致植物產(chǎn)生過量自由基，若超出植物產(chǎn)生的抗氧化酶清除能力，甚至?xí)鹬参矬w組織細(xì)胞損傷[23-24]。張?zhí)飕揫25]通過抗生素磺胺二甲基嘧啶(SM2)對小麥的生態(tài)毒性研究，發(fā)現(xiàn)SM2處理組在低濃度條件下，抗氧化酶受到刺激而活性增強，但隨著SM2濃度的增大，小麥葉片中SOD活性不斷增強，POD與CAT活性受到抑制。朱健等[26]試驗表明鹽酸左氧氟沙星浸種后玉米種子中抗氧化酶活性表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象。除了上面提到的抗氧化酶，植物還可能有其他的酶或非酶機制來耐受環(huán)丙沙星脅迫。此外，MDA是氧化應(yīng)激的另一個主要指標(biāo)[27]。王朋等[28]以玉米幼苗為研究對象，發(fā)現(xiàn) MDA活性在低濃度CIP處理下被激發(fā)而在高濃度CIP處理下被抑制。說明在低濃度脅迫下，植物可以啟動良好的防御措施，抵御外來傷害。植物通過體中MDA的含量，防止細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，從而對植物的傷害起到自我保護(hù)作用。但脅迫濃度升高，對植物的傷害則加強，植物本身的應(yīng)激系統(tǒng)下降，植物毒害嚴(yán)重。因此，本研究通過分析不同CIP濃度脅迫下小麥幼苗生理的影響發(fā)現(xiàn)，小麥會通過提高葉綠素、MDA含量，以及提高保護(hù)酶CAT和SOD的活性來忍耐CIP脅迫的傷害。

3.2 CIP對小麥幼苗代謝物及代謝途徑的影響

本研究結(jié)果顯示CIP脅迫確實誘導(dǎo)小麥體內(nèi)代謝物發(fā)生了顯著變化，且代謝物變化與環(huán)丙沙星濃度有關(guān)。經(jīng)過篩選共檢測出55種代謝物，其中差異顯著的代謝物有10種，包括氨基酸4種、有機酸2種、糖類2種和其他有機物2種。篩選共檢測出13條代謝通路，其中顯著變化的有5條，主要通過甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，氰基氨基酸代謝和氨酰-tRNA生物合成來抵御脅迫，保持植物的正常生理活動。在環(huán)丙沙星脅迫下小麥代謝產(chǎn)物涉及的主要是氨基酸代謝和有機酸代謝過程。

氨基酸對壓力脅迫下植株的抗性具有重要的作用[29]。王曉麗等[30]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫能促進(jìn)酸棗幼苗體內(nèi)游離氨基酸的累積，通過滲透物質(zhì)來減輕鹽害，維持酸棗幼苗的正常生長。本試驗中，顯著變化途徑中有4條是氨基酸相關(guān)的代謝途徑，表示小麥幼苗在CIP脅迫時氨基酸活動較為活躍，是響應(yīng)CIP脅迫的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，其中氨酰-tRNA的生物合成途徑最為顯著。氨酰-tRNA合成酶是生物體蛋白質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶[31]，表示小麥幼苗在CIP脅迫時蛋白質(zhì)合成也比較活躍。在逆境環(huán)境中，可產(chǎn)生逆境誘導(dǎo)蛋白來提高植物的耐脅迫能力，對植物逆境適應(yīng)產(chǎn)生保護(hù)[32]。有機酸在植物能量代謝和抗逆過程中起著重要作用。本試驗中，乙醛酸和二羧酸代謝為機體提供能量，促進(jìn)植物生長發(fā)育。因此，氨基酸類代謝物為小麥幼苗響應(yīng)CIP的關(guān)鍵代謝物，代謝通路中氨基酸相關(guān)通路占比較大，說明通過氨基酸代謝途徑研究CIP對小麥幼苗代謝物的影響具有可行性，可為進(jìn)一步探究代謝機理提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過對‘百農(nóng)207’小麥品種，從生理和代謝組學(xué)兩個層面探究小麥在不同濃度CIP脅迫下的差異性。生理層面，在CIP脅迫條件下小麥會通過提高葉綠素、MDA含量以及提高保護(hù)酶CAT和SOD的活性來忍耐CIP脅迫的傷害；代謝組學(xué)層面，氨基酸類代謝物為小麥幼苗響應(yīng)CIP的關(guān)鍵代謝物。本研究結(jié)果可為探究小麥響應(yīng)CIP提供理論依據(jù)。