周棋贏，李婭菲，郭文利，張馨月，葛 鑫，方志貞，孫 潔，王儀佳，陳 尚

(1.信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/茶學(xué)與食品科技學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2. 河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000；3.河南省茶葉精深加工工程技術(shù)研究中心，河南 信陽(yáng) 464000；4.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽(yáng) 464000； 5. 信陽(yáng)師范學(xué)院國(guó)際教育學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

【研究意義】異胡豆苷合酶(Strictosidine synthase, STR)是催化色胺和裂環(huán)馬錢子苷通過Pictet-Spengler反應(yīng)合成異胡豆苷的一類酶。研究表明，異胡豆苷是植物體內(nèi)具有重要藥用價(jià)值的萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids，TIAs)合成的通用前體，STR常被用作TIAs代謝工程中的候選基因和作用靶點(diǎn)[1-3]。STR基因的表達(dá)受低溫、干旱等環(huán)境因子，植物激素與病蟲害侵染等因素影響，在植物抗逆反應(yīng)中具有重要作用[4]。茶是世界公認(rèn)的三大健康飲料之一，具有重要的健康功效。圍繞茶樹(Camelliasinensis)STR基因(CsSTR)開展研究，為進(jìn)一步揭示茶葉的藥用價(jià)值及茶樹抗性育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】STR的三維結(jié)構(gòu)呈六葉β-螺旋漿狀，每葉由4個(gè)反向平行的折疊片組成。β-螺旋漿狀結(jié)構(gòu)中有3個(gè)α螺旋，其中外部和內(nèi)部的α螺旋通過Cys-89和Cys-101間的二硫鍵進(jìn)行連接，這一特征在物種進(jìn)化過程中具有高度的保守性，當(dāng)Cys-89被其他氨基酸替代后，STR就會(huì)失去活性[5]。因此，該二硫鍵對(duì)于維持酶的整體結(jié)構(gòu)和活性具有重要作用。1988年，STR基因首先在蛇根木(Rauvolfiaserpentina)中得到克隆，被命名為STR1。STR1為單分子蛋白質(zhì)，由344個(gè)氨基酸組成，分子量約為35.3 kD[5]。目前，STR基因已經(jīng)在長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)、日本蛇根草(Ophiorrhizajaponica)、短小蛇根草(O.pumila)、金雞納樹(Cinchonacalisaya)、蘿芙木(R.verticillata)、喜樹(Camptothecaacuminata)和臭味假柴龍樹(Nothapodytesfoetida)等植物中得到克隆[5-7]。STR基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆反應(yīng)中具有重要作用。在長(zhǎng)春花中的研究發(fā)現(xiàn)，紫外、鹽脅迫、激發(fā)子、蟲害和MeJA處理都能誘導(dǎo)STR基因表達(dá)，而生長(zhǎng)素和低溫處理則抑制STR基因表達(dá)；Ca2+、蛋白磷酸化和NO在植株響應(yīng)這些處理及調(diào)節(jié)STR基因表達(dá)中具有重要作用[8]。PEG模擬干旱脅迫條件下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)、脅迫強(qiáng)度增強(qiáng)，STR基因表達(dá)量逐漸增加[9]。在日本蛇根草中的研究也發(fā)現(xiàn)，植物防御信號(hào)SA和MeJA能誘導(dǎo)STR基因的表達(dá)[10]。對(duì)擬南芥中STR基因的表達(dá)模式分析表明，擬南芥中STR基因SSL5、SSL6、SSL7都可以被植物防御信號(hào)(SA、MeJA、ET), 傷信號(hào)以及病原菌侵染誘導(dǎo)，暗示他們?cè)谥参锏恼T導(dǎo)防御反應(yīng)中有重要作用[11]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，在全球氣候變暖的趨勢(shì)下，STR同源基因SSL4增強(qiáng)了高溫環(huán)境下擬南芥對(duì)細(xì)菌性青枯病的抗性[12]。水稻中一個(gè)STR同源物OsSTRL2，在水稻花藥發(fā)育和花粉壁形成中具有重要作用[13]。近年來(lái)，茶樹基因組測(cè)序陸續(xù)在大葉種‘云抗10號(hào)’、中小葉種‘舒茶早’‘龍井43’和‘碧云’以及野生種‘DASZ’中完成[15-17]。河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室茶樹功能基因組學(xué)課題組前期利用生物信息學(xué)分析方法，對(duì)茶樹基因組中的CsSTR基因進(jìn)行了鑒定和分析[18]。目前為止，CsSTR基因的克隆和表達(dá)調(diào)控分析還鮮有報(bào)道。中國(guó)自古就有“神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得荼而解之”的歷史記載?，F(xiàn)代科學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，茶具有重要的健康功效[14]。茶樹作為一種固生、木本經(jīng)濟(jì)作物，在生長(zhǎng)中常遭受各種逆境脅迫，嚴(yán)重影響茶樹的生長(zhǎng)、茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用RACE克隆，本研究克隆了‘云抗10號(hào)’基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的一個(gè)茶樹STR基因(CsSTR1)，并對(duì)其在非生物脅迫和激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)量進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究為后續(xù)對(duì)CsSTR1基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，為CsSTR1基因的表達(dá)調(diào)控及其在茶樹抗逆育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 RACE克隆

利用“Strictosidine synthase”關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，在‘云抗10號(hào)’基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[19]中檢索到5個(gè)“Strictosidine synthase”基因(CsSTR)，其中一個(gè)CsSTR基因(CSA035098.1，CsSTR1)的CDS包含不完整的開放閱讀框(ORF)，采用RACE方法對(duì)其全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克隆。首先，利用RNAiso Plus (Takara)試劑提取‘舒茶早’茶樹葉片的總RNA，利用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒( Takara) 合成第一鏈cDNA。設(shè)計(jì)CsSTR1基因片段的擴(kuò)增引物(F:ATGGACATAGATGAGCACCA; R: AATCCACAACTTGCCATTT TTTTCCT)，以第一鏈cDNA為模板，使用KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 循環(huán)30次; 68 ℃ 7 min。此步驟擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pEASY?Blunt克隆載體 (TransGen Biotech)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取克隆，經(jīng)初步PCR鑒定陽(yáng)性克隆后，送克隆至安徽通用生物公司進(jìn)行測(cè)序。然后，根據(jù)SMARTer RACE 5′/3′試劑盒(Clontech)的說(shuō)明進(jìn)行：①以 ‘舒茶早’茶樹葉片總RNA為模板，分別反轉(zhuǎn)錄獲取5′ RACE和3′ RACE cDNA模板；②根據(jù)克隆測(cè)序得到CsSTR1基因的片段序列，設(shè)計(jì)CsSTR1基因的RACE克隆引物(5′ RACE引物：CCATTGGCAAAAGCAAGGCCTCTTAG；3′ RACE引物：ACAGACACGAGCACGAGCTTTCACAG)；③分別對(duì)CsSTR1基因5′ RACE和3′ RACE 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到pEASY?Blunt克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序。最后，通過序列拼接得到CsSTR1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam、Plant-PLoc、CD-Search、SOPMA和SWISS-MODEL在線工具分別對(duì)蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用MEGA X軟件構(gòu)建蛋白同源關(guān)系進(jìn)化樹。

1.3 材料及處理方法

取生長(zhǎng)健康長(zhǎng)勢(shì)一致、來(lái)源于同一株信陽(yáng)群體種茶樹的枝條(長(zhǎng)度約15 cm)為材料，浸入100 μmol/L脫落酸(ABA)水溶液中進(jìn)行處理，分別于處理0、3、6、12、24、48 h后，將第2和第3片葉片迅速置液氮中速凍，然后放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以相同的方法，將茶樹枝條分別浸入1 mmol/L水楊酸(SA)水溶液、1 mmol/L茉莉酸甲酯MeJA溶液(0.5%乙醇溶解)中進(jìn)行處理。ABA和SA處理組以滅菌水處理組為對(duì)照，MeJA處理組以0.5%乙醇處理組為對(duì)照。低溫處理是將茶樹枝條浸入滅菌水中，置于4 ℃冰箱處理；茶樹枝條浸入10% PEG-6000 溶液中模擬干旱處理；以常溫滅菌水處理組為對(duì)照。每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

取根，莖，芽，第1～3葉，花和果材料，迅速置液氮中速凍，然后放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每個(gè)組織樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 qPCR分析

利用RNAiso Plus (Takara)試劑提取上述各樣品的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性后，利用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara) 合成第一鏈cDNA。根據(jù)克隆得到的CsSTR1基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)基因特異的qPCR引物(CsSTR1-F: AACAACAGACAAGAGATGAAC;CsSTR1-R:GTGGA GGTGGTTATTGGA)。根據(jù)前述方法[20]，以茶樹CsGAPDH為內(nèi)參基因(CsGAPDH-F:TTGGCATCGTTGAGGGTCT;CsGAPDH-R:CAGTGGGAACACGGAA AGC)，對(duì)CsSTR1基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsSTR1基因RACE克隆

根據(jù)CSA035098.1的CDS序列，通過PCR擴(kuò)增，得到500～600 bp的條帶(圖1-A)；經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，表明克隆序列與目標(biāo)序列基本一致，但克隆序列長(zhǎng)度為591 bp, 與目標(biāo)序列相比有17個(gè)堿基不同，且在對(duì)應(yīng)CSA035098.1 107 bp后有74 bp的堿基插入，在對(duì)應(yīng)CSA035098.1 136 bp后有個(gè)G堿基插入。根據(jù)591 bp的測(cè)序序列設(shè)計(jì)CsSTR1基因的5′ 和3′ RACE克隆引物。CsSTR1基因的5′ 和3′ RACE克隆分別得到長(zhǎng)度為813和 803 bp的片段(圖1-B)；經(jīng)測(cè)序分析，表明RACE克隆成功。將前面得到的591 bp擴(kuò)增序列與5′ 和3′ RACE克隆序列進(jìn)行拼接，得到CsSTR1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。CsSTR1基因全長(zhǎng)1382 bp，其中CDS 1131 bp，編碼376個(gè)氨基酸；5′ UTR 長(zhǎng)92 bp，3′ UTR 長(zhǎng)159 bp(圖2)。

1. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2. 基因部分片斷擴(kuò)增產(chǎn)物；3. 5′ RACE擴(kuò)增產(chǎn)物；4. 3′ RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 茶樹CsSTR1基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 CsSTR1蛋白特征及結(jié)構(gòu)

CsSTR1蛋白理化分析表明，該蛋白相對(duì)分子量為41.5 kD，理論等電點(diǎn)為 6.36，不穩(wěn)定指數(shù)為29.74，脂肪族氨基酸指數(shù)為88.94，親水性平均系數(shù)為-0.077。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，該CsSTR1蛋白為液泡定位蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，該蛋白在157～252 位氨基酸處具有異胡豆苷合酶Str_synth保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。CsSTR1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)卷曲、延伸鏈、α螺旋和β轉(zhuǎn)角組成，占比分別為42.82%、29.79%、16.76%、10.64%(圖4)。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsSTR1蛋白由β折疊片組成六葉β-螺旋漿狀，中間有3個(gè)α螺旋(圖5)，與結(jié)構(gòu)模板6n5v.1.A間的同源性達(dá)35.25%。

圖3 茶樹CsSTR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域鑒定

圖4 茶樹CsSTR1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 茶樹CsSTR1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 CsSTR1系統(tǒng)進(jìn)化分析

將CsSTR1與已報(bào)到的植物STR蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示CsSTR1與水稻STR蛋白OsSTRL2的親緣關(guān)系最近(圖6)，而與蘿芙木、蛇根木、長(zhǎng)春花等夾竹桃科植物中的STR以及擬南芥中的STR蛋白SSL親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 茶樹CsSTR1蛋白與其他物種STR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 CsSTR1基因的表達(dá)模式

組織表達(dá)模式分析結(jié)果表明，CsSTR1基因在芽和嫩葉(第1～3葉)中的相對(duì)表達(dá)量較高，在老葉、花和果中的相對(duì)表達(dá)量較低(圖7)。低溫脅迫條件下，CsSTR1基因在3 h后表達(dá)量顯著上調(diào)，6～24 h 表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，12 h 后CsSTR1基因呈顯著下調(diào)表達(dá)，48 h后表達(dá)量恢復(fù)到處理前水平。PEG 模擬干旱處理?xiàng)l件下，CsSTR1基因在24～48 h后呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，在48 h后其表達(dá)量上調(diào)近10倍。MeJA處理后，CsSTR1基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在24～48 h后呈現(xiàn)顯著上調(diào)。SA處理后，CsSTR1基因呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，3 h后其表達(dá)水平上調(diào)3.3倍。ABA處理后，CsSTR1基因在3～12 h表達(dá)變化不大，但在24～48 h后呈顯著下調(diào)表達(dá)。

1:根； 2:莖； 3:第1葉；4:第2葉；5:第3葉；6:老葉；7:花；8:果；9:芽.*表示在0.05水平上差異顯著，**表示在0.01水平上差異顯著

3 討 論

STR是植物體內(nèi)調(diào)控TIAs合成的重要酶類，還在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境反應(yīng)中具有重要作用[1-4, 13]。近年來(lái)，茶樹基因組的破譯為茶樹優(yōu)質(zhì)基因資源的挖掘利用以及茶葉藥理作用的進(jìn)一步研究提供了資料。前期研究發(fā)現(xiàn)茶樹基因組中具有17個(gè)STR基因[18]，但目前還沒有一個(gè)CsSTR基因得到克隆。河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室茶樹功能基因組學(xué)課題組對(duì)CsSTR基因的克隆起始于最早破譯的‘云抗10號(hào)’茶樹基因組數(shù)據(jù)，由于其基因組中一個(gè)CsSTR基因(CsSTR1)的CDS包含不完整的開放閱讀框(ORF)，利用RACE技術(shù)，對(duì)CsSTR1基因進(jìn)行了克隆。結(jié)果表明，克隆的CsSTR1基因CDS包含完整的編碼框，比‘云抗10號(hào)’基因組數(shù)據(jù)注釋的對(duì)應(yīng)CDS序列(CSA035098.1)長(zhǎng)615 bp，且有17個(gè)堿基位點(diǎn)不同。這些堿基位點(diǎn)的不同是否由于‘舒茶早’與‘云抗10號(hào)’之間的物種差異造成的，還需要進(jìn)一步研究。與2018年公布的‘舒茶早’茶樹基因組[21]中對(duì)應(yīng)的STR基因(TEA012295.1)CDS序列相比，除在912位有個(gè)A與T堿基的顛換，在299 bp后有258 bp的插入，其余序列與該STR基因(TEA012295.1)的CDS序列完全一致。進(jìn)一步分析顯示，CsSTR1基因CDS序列與新公布的‘舒茶早’高質(zhì)量基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)STR基因(CSS0030692.1)的CDS序列完全一致，表明本研究RACE克隆的準(zhǔn)確性。同時(shí)，通過RACE克隆，本研究還得到CsSTR1基因的5′ 和3′ UTR序列，為設(shè)計(jì)CsSTR1基因特異引物進(jìn)行基因表達(dá)研究以及CsSTR1基因上游調(diào)控因子的分離鑒定和調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

CsSTR1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，CsSTR1蛋白呈六葉β-螺旋漿狀；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，CsSTR1定位于液泡，這與已有的研究一致[5]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，CsSTR1與水稻OsSTRL2的同源性最高，而與蘿芙木、蛇根木、長(zhǎng)春花等植物中的STR同源性較低，暗示CsSTR1可能不具有催化異胡豆苷合成的功能。研究表明，OsSTRL2主要在花器官中表達(dá)，在花藥發(fā)育和花粉形成中有重要作用，OsSTRL2基因敲除突變導(dǎo)致水稻雄性不育；另外，OsSTRL2突變體還呈現(xiàn)出花藥外表皮上不正常的蠟質(zhì)晶體，可能還影響了水稻對(duì)病原菌的抗性[13]。CsSTR1基因在芽和幼葉中表達(dá)量較高，而在花和果中表達(dá)量較低。表明CsSTR1與OsSTRL2的表達(dá)調(diào)控不完全一致。CsSTR1可能在茶樹芽葉發(fā)育和病蟲害防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。根據(jù)最近的研究結(jié)果，在利用更大范圍STR蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，CsSTR1與擬南芥中STR同源蛋白(AT3G57030.1)的親緣關(guān)系最近，與水稻OsSTRL2蛋白位于同一進(jìn)化分枝[18]。研究表明，擬南芥中該STR (AT3G57030.1)參與調(diào)控類黃酮物質(zhì)的合成[22]。茶葉中類黃酮是具有重要健康功效的內(nèi)含成分，而且是茶樹參與抗逆反應(yīng)的重要次生代謝物[19, 23]。

STR在應(yīng)答逆境脅迫和激素信號(hào)中有重要作用。CsSTR1基因受低溫和PEG模擬干旱處理誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果提示CsSTR1參與茶樹對(duì)低溫和干旱的響應(yīng)。前期研究顯示，STR基因表達(dá)受干旱脫水脅迫誘導(dǎo)，但低溫處理下調(diào)STR基因表達(dá)[8-9]。雖然CsSTR1受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，但上調(diào)表達(dá)只出現(xiàn)在低溫處理3 h后，在其他檢測(cè)時(shí)間段(6～48 h)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。已有研究表明，植物對(duì)低溫的應(yīng)答途徑包括ABA非依賴途徑和不依賴CBF兩條途徑[24]。ABA處理后，CsSTR1基因在24～48 h后顯著下調(diào)表達(dá)，暗示CsSTR1基因是以ABA非依賴途徑參與對(duì)低溫的應(yīng)答。MeJA和SA處理后，CsSTR1基因都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，這與已有的報(bào)道一致[8, 10-11]。MeJA和SA是植物體內(nèi)重要的信號(hào)物質(zhì)，在調(diào)控植物脅迫反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育中都具有重要作用[25]。MeJA還參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的次生代謝[26]。因此，CsSTR1可能通過參與調(diào)控茶樹次生代謝，在茶樹應(yīng)對(duì)逆境脅迫中發(fā)揮作用，但其具體的作用機(jī)制還需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究克隆了茶樹中一個(gè)異胡豆苷合酶基因CsSTR1。其CDS長(zhǎng)1131 bp, 編碼376個(gè)氨基酸，分子量41.5 kD；5′和3′UTR長(zhǎng)分別為92和159 bp。CsSTR1具有異胡豆苷合酶Str_synth保守結(jié)構(gòu)域，其三維結(jié)構(gòu)呈六葉β-螺旋漿狀。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，CsSTR1與水稻OsSTRL2具有較近的親緣關(guān)系。CsSTR1在茶樹芽和第1～3葉中表達(dá)量較高，在花和果中表達(dá)量較低；低溫、PEG、MeJA和SA處理均誘導(dǎo)CsSTR1上調(diào)表達(dá)，ABA處理后CsSTR1下調(diào)表達(dá)，表明CsSTR1在茶樹響應(yīng)生物和非生物脅迫反應(yīng)中具有重要作用。