楊玉花，雷 陽(yáng)，白志元，陳 妍，張海平，張瑞軍

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太原 030031)

【研究意義】大豆是全球最主要的農(nóng)作物之一，同時(shí)也是人類食用植物油、大豆制品和動(dòng)物飼料的主要來(lái)源之一。我國(guó)每年大豆需求量約1.1億t，但是國(guó)內(nèi)自產(chǎn)大豆每年僅約1500萬(wàn)t，缺口高達(dá)85%，對(duì)進(jìn)口依賴程度極高，2020年我國(guó)大豆進(jìn)口高達(dá)10 032.7萬(wàn)t，創(chuàng)下歷史新高。面對(duì)當(dāng)前全球愈發(fā)嚴(yán)重的新冠疫情，以及未來(lái)中美關(guān)系的不確定性，大豆產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)糧食安全戰(zhàn)略中最大的軟肋，隨時(shí)面臨“卡脖子”的風(fēng)險(xiǎn)。目前隨著全球?qū)Υ蠖瓜M(fèi)的日益增長(zhǎng)，大豆產(chǎn)量的提高將成為我們育種研究的重要目標(biāo)。然而植物生長(zhǎng)和發(fā)育嚴(yán)重受到外界環(huán)境氣候的影響，尤其干旱是影響全球植物地理分布并且在一定程度上限制農(nóng)作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一。山西省地處黃土高原地區(qū)，是典型的大陸性季風(fēng)氣候區(qū)[1]，常年受旱災(zāi)影響，因此節(jié)水旱作是該省農(nóng)業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略問(wèn)題。面對(duì)我國(guó)對(duì)大豆的大量需求，我國(guó)政府通過(guò)高標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)田建設(shè)、現(xiàn)代種業(yè)提升工程等專項(xiàng)，加大對(duì)大豆主產(chǎn)區(qū)(東北和黃淮海地區(qū))的支持力度。山西省作為大豆黃淮海主產(chǎn)區(qū)之一，應(yīng)加大力度全力選育高產(chǎn)抗旱大豆品種。然而據(jù)統(tǒng)計(jì)，干旱將會(huì)使大豆產(chǎn)量減少40%左右[2-3]，因此開展大豆抗旱相關(guān)研究迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前常規(guī)大豆抗旱研究相對(duì)較多[4-6]，也有很多相關(guān)品種的審定，如隴中黃602[7]、晉豆50號(hào)[8]、合豐48、綏農(nóng)28、龍小粒2號(hào)、黑農(nóng)65等[9]，但是雜交大豆抗旱研究目前較少。前人對(duì)大豆抗旱性研究主要在大豆種子萌發(fā)期[6]、苗期[10-11]、花期[12]以及整個(gè)生育期[13]，通過(guò)檢測(cè)萌發(fā)期、苗期、花期和成熟期生理生化指標(biāo)和農(nóng)藝性狀，從而利用抗旱指數(shù)法和隸屬函數(shù)值等方法對(duì)大豆抗旱性評(píng)價(jià)分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文利用課題培育的3個(gè)雜交大豆品種進(jìn)行抗旱相關(guān)研究，通過(guò)PEG-6000不同濃度模擬干旱脅迫?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究以期通過(guò)測(cè)定苗期葉綠素含量、光合生理指標(biāo)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及抗氧化酶活性等，明確3個(gè)雜交大豆在抗旱生理方面的共性和特性，進(jìn)而通過(guò)耐旱性比較選育抗旱雜交大豆品種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為3個(gè)雜交大豆品種/系，分別為晉豆48，優(yōu)勢(shì)豆-A-5和雜交豆6號(hào)，以上材料均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心雜交大豆課題選育并提供。

1.2 種子處理

從3份雜交大豆品種/系中選擇子粒完整、大小一致、表面光滑的種子各90粒，然后利用0.1%的氯化汞在超凈臺(tái)進(jìn)行浸泡滅菌6 min。浸泡后的大豆置于滅菌水中沖洗3～4次，然后將種子置于滅菌濾紙上自然晾干表面水分。將每個(gè)材料的90粒種子分為3份，每份30粒種子置于直徑為9 cm且以雙層濾紙為芽床的培養(yǎng)皿中，加入20 mL滅菌水，與25 ℃恒溫暗處理催芽。露白后挑選生長(zhǎng)一致的幼苗置于帶網(wǎng)格的塑料發(fā)芽盤，加入適量的Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液，置于PERCIVAL(ARC-41L2-AR)生長(zhǎng)箱中生長(zhǎng)，設(shè)置晝夜溫度為30和25 ℃，相對(duì)濕度恒定60%，光暗周期為 16/8 h。待大豆生長(zhǎng)到子葉葉片展開后，移栽到帶有網(wǎng)格的泡沫培養(yǎng)板上并用定植棉固定根部(圖1)，然后置于Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，生長(zhǎng)至第1個(gè)三小葉期進(jìn)行干旱脅迫。

圖1 3個(gè)雜交大豆水培定植

1.3 干旱脅迫處理

干旱脅迫處理采用不同濃度的聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液模擬。PEG-6000溶液(Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液為溶液)濃度(質(zhì)量比)分別設(shè)3個(gè)處理，5%、10%和20%，以Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照(PEG-6000濃度為0%)，干旱脅迫時(shí)間為2 d。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.4.1 光合參數(shù)的測(cè)定 用 LI-6400便攜式光合儀于上午 10:00—12:00 測(cè)定葉片凈光合作用速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。每個(gè)材料測(cè)定 3 株，每株測(cè)定3個(gè)葉片，最后取平均值。

1.4.2 葉綠素含量的測(cè)定 利用葉綠素儀(SPAD-502 Plus，Konica Minolta，Japan)測(cè)定不同品種大豆葉片的葉綠素相對(duì)含量。每個(gè)材料測(cè)定3 株，每株測(cè)3個(gè)不同部位，然后取平均值。

1.4.3 生理指標(biāo)和抗氧化酶系活性的測(cè)定 由北京索萊寶科技有限公司購(gòu)買的可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、過(guò)氧化物酶(POD) 活性的測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)測(cè)3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

利用Excel 2010分析所有數(shù)據(jù)并作圖，SAS v8進(jìn)行方差分析。大豆抗旱性綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)參考劉學(xué)義[14]的平均隸屬函數(shù)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)雜交大豆苗期生長(zhǎng)的影響

使用不同濃度PEG-6000溶液對(duì)3份雜交大豆苗期脅迫結(jié)果見圖2，隨著濃度增大，大豆苗期生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。在5% PEG-6000和10% PEG-6000處理下，各材料苗期表型與對(duì)照(0% PEG-6000)無(wú)顯著差異，但是在20% PEG-6000處理后與對(duì)照相比，表現(xiàn)出不同程度的生長(zhǎng)抑制。

A. CK (PEG-6000 濃度0%)；B. PEG-6000 濃度5%；C. PEG-6000 濃度10%；D. PEG-6000 濃度20%；標(biāo)尺：3 cm

2.2 干旱脅迫對(duì)雜交大豆苗期葉綠素含量的影響

由圖3可以看出，3份雜交大豆苗期葉片在不同濃度PEG-6000溶液處理?xiàng)l件下葉綠素含量(SPAD值)并不一致。對(duì)照處理后，3份雜交大豆苗期葉片的葉綠素含量差異顯著，優(yōu)勢(shì)豆-A-5苗期葉片葉綠素含量最高，為35.6，雜交豆6號(hào)為次之(35.4)，晉豆48葉綠素含量只有26.1。隨著干旱脅迫的加劇，大豆苗期葉片的葉綠素含量逐漸增加，并且趨勢(shì)較一致。3份雜交大豆苗期葉片葉綠素含量均隨著PEG-6000溶液濃度的增加而增加，其次可以看出5% PEG-6000和10% PEG-6000處理后，優(yōu)勢(shì)豆-A-5苗期葉片的葉綠素含量與對(duì)照差異不顯著，但是晉豆48和雜交豆6號(hào)差異顯著。20% PEG-6000溶液濃度處理后，3個(gè)雜交大豆品種間呈現(xiàn)出顯著差異，趨勢(shì)與對(duì)照處理一致，優(yōu)勢(shì)豆-A-5苗期葉片葉綠素含量最高，為47.9，雜交豆6號(hào)為43.6，晉豆48為36.5。

不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理不同品種間差異顯著(P<0.05)

2.3 干旱脅迫對(duì)雜交大豆苗期葉片光合生理指標(biāo)的影響

由圖4可以看出，隨著PEG-6000溶液濃度逐漸加大，3種雜交大豆苗期葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間二氧化碳濃度(Ci)和氣孔導(dǎo)度(Gs)變化趨勢(shì)在不同品種間有差異。晉豆48苗期葉片的Pn在5%PEG-6000溶液濃度處理后表現(xiàn)出與對(duì)照無(wú)顯著差異(圖4-A)，而在10%PEG-6000和20%PEG-6000溶液濃度處理后與對(duì)照則呈顯著差異，尤其20%PEG-6000溶液濃度處理后Pn由對(duì)照17.47 μmol/(m2·s)降為6.09 μmol/(m2·s)。優(yōu)勢(shì)豆-A-5苗期葉片Pn的下降趨勢(shì)與晉豆48一致，但是隨著PEG-6000溶液濃度逐漸加大，雜交大豆6號(hào)Pn逐漸下降。然而不同雜交大豆品種在同樣的PEG-6000溶液濃度處理下，也表現(xiàn)出顯著差異，如對(duì)照優(yōu)勢(shì)豆-A-5的Pn最大，其次是雜交大豆6號(hào)，晉豆48的Pn最低。3種雜交大豆苗期葉片的胞間二氧化碳濃度(Ci)在不同PEG-6000溶液濃度處理下變化趨勢(shì)不一致(圖4-B)，晉豆48苗期葉片的Ci隨著PEG-6000溶液濃度的增加而降低，優(yōu)勢(shì)豆-A-5的Ci反而由上升趨勢(shì)，雜交豆6號(hào)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并且對(duì)照處理后3個(gè)雜交大豆苗期葉片的Ci差異不顯著，進(jìn)而說(shuō)明干旱脅迫后對(duì)不同雜交大豆品種的Ci有不同的影響，不同濃度的PEG-6000對(duì)造成不同雜交大豆品種的Ci原因也不同。干旱脅迫對(duì)不同雜交大豆品種的氣孔導(dǎo)度(Gs)影響趨勢(shì)與Pn相近，均隨著 PEG-6000溶液濃度的增大而下降(圖4-C，4-D)，同一PEG-6000溶液濃度下，不同雜交大豆品種間也呈現(xiàn)顯著差異，整體趨勢(shì)優(yōu)勢(shì)豆-A-5受干旱脅迫后影響較小。

不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理不同品種間差異顯著(P<0.05)，下同

分析凈光合作用速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的相關(guān)性(表1)，結(jié)果表明，Pn對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)分別與Gs、Ci和Tr對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)之間均存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，而且Gs對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)分別與Ci和Tr對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)之間均存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，Ci和Tr對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)之間也存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

表1 凈光合作用速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的相關(guān)性分析

2.4 干旱脅迫對(duì)雜交大豆苗期葉片中可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的影響

如圖5所示，隨著PEG-6000溶液濃度不斷增加，3種雜交大豆苗期葉片的可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和脯氨酸含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)?？扇苄蕴呛吭?個(gè)雜交大豆苗期葉片對(duì)照組中表現(xiàn)出顯著差異(圖5-A)，其中優(yōu)勢(shì)豆-A-5的可溶性糖含量最高，為32.38 mg/mL，晉豆48(29.95 mg/mL)和雜交豆6號(hào)(28.99 mg/mL)的可溶性糖含量差異不顯著；隨著干旱脅迫的加劇，3個(gè)雜交大豆苗期葉片的可溶性糖含量均上升，并且不同品種間在相同濃度處理下也呈現(xiàn)顯著差異。如圖5-B所示，在4組處理中優(yōu)勢(shì)豆-A-5苗期葉片的可溶性蛋白含量顯著高于其它兩個(gè)雜交種，每個(gè)品種的可溶性蛋白含量隨著PEG-6000溶液濃度的增加呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，沒有可溶性糖含量和脯氨酸含量(圖5-C)增加幅度大。干旱脅迫后，脯氨酸的含量隨著PEG-6000溶液濃度的增加而急劇增加，在PEG-6000溶液濃度為20%處理后，晉豆48 的脯氨酸含量最高，為992.99 μg/g，其次是優(yōu)勢(shì)豆-A-5，為868.27 μg/g，雜交豆6號(hào)最低，為836.67 μg/g。從以上結(jié)果可以看出優(yōu)勢(shì)豆-A-5較其它兩個(gè)雜交豆耐旱。

圖5 不同濃度PEG-6000處理對(duì)雜交大豆苗期葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.5 干旱脅迫對(duì)雜交大豆苗期葉片中抗氧化酶活性的影響

干旱脅迫后，3種雜交大豆苗期葉片中抗氧化酶活性隨著PEG-6000溶液濃度的增加，其含量也呈現(xiàn)急劇上升趨勢(shì)(圖6)，說(shuō)明干旱脅迫促使雜交大豆體內(nèi)形成免受傷害防御系統(tǒng)，從而超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)作為主要保護(hù)酶其活性顯著增強(qiáng)。5%PEG-6000和10% PEG-6000處理下，3個(gè)雜交種苗期葉片中的SOD活性與對(duì)照相比均有上升，但是幅度不大，20% PEG-6000處理后，優(yōu)勢(shì)豆-A-5和雜交豆6號(hào)苗期葉片中的SOD活性急劇顯著上升，晉豆48的上升幅度較小(圖6-A)。

圖6 不同濃度PEG-6000處理對(duì)雜交大豆苗期葉片抗氧化酶活性的影響

過(guò)氧化物酶(POD)作為另一個(gè)主要保護(hù)酶其活性隨著PEG-6000溶液濃度的增加也呈現(xiàn)急劇增強(qiáng)(圖6-B)。不同濃度干旱脅迫下，3個(gè)雜交大豆苗期葉片中POD活性均顯著高于對(duì)照。5%PEG-6000處理下，雜交豆6號(hào)的增幅最大，其次是優(yōu)勢(shì)豆-A-5，晉豆48最低；10%PEG-6000處理下，3個(gè)雜交大豆苗期葉片中POD活性整體增幅均顯著高于5%PEG-6000處理，然而20% PEG-6000處理下，其增幅從大到小依次為：晉豆48(237.33%)>雜交豆6號(hào)(79.25%)>優(yōu)勢(shì)豆-A-5(43.58%)。

2.6 雜交大豆苗期抗旱性綜合評(píng)價(jià)

由2.1～2.5的結(jié)果可以看出，雜交大豆抗旱性受不同因素影響，并且同一因素在不同品種間也存在較大差異，很難從單一因素確定3個(gè)雜交大豆苗期的抗旱性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)20% PEG-6000脅迫后的各個(gè)性狀指標(biāo)明顯高于5% PEG-6000和10% PEG-6000，因此筆者采用20% PEG-6000脅迫后的各個(gè)指標(biāo)值，通過(guò)隸屬函數(shù)法來(lái)綜合評(píng)價(jià)3個(gè)雜交大豆苗期的抗旱性。從表2可以看出，3種雜交大豆的抗旱性從大到小分別為：優(yōu)勢(shì)豆-A-5>雜交豆6號(hào)>晉豆48，平均隸屬函數(shù)值分別為0.75，0.47和0.21。

表2 雜交大豆各項(xiàng)抗旱生理指標(biāo)相對(duì)值的隸屬函數(shù)值

3 討 論

干旱是影響植物正常生長(zhǎng)和減少產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一，而大豆的抗旱性是一個(gè)非常復(fù)雜的性狀，受多因素影響，不同發(fā)育期對(duì)抗旱性也存在一定差異，并且可能之間也不存在相關(guān)性[15-16]。對(duì)于大豆苗期抗旱性研究，前人主要采用盆栽反復(fù)干旱法[11,13]，對(duì)苗期干旱脅迫后測(cè)定生理指標(biāo)和產(chǎn)量性狀，然后進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)。但是本研究在生長(zhǎng)間采用PEG-6000水培模式模擬大豆苗期干旱脅迫，通過(guò)測(cè)定與大豆抗旱性密切相關(guān)的光合生理指標(biāo)、滲透物質(zhì)含量和抗氧化酶活性等，最后通過(guò)隸屬函數(shù)的方法鑒定3個(gè)雜交大豆苗期的抗旱性。相比于前人研究，利用PEG-6000水培模式并且在生長(zhǎng)間更容易控制大豆生長(zhǎng)環(huán)境，減少環(huán)境誤差，并且利用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)大豆15 d左右生長(zhǎng)期操作較為方便。

植物葉片中的葉綠素是光合作用的主要參與者，其含量可以一定程度上反應(yīng)光合作用強(qiáng)度，從而反應(yīng)植物生長(zhǎng)情況，同時(shí)也可反映植物抗逆性的強(qiáng)弱。本研究顯示，3個(gè)雜交大豆在不同程度干旱脅迫后，其SPAD值的趨勢(shì)是先變化不顯著，后期加大干旱脅迫強(qiáng)度后出現(xiàn)上升趨勢(shì)，該結(jié)果與劉麗平等、王建偉等、馬曉華等[17-19]結(jié)果一致。說(shuō)明干旱脅迫后雜交大豆葉片中葉綠素含量升高由可能是由于葉片中葉綠素濃縮效應(yīng)導(dǎo)致。植物受到干旱脅迫后，其葉片光合作用會(huì)受到一定的影響[20]，主要表現(xiàn)在氣孔關(guān)閉，從而導(dǎo)致植物對(duì)二氧化碳和水分的利用率下降，通過(guò)測(cè)定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間二氧化碳濃度(Ci)和氣孔導(dǎo)度(Gs)等指標(biāo)來(lái)鑒定其影響程度[21-23]。本研究中，隨著干旱脅迫的加劇，3個(gè)雜交大豆苗期葉片均表現(xiàn)出Pn、Tr、Ci和Gs下降的趨勢(shì)，這與前人[24-25]研究結(jié)果一致。干旱脅迫下，植物葉片的Pn下降應(yīng)該主要是由于干旱導(dǎo)致葉片組織損傷，從而使光合酶等活性下降。

隸屬函數(shù)是一種常見的多個(gè)影響因子綜合評(píng)價(jià)的方法，其可以避免由單一因素導(dǎo)致分析問(wèn)題的片面性，從而使評(píng)價(jià)結(jié)果更科學(xué)可靠。本研究利用隸屬函數(shù)值法將影響雜交大豆抗旱性的10個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而篩選出3個(gè)雜交大豆抗旱性最好的是優(yōu)勢(shì)豆-A-5，其次是雜交豆6號(hào)，晉豆48抗旱性較差。并且發(fā)現(xiàn)抗旱性最強(qiáng)的是優(yōu)勢(shì)豆-A-5，其具體表現(xiàn)在干旱脅迫后光合生理指標(biāo)(Pn、Gs、Ci和Tr)顯著高于其它兩個(gè)品種，說(shuō)明優(yōu)勢(shì)豆-A-5比其它兩個(gè)品種具有較強(qiáng)的葉片保水性和光合自身調(diào)節(jié)能力；而雜交豆6號(hào)抗旱性主要表現(xiàn)在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶等方面，如可溶性蛋白質(zhì)含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性比其它兩個(gè)品種高，但是整體抗旱性略遜色于優(yōu)勢(shì)豆-A-5。晉豆48干旱脅迫下在葉綠素含量和可溶性糖含量值較高，但是與其它兩個(gè)品種相比，抗旱性能力差。

4 結(jié) 論

本研究利用3個(gè)雜交大豆為試驗(yàn)材料進(jìn)行苗期抗旱性生理響應(yīng)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定葉綠素含量、光合生理指標(biāo)、滲透調(diào)節(jié)物含量和抗氧化酶活性等生理指標(biāo)，并且通過(guò)隸屬函數(shù)值法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，得出優(yōu)勢(shì)豆-A-5耐旱性最強(qiáng)。該結(jié)果為后期抗旱性雜交大豆育種提供數(shù)據(jù)支撐，并且將優(yōu)勢(shì)豆-A-5作為耐旱雜交大豆進(jìn)行大面積試種和推廣。