蒙星燁 劉曉 萬喆 陳偉 闕呈立 林連君 余進 宋營改 李若瑜

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100034；3.北京大學(xué)第一醫(yī)院老年病內(nèi)科，北京 100034)

近年來，肺部真菌病的發(fā)病率逐漸增加[1-3]。高齡是真菌感染明確的高危因素[4-5]，老年患者肺部真菌感染已成為重大的衛(wèi)生健康問題。研究發(fā)現(xiàn)侵襲性真菌病越來越多地影響到非中性粒細胞缺乏人群，包括慢性阻塞性肺疾病[6]、重癥流感[7]、控制不佳的糖尿病[8]和自身免疫性疾病患者[9]。肺部真菌病的早期診斷，尤其是準確識別致病真菌，對于早期治療和改善預(yù)后至關(guān)重要[10]。然而，在非中性粒細胞缺乏患者中，肺部真菌病的臨床表現(xiàn)與其他感染性肺炎相似，影像學(xué)表現(xiàn)往往不具有特異性[11]，血清半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)試驗靈敏度低[4,12]，傳統(tǒng)方法難以精準快速診斷。既往研究表明，分子生物學(xué)方法在侵襲性真菌病中具有較好應(yīng)用前景[13]，多項研究證實了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)在免疫功能抑制人群中對曲霉、毛霉和肺孢子菌感染具有良好的診斷性能[14]，并且支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)標本檢測的靈敏度高于血液[15-16]。目前在BALF中研究的PCR方法通常僅聚焦于一種致病真菌。隨著合并多種真菌感染日益增多，目前仍缺乏靈敏、快速鑒定真菌種類、更加全面的肺部真菌疾病的診斷系統(tǒng)。

本研究團隊前期設(shè)計了病原真菌real-time PCR檢測系統(tǒng)，針對肺部常見真菌病原體[1]，包括曲霉、毛霉、隱球菌和耶氏肺孢子菌。前期已在菌株水平上對相應(yīng)方法進行驗證，結(jié)果顯示靈敏度高，菌種間無交叉反應(yīng)，但尚未在懷疑肺部感染患者的BALF標本中進行驗證。本研究目的是在非中性粒細胞缺乏老年人群BALF標本中評估病原真菌real-time PCR方法對肺部真菌疾病的診斷價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究回顧性地收集北京大學(xué)第一醫(yī)院2021年5月至2022年5月之間懷疑肺部感染的老年患者的BALF標本，對送檢真菌學(xué)檢查(GM試驗、真菌鏡檢和培養(yǎng))的剩余標本進行病原真菌real-time PCR檢測。納入標準：①年齡≥60歲的住院患者；②外周血中性粒細胞計數(shù)>0.5×109/L；③根據(jù)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)懷疑肺部感染。排除標準：既往診斷肺部真菌病。收集患者的基礎(chǔ)疾病、危險因素、臨床癥狀、影像學(xué)和病原學(xué)檢查結(jié)果，用于診斷的分類，以上結(jié)果從常規(guī)臨床實踐中獲得。本研究經(jīng)過北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(2021研010)。

1.2 診斷標準

對于侵襲性真菌病，根據(jù)歐洲癌癥研究和治療組織和真菌病研究組(EORTC/MSG)及其重癥監(jiān)護室研究組的定義[11,17]對肺部侵襲性真菌疾病進行分類。確診及臨床診斷的病例作為肺部侵襲性真菌病陽性組，排除侵襲性真菌病的患者作為陰性組，疑診病例不納入診斷的評估。因為本研究涉及BALF標本PCR和GM試驗診斷性能的評估，為了避免加和偏倚，排除BALF標本曲霉和肺孢子菌PCR、GM試驗陽性作為診斷的證據(jù)。對慢性肺曲霉病，結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)和曲霉抗體進行診斷[18]。

1.3 BALF標本DNA提取

取BALF標本1.5 mL離心后提取DNA，血性BALF采用QIAamp UCP病原體純化mini試劑盒(QIAGEN GmbH，德國)，洗脫緩沖液的體積為80 μL；非血性BALF采用真菌DNA核酸提取試劑盒IN-5-002(國為利君生物科技，北京)提取，最終得到80～100 μL標本DNA。

1.4 病原真菌real-time PCR

本研究采用前期設(shè)計的病原真菌real-time PCR檢測體系，包括針對曲霉屬及5種常見的曲霉物種(煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉)、毛霉目、隱球菌屬和耶氏肺孢子菌的引物和探針。目前已獲得專利授權(quán)(ZL202110452771.4)。引物探針由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。采用ABI Vii7 real time PCR儀(ABI，美國)，反應(yīng)體系：上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，探針(10 μmol/L)0.4 μL，2×PerfectStart II Probe SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye II 0.4 μL，模板DNA 2 μL，去離子水6.4 μL。反應(yīng)程序：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min×40個循環(huán)[19]。每次反應(yīng)設(shè)置陽性對照(曲霉菌株DNA)和空白對照(去離子水)。結(jié)果讀取循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct值)。

1.5 統(tǒng)計

連續(xù)變量采用Mann-Whitney U檢驗，分類變量采用χ2檢驗進行顯著性檢驗。通過受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析評價試驗的診斷價值。計算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用GraphPad Prism 7軟件進行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 入選患者及標本

在研究期間收集了來自296名非中性粒細胞缺乏老年患者的345份支氣管肺泡灌洗液。排除既往診斷肺部真菌疾病2名患者。8名患者在研究期間診斷肺部真菌疾病，排除在診斷后多次送檢的18份BALF(見圖1)。共納入來自294名患者的325份BALF。13名患者曾進行2～3次支氣管鏡檢查，17名患者在同一次支氣管鏡檢查中送檢2份來自不同部位的BALF 標本。

圖1 患者及BALF標本篩選分類流程圖Fig.1 Flow chart of the inclusion and classification of patients and bronchoalveolar lavage fluids

2.2 人口學(xué)特征

患者年齡分布在60～91歲，中位年齡69歲，183名(61.8%)男性，重癥監(jiān)護室住院患者共71名(24.3%)，11.5%患者接受預(yù)防性抗真菌治療(見表1)。

表1 患者臨床特點Tab.1 The clinical characteristics of patients

2.3 肺部真菌疾病分布

共27名(9.2%)患者符合確診或臨床診斷的肺部侵襲性真菌病(BALFn=31)，診斷分類見圖2，其中7名(25.9%)患者多種真菌合并感染。另外，6名(2.0%)患者符合慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis, CPA)診斷(BALFn=6)，4例肺曲霉球和2例慢性空洞性肺曲霉病。

圖2 肺部侵襲性真菌病的診斷分類及患者數(shù)量，重疊部分代表多種真菌合并感染Fig.2 The classification of pulmonary invasive fungal diseases and the number of patients, the overlap represents multiple fungal infections

2.4 BALF真菌學(xué)檢查結(jié)果

在侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、CPA和排除肺曲霉病三組患者中(BALFn=17/6/292)，分別有17、6和254份BALF標本進行真菌鏡檢和培養(yǎng)，所有標本進行了GM試驗和病原真菌real-time PCR檢測；在三組BALF中，真菌鏡檢觀察到菌絲分別占29.4%、33.3%和0.0%，真菌培養(yǎng)得到曲霉分別占90.9%、50.0%和2.0%。IPA患者BALF標本GM 光密度指數(shù)(optical density index, ODI)顯著高于排除肺曲霉病患者(中位數(shù)分別為1.4vs.0.2，P<0.0001)。

2.5 曲霉PCR和GM試驗的診斷價值

曲霉PCR在肺曲霉病(IPA和CPA)患者的23份BALF標本中均有擴增曲線，在排除肺曲霉病組292份BALF標本中，250份(85.6%)有擴增曲線。IPA患者BALF的曲霉PCR Ct值顯著低于排除肺曲霉病患者(中位數(shù)分別為31.9vs.37.6，P<0.001)。對于肺曲霉病，曲霉PCR Ct值和GM試驗 ODI的ROC曲線下面積分別為0.936和0.850，無顯著性差異(95%置信區(qū)間分別為0.865～1.000和0.763～0.936，P=0.144，見圖3)；兩者最佳cut-off值分別為34.8和0.6，對于肺曲霉病診斷的靈敏度、特異度分別為95.7%/92.1%和82.6%/80.8%(見表2)；GM試驗和曲霉PCR同時陽性時，特異度(97.9%)和陽性預(yù)測值(75.0%)最高，GM試驗和曲霉PCR其中之一陽性時，靈敏度(100%)和陰性預(yù)測值(100%)最高(見表2)。

圖3 BALF曲霉PCR Ct值和GM試驗ODI對肺曲霉病的診斷的受試者工作特征曲線，以(40-Ct值)繪制，對于曲霉PCR陰性的患者，將其Ct值設(shè)置為40Fig.3 The ROC curve of Aspergillus PCR cycle threshold and GM ODI in bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of aspergillosis, which was drawn with (40-cycle threshold). For the patients with negative Aspergillus PCR, set the cycle threshold as 40

表2 曲霉PCR和GM試驗對肺曲霉病的診斷價值Tab.2 The diagnostic value of Aspergillus PCR and GM test for aspergillosis

曲霉種水平PCR檢出最多的是煙曲霉，在IPA、CPA及排除肺曲霉病組中，分別有9例(53.0%)、4例(66.7%)、13例(4.4%)為陽性。在17例煙曲霉培養(yǎng)陽性的BALF中，12例煙曲霉PCR陽性。在3例黃曲霉培養(yǎng)陽性的BALF中，1例黃曲霉PCR陽性。在2例黑曲霉培養(yǎng)陽性的標本中，1例黑曲霉PCR陽性。在曲霉培養(yǎng)陽性的標本中，曲霉種水平PCR與培養(yǎng)結(jié)果的一致率為63.6%(14/22)。在曲霉培養(yǎng)陰性的BALF中，91.8%(213/232)曲霉種水平PCR陰性。

2.6 耶氏肺孢子菌、隱球菌和毛霉PCR

耶氏肺孢子菌PCR在耶氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystisjiroveciipneumonia, PJP)患者的19份 BALF標本中，18份陽性(Ct值中位數(shù)33.9，26.5～37.1)，在排除PJP組的296份BALF標本中，4份陽性(Ct值中位數(shù)37.9，36.9～39.0)。耶氏肺孢子菌PCR Ct值≤37.1作為陽性閾值，對于PJP的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為94.7%、99.7%、94.7%和100%。隱球菌PCR在肺隱球菌病組的4例BALF中2例陽性(Ct值為29.1和33.8)。毛霉PCR在1例肺毛霉病患者的BALF中為陽性(Ct值30.1)?？紤]到肺隱球菌病和肺毛霉病的患者數(shù)量少，無法評估最佳的cut-off值，隱球菌和毛霉PCR取Ct值≤35.0作為陽性，在肺隱球菌病和肺毛霉病中陽性率分別為50%(2/4)和100%(1/1)，在排除兩者的BALF標本中陰性率為100%(311/311)和98.7%(310/314)。

2.7 病原真菌real-time PCR的診斷價值

曲霉屬/毛霉/隱球菌/耶氏肺孢子菌PCR Ct值分別以34.8/35.0/35.0/37.1作為cut-off值，在不同診斷的患者中病原真菌real-time PCR檢測結(jié)果見表3。以PCR檢出的病原真菌與肺部真菌病的致病真菌一致作為陽性，病原真菌real-time PCR對肺部真菌病診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為86.5%(32/37)、91.0%(253/278)、56.1%(32/57)和98.1%(253/258)，總體符合率為90.5%(285/315)(見表2)。排除3例抗真菌藥物預(yù)防性治療的肺真菌病患者(1例IPA患者接受過伏立康唑和兩性霉素B治療，2例PJP患者接受過磺胺治療)，靈敏度為91.2%(31/34)。

表3 以患者診斷分類的病原真菌real-time PCR檢測結(jié)果，陽性閾值：曲霉Ct值≤34.8，毛霉Ct值≤35.0，隱球菌Ct值≤35.0，肺孢子菌Ct值≤37.1Tab.3 The results of the real-time PCR of fungal pathogens in different classifications of patients. Positive threshold (cycle threshold of PCR): Aspergillus≤34.8, Mucorales≤35.0, Cryptococcus≤35.0 and Pneumocystis jirovecii≤37.1

3 討 論

本研究探索了自行設(shè)計的病原真菌real-time PCR在非中性粒細胞缺乏老年患者中的診斷價值，證實此方法覆蓋了常見的肺部致病真菌，為肺部真菌病提供了一種相對靈敏、快速、全面的病原真菌診斷方法，尤其在多種真菌合并感染中靈敏度達到100%(9/9)，具有獨特的優(yōu)勢。近年來，隨著分子生物學(xué)的廣泛研究和PCR檢測方法標準化，已將血液和BALF標本的曲霉PCR以及呼吸道標本耶氏肺孢子菌PCR檢測陽性結(jié)果納入最新的侵襲真菌病的定義中[11]，盡管沒有推薦的診斷閾值，此外，目前缺乏在非重度免疫抑制或非中性粒細胞缺乏患者中的研究[17]。本研究初步探索了懷疑肺部感染的“非粒缺”老年患者BALF標本中曲霉和耶氏肺孢子菌PCR的cut-off值，對肺曲霉病和PJP診斷的靈敏度和特異度均超過90%，與以往在免疫功能低下的患者中的研究結(jié)果相似[14]。但是本研究中曲霉PCR的特異度(92.1%)低于部分已有的報道[20]，后者為免疫功能低下患者的研究，特異度通常達到95%以上?？赡艿脑蚴潜狙芯考{入了一部分非嚴重免疫功能抑制的患者，呼吸道一過性的存在非致病性曲霉。對于非免疫抑制的人群BALF中真菌菌群的研究顯示，盡管曲霉并非呼吸道定植的核心菌落，仍在一部分BALF中培養(yǎng)分離得到[21]。因此在曲霉PCR出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)該結(jié)合患者的免疫狀態(tài)、影像學(xué)和其他真菌學(xué)檢查綜合判斷，本研究結(jié)果顯示曲霉PCR結(jié)合GM試驗≥0.6，其特異度(97.9%)和陽性預(yù)測值(75.0%)提高。GM試驗和PCR聯(lián)合診斷具有更好的表現(xiàn)，與以往研究一致[15-16]，可能是由于兩者分別檢測曲霉的細胞壁成分和曲霉DNA，因此有相互補充的可能。本研究中抗真菌治療有降低PCR檢測靈敏度的趨勢，在3例既往接受過抗真菌治療的肺部真菌病患者中2例PCR檢測為假陰性，未來仍需擴大標本量進一步驗證。但也有報道稱，BALF標本曲霉PCR檢測在經(jīng)過和未經(jīng)過抗真菌治療的患者中靈敏度無統(tǒng)計學(xué)差異[16,22]。本研究中隱球菌PCR的陽性率較低(50%，2/4)，可能是由于DNA提取失敗所致，因此對懷疑隱球菌感染的患者，應(yīng)該延長破壁的時間，提高DNA產(chǎn)量。

本研究的診斷參考標準是EORTC/MSG的確診和臨床診斷標準[11,17]，以及慢性肺曲霉病診療指南[18]，依據(jù)臨床信息，對每個患者單獨進行診斷分類。根據(jù)臨床實踐常規(guī)進行病原學(xué)送檢，并非所有患者進行了全面的真菌學(xué)檢查，因此侵襲性和非侵襲的肺真菌病可能被低估。而且，為了評估BALF GM試驗，排除此方法作為真菌學(xué)證據(jù)，可能導(dǎo)致真菌鏡檢和培養(yǎng)靈敏度的高估。未來需要開展前瞻性的研究進一步證實培養(yǎng)和非培養(yǎng)真菌學(xué)檢查的診斷價值，尤其在非中性粒細胞缺乏患者中。

本研究存在一些局限性，首先是利用臨床傳統(tǒng)真菌學(xué)檢查的剩余標本而不是單獨保存的標本，可能存在污染。此外，本研究中隱球菌病和毛霉病例較少，對毛霉和隱球菌PCR的cut-off值無法進行準確評估。綜上所述，本研究團隊開發(fā)的病原真菌real-time PCR檢測覆蓋了常見的肺部致病真菌，與診斷的符合率達到90%，在多種真菌合并感染的快速診斷方面具有優(yōu)勢。在曲霉、毛霉和耶氏肺孢子菌的感染方面，靈敏度和特異度均較高，具有區(qū)分致病和非致病真菌(污染、定植等)的潛力，值得在臨床上進一步應(yīng)用推廣。