張亞麗，蔣毅

1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

支氣管哮喘（哮喘）是常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，其本質(zhì)是慢性氣道炎癥，由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與。誘導(dǎo)痰檢測(cè)是通過(guò)霧化吸入高滲鹽水誘導(dǎo)產(chǎn)生痰液，進(jìn)而分析其中細(xì)胞成分和上清液可溶性介質(zhì)的一項(xiàng)技術(shù)［1］。作為氣道采樣的一種非侵入性方法，誘導(dǎo)痰檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、安全、可靠、簡(jiǎn)便、可重復(fù)、更易被患者接受的優(yōu)點(diǎn)。已有研究表明，誘導(dǎo)痰和自然咳痰的檢測(cè)結(jié)果差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［2］，所反映的氣道炎癥結(jié)果也與其他傳統(tǒng)有創(chuàng)技術(shù)結(jié)果具有一致性，故誘導(dǎo)痰檢測(cè)常用于不能自主排痰的患者。誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)被廣泛用于哮喘的診斷、分型、炎癥水平的評(píng)估，其非細(xì)胞成分如細(xì)胞因子等在哮喘中的作用也在臨床實(shí)驗(yàn)中被反復(fù)驗(yàn)證。近年來(lái)，組學(xué)在國(guó)內(nèi)外各項(xiàng)研究中的運(yùn)用不斷成熟。對(duì)誘導(dǎo)痰成分進(jìn)行組學(xué)分析，特別是轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白組學(xué)分析為哮喘診治、病理生理學(xué)研究提供了一個(gè)全新的方向［3］。本文將從以上幾個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)

誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)在臨床上已被廣泛應(yīng)用，主要是對(duì)其中的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所占百分比進(jìn)行分析。目前尚無(wú)公認(rèn)的誘導(dǎo)痰細(xì)胞計(jì)數(shù)參考值范圍［4］。

誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)結(jié)果與傳統(tǒng)診斷、評(píng)估哮喘方法具有一致性，但其在哮喘分型、病情評(píng)估、個(gè)體化治療上的作用不可替代。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與肺功能中1 s用力呼氣量（FEV1）、1 s用力呼氣量占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）、1 s用力呼氣量與用力肺活量比值（FEV1/FVC%）均呈負(fù)相關(guān)［5-6］。對(duì)比誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞百分比與呼出氣一氧化氮（FeNO）、呼氣峰流速（PEF）變異率、基線FEV1、FEV1/FVC%、口服糖皮質(zhì)激素后FEV1的變化等在哮喘中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)痰嗜酸性粒細(xì)胞的敏感度（86%）和特異度（88%）最高［7］。誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)反應(yīng)的氣道炎癥水平可用來(lái)評(píng)估病情，還可根據(jù)誘導(dǎo)痰中細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)所占比例比將哮喘分為四種表型：嗜酸性粒細(xì)胞型（單純嗜酸性粒細(xì)胞百分比≥2.5%，中性粒細(xì)胞百分比＜61%）、中性粒細(xì)胞型（中性粒細(xì)胞百分比≥61%）、混合細(xì)胞型（嗜酸性粒細(xì)胞百分比≥2.5%且中性粒細(xì)胞百分比≥61%）、寡細(xì)胞型（各細(xì)胞比例均在正常范圍）［8-9］。不同表型哮喘患者表現(xiàn)為不同的臨床特征。誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞比例在重癥哮喘患者中顯著增高，可見誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞水平可能與哮喘嚴(yán)重程度、肺功能下降有關(guān)。也有研究證明，誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞比例的升高與哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)［10］。中性粒細(xì)胞比例增高還多見于老年哮喘患者，或空氣污染、細(xì)菌、病毒感染的哮喘患者［11-12］。連續(xù)監(jiān)測(cè)痰中嗜酸性粒細(xì)胞以量身定制成人哮喘治療方案可能會(huì)減少哮喘惡化，這在兒童哮喘中也同樣得到證明［13-14］。

臨床中誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)可反映氣道炎癥類型及水平的動(dòng)態(tài)變化，借以評(píng)估治療效果，及時(shí)調(diào)整治療方案，還有利于長(zhǎng)期優(yōu)化管理和評(píng)估預(yù)后。但目前由于時(shí)間和成本問(wèn)題，在臨床工作中進(jìn)行頻繁的誘導(dǎo)痰分析被限制，其在臨床實(shí)踐中的診斷和治療價(jià)值還需要進(jìn)一步探索和發(fā)展。

2 誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞因子

誘導(dǎo)痰中各種非細(xì)胞成分中，細(xì)胞因子檢測(cè)在臨床及各項(xiàng)研究中的運(yùn)用最為常見。誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子主要是由氣道上皮細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，在哮喘發(fā)病的各個(gè)階段發(fā)揮作用并參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展［15］。根據(jù)引起氣道炎癥的免疫反應(yīng)不同，哮喘可以分為2型與非2型，分別由不同的細(xì)胞因子介導(dǎo)。呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是哮喘的病理特征，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等參與嗜酸性細(xì)胞的活化、增生、聚集曾被認(rèn)為在哮喘發(fā)病中起主要作用；IL-4、IL-13還可促進(jìn)免疫球蛋白E的分泌，促進(jìn)氣道炎癥的形成與維持。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)IL-13還參與維持氣道高反應(yīng)性、氣道重塑，在哮喘中發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越引起重視。參與非2型哮喘發(fā)病的細(xì)胞因子及可能的機(jī)制：IL-8、TNF-ɑ、白三烯B4趨化形成肺組織中性粒細(xì)胞炎癥；IL-17介導(dǎo)的3型免疫反應(yīng)；干擾素-γ介導(dǎo)的1型免疫應(yīng)答；全身性炎癥反應(yīng)（由IL-6介導(dǎo)）。還有一些由氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子如胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）、IL-25、IL-33、IL-8，作為促炎因子，促進(jìn)各型免疫反應(yīng)的極化，在哮喘發(fā)病的初期起重要作用。

哮喘患者誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子水平與正常對(duì)照組之間有著明顯差異已被反復(fù)驗(yàn)證，且與疾病嚴(yán)重程度、控制情況密切相關(guān)。曾有研究表明，在重癥哮喘患者誘導(dǎo)痰中GM-CSF、IL-26明顯增多［16］。近期的研究也發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)痰中TSLP、TNF-α等水平與哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)［17］，IL-6與FEV1、FEV1/FVC呈顯著負(fù)相關(guān)［18］。還有研究證明，誘導(dǎo)痰中TNFR1和TNFR2在中性粒細(xì)胞型哮喘和重癥哮喘患者中明顯增加，其水平還與肺功能、哮喘控制情況、年齡密切相關(guān)［19］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-5、IL-17a、IL-25 mRNA高表達(dá)的患者肺功能參數(shù)明顯下降；哮喘未控制組痰中IL-5、IL-17a、IL-25 mRNA表達(dá)高于哮喘控制組，IL-5、IL-17a高表達(dá)的哮喘患者中未控制哮喘發(fā)生率顯著高于低表達(dá)的哮喘患者，IL-5、IL-17a、IL-25高表達(dá)的患者哮喘往往難以控制［20］。

除了對(duì)哮喘病情評(píng)估，誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子檢測(cè)在不同哮喘表型的病理生理分析上也被廣泛應(yīng)用，為制訂個(gè)體化的治療方案提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，老年哮喘患者中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞水平升高，IL-1β、IL-6、IL-8、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1、GM-CSF、與Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子蛋白表達(dá)升高。研究還表明，老年哮喘患者痰中IL-6、人類巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α水平升高與哮喘控制率降低顯著相關(guān)，痰中中性粒細(xì)胞、IL-1β、IL-6和人類巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α水平升高與過(guò)去12個(gè)月住院風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［21］。關(guān)注誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子的檢測(cè)有助于針對(duì)老年哮喘患者這一特殊人群制訂新的管理策略。FEV1快速下降的哮喘患者誘導(dǎo)痰中IL-5、IL-8水平明顯上升。這些因子可能是哮喘患者FEV1加速下降的非侵入性生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［22］。檢測(cè)分析誘導(dǎo)痰中細(xì)胞因子雖然還沒(méi)有廣泛運(yùn)用于臨床，但在哮喘的發(fā)病、病情評(píng)估、個(gè)體化治療等研究中的作用已被反復(fù)驗(yàn)證。

3 誘導(dǎo)痰轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在整體水平上研究細(xì)胞或組織中基因的轉(zhuǎn)錄情況，反映不同組織或細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的總體特征。利用誘導(dǎo)痰轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以對(duì)異質(zhì)性的標(biāo)本進(jìn)一步分析，有助于加深對(duì)哮喘的認(rèn)識(shí)，為哮喘的發(fā)病機(jī)制研究及診斷提供新思路，甚至可能為治療提供新靶點(diǎn)，特別是近年來(lái)被用于重度哮喘，使重度哮喘研究有了全新突破。

一項(xiàng)研究采用無(wú)監(jiān)督聚類分析法對(duì)哮喘患者痰與血轉(zhuǎn)錄組分析確定了三個(gè)具有不同臨床和生理特征的“轉(zhuǎn)錄內(nèi)型”，其中兩種與重度哮喘特征相關(guān)，表明哮喘個(gè)體中存在著與年齡、發(fā)病年齡或持續(xù)時(shí)間無(wú)關(guān)的常見、穩(wěn)定的基因表達(dá)模式，其中嚴(yán)重哮喘患者中基因表達(dá)存在系統(tǒng)性改變［23］。BAINES等［24］對(duì)哮喘患者誘導(dǎo)痰的全基因組基因表達(dá)譜采用皮爾遜中心完全鏈接算法進(jìn)行聚類分層分類，將哮喘在轉(zhuǎn)錄水平上分為三種表型，第一種富含嗜酸性粒細(xì)胞，第二種富含中性粒細(xì)胞，而第三種表型不遵循粒細(xì)胞炎癥模式。這與之前根據(jù)誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)分類確定的嗜酸性、嗜中性和寡細(xì)胞型哮喘的炎癥表型相似，但并未對(duì)混合細(xì)胞型單獨(dú)分類，混合粒細(xì)胞性炎癥哮喘被視為一種過(guò)渡型炎癥，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)比例被歸在第一類或第二類中。這三種基因表達(dá)差異與哮喘癥狀、免疫和炎癥反應(yīng)均有關(guān)。這項(xiàng)研究支持了哮喘的分子異質(zhì)性，為進(jìn)一步探討哮喘表型的病理機(jī)制提供一個(gè)框架。

近年來(lái)誘導(dǎo)痰轉(zhuǎn)錄組學(xué)被運(yùn)用于特殊類型哮喘機(jī)制研究不斷取得新進(jìn)展。一項(xiàng)研究對(duì)重度哮喘患者、非重度控制哮喘患者、非重度未控制哮喘患者、健康對(duì)照組的誘導(dǎo)痰轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，與其他組相比，重度哮喘患者的基因差異性表達(dá)。其中最明顯的是CLC，它是嗜酸性炎癥的標(biāo)志，可能反映嚴(yán)重哮喘患者痰嗜酸性粒細(xì)胞的升高，進(jìn)一步通路分析發(fā)現(xiàn)p38通路基因高度表達(dá)，這表明p38信號(hào)通路在嚴(yán)重哮喘的發(fā)病中起重要作用，p38通路可能為重癥哮喘潛在的治療靶點(diǎn)［25］。KIM等［26］對(duì)老年患者誘導(dǎo)痰進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，根據(jù)聚類分析，將老年哮喘患者分為兩個(gè)不同的分子簇，其中OXPHS基因集在一個(gè)聚類中顯著豐富，EMT基因在另一個(gè)聚類中顯著豐富，這兩種基因分別與氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老引起的細(xì)胞組織重塑有關(guān)，提示這兩種機(jī)制參與老年哮喘的發(fā)生與發(fā)展。

4 誘導(dǎo)痰蛋白組學(xué)

隨著質(zhì)譜和生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白組學(xué)被應(yīng)用于多種疾病的研究［27］。通過(guò)對(duì)生物材料中的數(shù)百個(gè)蛋白進(jìn)行測(cè)序，可獲得大量生物學(xué)信息。對(duì)人體在疾病或疾病前期表現(xiàn)出的或優(yōu)先表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定、鑒別有助于發(fā)現(xiàn)疾病新的生物標(biāo)志物，為哮喘發(fā)病機(jī)制、診斷及特異性治療提供新思路。

對(duì)哮喘患者誘導(dǎo)痰進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)不同臨床表型哮喘患者蛋白差異表達(dá)，同樣，不同蛋白組哮喘患者臨床特征也有所不同。一項(xiàng)對(duì)誘導(dǎo)痰蛋白組學(xué)綜合質(zhì)譜分析的研究發(fā)現(xiàn)，典型哮喘、咳嗽變異性哮喘（CVA）、胸悶變異性哮喘（CTVA）患者的痰液中有23種蛋白分泌量顯著高于健康對(duì)照組，而這三種哮喘患者的誘導(dǎo)痰在蛋白譜和蛋白水平上無(wú)明顯差異，再次驗(yàn)證了典型哮喘、CVA、CTVA具有相似的發(fā)病機(jī)制。但三種哮喘患者痰液中的部分蛋白表達(dá)存在差異，這些蛋白可作為不同臨床表現(xiàn)哮喘的特異蛋白，用于其機(jī)制、診斷、治療等的進(jìn)一步研究［28］。對(duì)哮喘控制良好與控制不佳患者的血液和誘導(dǎo)痰進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在血液和誘導(dǎo)痰中均可測(cè)得一組生物標(biāo)志物，其在兩組間濃度存在差異［29］。SCHOFIELD等［30］對(duì)246例受試者（206例哮喘患者）的痰上清液采用無(wú)偏標(biāo)記定量質(zhì)譜和拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析方法進(jìn)行分析，基于蛋白質(zhì)組特征的相似性，將哮喘分為10個(gè)蛋白質(zhì)型，其中3個(gè)為嗜酸性粒細(xì)胞型，3個(gè)為嗜中性粒細(xì)胞型，2個(gè)為粒細(xì)胞炎癥較低的特應(yīng)型，另外2個(gè)根據(jù)其粒細(xì)胞偏向被歸為嗜酸性細(xì)胞型或嗜中性粒細(xì)胞型，實(shí)現(xiàn)了比目前僅通過(guò)粒細(xì)胞計(jì)數(shù)表型更深層次的分層，這三種粒細(xì)胞分型各有其對(duì)應(yīng)的臨床特點(diǎn)，而其蛋白組型之間存在差異，又相互聯(lián)系。

誘導(dǎo)痰蛋白組學(xué)還有利于哮喘早期診斷及與其他疾病的鑒別診斷。一項(xiàng)針對(duì)慢性支氣管炎/慢性黏液分泌過(guò)多患者的研究，通過(guò)誘導(dǎo)痰蛋白定量方法，成功鑒別出一組蛋白質(zhì)，它們可以不依賴于患者的臨床表現(xiàn)和影像、功能學(xué)檢查，對(duì)慢性支氣管炎、哮喘、慢阻肺和哮喘-慢阻肺重疊進(jìn)行早期診斷，證明了誘導(dǎo)痰蛋白組學(xué)在鑒別氣道疾病方面的潛力［31］。同樣，對(duì)已確診為哮喘、過(guò)敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、支氣管擴(kuò)張的患者誘導(dǎo)痰蛋白組學(xué)進(jìn)行分析，分別可鑒別出一組蛋白，其表達(dá)在不同疾病中存在差異［32-33］。相較于一種生物標(biāo)志物，蛋白組學(xué)在哮喘診斷、鑒別診斷方面表現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)已被廣泛用于臨床，其非細(xì)胞成分在各項(xiàng)臨床研究中的應(yīng)用也已經(jīng)很成熟，近年來(lái)組學(xué)在誘導(dǎo)痰中的應(yīng)用為哮喘的研究提供了一個(gè)全新的方向。且隨著檢測(cè)技術(shù)的成熟、成本的降低、研究方法的不斷更新，越來(lái)越多的生物信息可從誘導(dǎo)痰中獲取，并用于臨床工作與實(shí)驗(yàn)研究。誘導(dǎo)痰檢測(cè)技術(shù)在哮喘的診斷、監(jiān)測(cè)疾病、研究發(fā)病機(jī)制和治療中的潛力值得我們期待。