李佩 林凌 趙瑋

中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科 廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室 廣州 510055

口腔頜面部的軟硬組織損傷嚴(yán)重影響患者口腔頜面部的形態(tài)及功能，微創(chuàng)且快速的軟硬組織修復(fù)再生是臨床治療的目標(biāo)。創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，臨床常用各種皮瓣或組織移植術(shù)，或者用生物相容性良好的材料替代缺損組織從而恢復(fù)功能，但存在缺點如二次損傷、不美觀、周期長、費用高或異物感強(qiáng)等問題，因此口腔頜面部的軟硬組織損傷修復(fù)再生仍是當(dāng)前口腔醫(yī)學(xué)面臨的一個重要挑戰(zhàn)。

近年來，利用組織工程方法修復(fù)組織缺損取得了較大進(jìn)展，它涉及種子細(xì)胞、支架材料及生物活性因子等的有機(jī)結(jié)合，其中種子細(xì)胞是組織工程的核心成分。乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）是從人類乳牙殘留牙髓中分離出來的、具有高度自我更新和增殖分化能力的一類間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC），其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)同源，表現(xiàn)出極好的神經(jīng)分化潛力[1]。從再生醫(yī)學(xué)的角度看，SHED是最有價值的一種MSC，因為隨著年齡增長，干細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量均會下降，而相對于其他MSC，SHED細(xì)胞較接近胚胎特征；此外，SHED容易取得，可長期保存，體外擴(kuò)增速度快，多系分化能力類似于其他MSC，甚至更勝一籌[2]。

SHED在干細(xì)胞治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，本文就近期SHED在口腔組織修復(fù)中的研究結(jié)果進(jìn)行回顧總結(jié)，闡述其應(yīng)用優(yōu)勢和可能的作用機(jī)制，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 SHED的干性維持與分化調(diào)控

2003年，Miura等[3]從脫落的乳牙殘余牙髓中分離出獨特的多能干細(xì)胞群體。每個脫落的前牙約能形成12～20個細(xì)胞集落。較多研究[1-12]表明：與其他來源的MSC相比，SHED表現(xiàn)出更高的增殖速率，且能高度表達(dá)幾乎所有MSC的表面標(biāo)記。培養(yǎng)和保存技術(shù)對干細(xì)胞的持續(xù)性研究及應(yīng)用具有重要意義，目前普遍認(rèn)為長期冷凍保存乳牙的牙髓組織是一種無害且可行的干細(xì)胞臨床儲備方法。SHED在液氮中冷凍保存2年以上仍能保持最初的干細(xì)胞特性[13]。但干細(xì)胞經(jīng)過長期培養(yǎng)也可能面臨衰老，長期體外培養(yǎng)和傳代的干細(xì)胞衰老涉及多種途徑，可能與p53、p21和p16Ink4a的表達(dá)有關(guān)[14]，因此如何維持細(xì)胞干性十分重要。研究發(fā)現(xiàn)：低氧條件下的培養(yǎng)可能有助于維持SHED的靜止?fàn)顟B(tài)并增加多能基因（OCT4、SOX2和NANOG）的表達(dá)[9]，氯化鈷可以協(xié)助低氧環(huán)境下的SHED保持細(xì)胞干性、抑制分化，且無明顯細(xì)胞毒性[15]。另有研究者[16]嘗試構(gòu)建永生細(xì)胞系，Bmi-1誘導(dǎo)的細(xì)胞永生化不會影響SHED的主要特征，能長時間傳代并穩(wěn)定表達(dá)干細(xì)胞特征，是用于長期研究的潛在工具。適當(dāng)改變SHED的微環(huán)境可促進(jìn)其分化過程。有學(xué)者[17]使用成纖維細(xì)胞系條件培養(yǎng)基和3D絲素蛋白多孔支架并同時對培養(yǎng)細(xì)胞施加機(jī)械應(yīng)力的動態(tài)循環(huán)系統(tǒng)可促使SHED分化出高活力的干細(xì)胞球，其功能性蛋白合成更高。該作者認(rèn)為：傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的共培養(yǎng)物中只有少量生長因子，不足以模擬體外干細(xì)胞的分化，而動態(tài)循環(huán)系統(tǒng)中成纖維細(xì)胞系條件培養(yǎng)基生長因子濃度更高，從而避免了向培養(yǎng)基中添加其他化學(xué)試劑或生長因子的需求，是促使SHED分化更簡便和更經(jīng)濟(jì)的一種方法。有研究者[11]通過使SHED穩(wěn)定表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子1α，增強(qiáng)了其血管生成的自分泌和旁分泌信號，具體表現(xiàn)為內(nèi)皮分化能力增強(qiáng)，形成的脈管系統(tǒng)比用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成的更高，提示了SHED取代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成為血管再生種子細(xì)胞的潛力。另外，660 nm波長的InGaAlP二極管激光不僅促進(jìn)SHED增殖，也能使其表達(dá)更多血管內(nèi)皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）、VEGF-A和胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）等血管生成蛋白[18]，發(fā)揮促血管生成作用。

2 SHED在口腔組織再生修復(fù)中的直接應(yīng)用

2.1 SHED在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生中的應(yīng)用

早在2003年，有研究者[3]就發(fā)現(xiàn)SHED能分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，但不能形成完整的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，即不能形成真正意義上的牙髓組織，該作者認(rèn)為是其過于“幼稚”的緣故。近年來，研究者們嘗試了多種輔助支架以實現(xiàn)牙髓再生，且成功利用SHED構(gòu)建出了牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。體外實驗證明：SHED結(jié)合可注射、可降解支架（肽水凝膠、Ⅰ型膠原蛋白、聚乳酸）[19-21]注入根管后，可以產(chǎn)生功能性的牙髓，表現(xiàn)出與正常牙髓相似的細(xì)胞性和血管化，包含成牙本質(zhì)細(xì)胞的牙髓樣組織能在整個根管壁以約10 μm·d-1的速度產(chǎn)生新的牙本質(zhì)，有助于牙髓壞死的年輕恒牙的牙根形成。另外，釉基質(zhì)蛋白衍生物（enamel matrix derivative，EMD）、礦物三氧化物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）和Biodentine能 增 強(qiáng)SHED的細(xì)胞活力，增強(qiáng)礦化和牙本質(zhì)唾液蛋白表達(dá)，其中EMD表現(xiàn)最佳[12]。

值得注意的是，SHED與促使其分化的微環(huán)境缺一不可，支架本身并不能誘導(dǎo)SHED向牙本質(zhì)細(xì)胞分化，即牙本質(zhì)來源的信號分子對分化是必需的；而在沒有SHED的條件下，信號分子誘導(dǎo)宿主細(xì)胞形成的牙髓結(jié)構(gòu)紊亂，提示在無細(xì)胞組織工程學(xué)中，信號分子可能要結(jié)合到支架中，進(jìn)而從根尖周區(qū)主動募集細(xì)胞[20]。理想的細(xì)胞黏附支架應(yīng)具有為干細(xì)胞提供穩(wěn)定的附著位點、可緩慢降解和為干細(xì)胞提供血管化條件等特點。研究者們試圖通過各種方法改造支架從而增強(qiáng)其性能，提高干細(xì)胞的黏附率和增殖分化效率，比如通過壓縮提高其膠原蛋白密度或在支架上添加生長因子[12,19]，但技術(shù)敏感度較高，目前尚未出現(xiàn)臨床效果確定的支架材料。而在牙髓血管生成過程中，除了支架和干細(xì)胞，另一重要角色則是細(xì)胞間的通訊工具如外泌體和細(xì)胞因子，誘導(dǎo)SHED成牙本質(zhì)向分化和形成新生血管。外泌體依托表面的特異性蛋白識別靶細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞，再將囊泡中的促血管生成信號釋放到靶細(xì)胞中，從而觸發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)[22]；眾多的細(xì)胞因子如VEGF等則參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，或激活相關(guān)信號通路來促進(jìn)SHED向成牙本質(zhì)或血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，較多研究[23-26]發(fā)現(xiàn)：Eph/ephrinB和Wnt/β-catenin信號通路參與SHED向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程，這些作用最終都促進(jìn)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的形成。

2.2 SHED在牙周組織再生中的應(yīng)用

有研究[27-28]發(fā)現(xiàn)：SHED能刺激單核巨噬細(xì)胞向抗炎表型（M2型）巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，減少破骨細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制炎性因子干擾素-γ（interferonγ，INF-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）表達(dá)，從而減少牙齦出血，增加牙周膜新附著的產(chǎn)生，縮短釉牙骨質(zhì)界與牙槽嵴頂之間的距離，這項研究利用大鼠牙周炎模型證明了SHED的局部傳遞得益于M2巨噬細(xì)胞極化的誘導(dǎo)。進(jìn)一步地，SHED聯(lián)合牙本質(zhì)基質(zhì)成功移植實現(xiàn)了牙周組織的體內(nèi)再生，該牙周組織由新生的牙周膜、血管和牙槽骨組成[29]。有研究者[8]認(rèn)為：SHED對牙周炎的抑制作用可能與其在促炎細(xì)胞因子刺激下高表達(dá)的β-防御素4有關(guān)，β-防御素4具有抗炎和抗菌活性，對牙齦卟啉單胞菌敏感，還能通過調(diào)節(jié)Notch途徑增強(qiáng)SHED的成骨和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化潛能。SHED移植為牙周-牙髓聯(lián)合病變和再植牙的牙周膜愈合提供了新的解決思路，需要進(jìn)一步工作去探究其可行性及有效性。

2.3 SHED在骨再生中的應(yīng)用

相比于其他來源的MSC，SHED在成骨條件培養(yǎng)下旁分泌活性更強(qiáng)，促血管生成特征更明顯[3,14,30-33]，有利于類骨質(zhì)的生成。與人牙髓干細(xì)胞和骨髓MSC相比，其在重建牙槽骨時，新生的類骨質(zhì)最多、膠原纖維分布最廣泛[31]，不僅早期類骨質(zhì)生成速度快，還可增強(qiáng)晚期骨礦化程度，可能是因為SHED分泌的堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibrobast growth factor，bFGF）通過平衡磷酸鹽和焦磷酸鹽的比例從而調(diào)控礦物質(zhì)沉積的量[33]，而體外添加不同濃度的氯己定則會在一定程度上抑制SHED的礦化潛力[34]。

為了提高SHED的成骨分化效率，較多研究旨在創(chuàng)造最適合的成骨分化的微環(huán)境，涉及多種新型材料、技術(shù)、支架和生長因子的聯(lián)合使用。有研究者[10]使用間接親和力固定技術(shù)將Notch配體Jagged-1和Delta樣配體蛋白（delta-like 1 protein，Dll-1）固定在組織培養(yǎng)表面，在接種于Jagged-1表面的細(xì)胞群中，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的量及活性、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)和礦化作用顯著增加，而接種于Dll-1表面的細(xì)胞群促進(jìn)成骨分化效果不明顯。另有實驗[35]證明：氧化石墨烯量子點誘導(dǎo)了SHED的成骨分化，而氧化石墨烯呈現(xiàn)輕微抑制作用，這與石墨烯衍生物的濃度、合成方法和氧化程度都有密切關(guān)系，該作者認(rèn)為SHED的成骨分化途徑是通過吸收氧化石墨烯衍生物從而使細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的蛋白水平上調(diào)，并激活Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。

許多研究者[13,25]為了驗證SHED的成骨作用開展了動物實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：利用羥磷灰石/磷酸三鈣（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）移植載體能重建骨小梁，改善骨質(zhì)疏松和修復(fù)免疫受損小鼠的顱骨缺損；同時，碳酸鹽磷灰石支架生物相容性強(qiáng)，具有誘導(dǎo)骨生成和骨傳導(dǎo)的能力，能誘導(dǎo)出適合成骨分化的微環(huán)境，可能和骨蛋白酶和核因子κb受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）的表達(dá)情況有關(guān)[36]。還有學(xué)者[37]自制可快速降解的鈣磷纖維支架，利用了月桂酰氯提高礦物相在聚左旋乳酸（poly-l-lactic acid，PLLA）聚合物基質(zhì)中的分散性，并結(jié)合不影響材料力學(xué)性能的電紡絲法，研究證明適合乳牙干細(xì)胞生長。另外，有研究者[5]將SHED植入拔牙位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：其能明顯修復(fù)牙槽骨缺損，增強(qiáng)骨重建過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）和BMP-7的表達(dá)，同時減弱基質(zhì)金屬蛋白-8（matrix metalloproteinases-8，MMP-8）的表達(dá)。但值得思考的是，這種適合分化的微環(huán)境也會受到本身病理條件的影響，如何讓SHED在炎癥環(huán)境中保持高效的增殖分化和旁分泌活動仍需要更深入的研究。

3 SHED在口腔組織再生修復(fù)中的其他應(yīng)用

3.1 SHED在神經(jīng)保護(hù)中的應(yīng)用

由于SHED與中樞神經(jīng)系統(tǒng)同源，因此其表現(xiàn)出極好的神經(jīng)分化潛力，能表達(dá)與神經(jīng)保護(hù)、軸突伸長和神經(jīng)祖細(xì)胞有關(guān)的蛋白，對神經(jīng)變性和炎癥都有治療作用[1,7,38-39]。Kitase等[38]探究了SHED對大鼠缺氧缺血性腦病的治療效果，在靜脈用藥的情況下，受損皮層只檢測到少量的SHED，即使如此，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的比例也明顯降低，而M2型增加，伴隨明顯降低的炎性反應(yīng)，在后續(xù)行為測試中大鼠的肢體活動性和耐力都表現(xiàn)更好。進(jìn)而，作者用氧和葡萄糖缺乏的神經(jīng)元培養(yǎng)實驗證實了SHED的神經(jīng)保護(hù)作用。在腦外傷小鼠模型中，SHED可以顯著減少活化小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥因子如白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和TNF-α。同時，外傷中產(chǎn)生的具有神經(jīng)毒性的亞硝酸鹽濃度降低，可能與無細(xì)胞分泌物中外泌體的調(diào)節(jié)有關(guān)[39]，相比于使用SHED共培養(yǎng)系統(tǒng)，純化的外泌體本身可能對炎癥的減輕作用更大。

3.2 SHED在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用

損傷修復(fù)和組織再生離不開炎癥的控制，目前較多研究支持MSC的炎癥調(diào)節(jié)作用是一把“雙刃劍”，包括抗炎和促炎作用，在炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈的情況下，口腔MSC通過直接接觸或旁分泌效應(yīng)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞、炎癥細(xì)胞因子，RANKL/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）和破骨細(xì)胞來抑制炎癥產(chǎn)生和骨吸收，防止免疫反應(yīng)過度表達(dá)；當(dāng)處于低炎癥水平時，口腔MSC可促進(jìn)炎癥產(chǎn)生和骨骼吸收[40]。MSC影響多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞（包括CD3+、CD4+和CD8+、T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等）的活動，它們的相互作用調(diào)節(jié)了局部炎癥微環(huán)境，但也可能影響MSC的遷移、歸巢、增殖和分化能力[6,40]，涉及的多種炎癥因子較為復(fù)雜，尚不明確。有研究者認(rèn)為SHED在免疫治療中相對于其他MSC較有優(yōu)勢。首先，其受免疫細(xì)胞影響較小，Whiting等[41]測定了不同口腔干細(xì)胞對活化自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）毒性的敏感度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SHED在多種濃度的NK細(xì)胞環(huán)境中都能保持較好的活性，且在體內(nèi)抑制輔助型T細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）免疫應(yīng)答和在體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增方面都優(yōu)于骨髓源的MSC[6]。

4 小結(jié)

綜上所述，SHED在口腔組織再生修復(fù)的應(yīng)用中有許多優(yōu)勢，如易取、無創(chuàng)、較少倫理爭議，且可以實現(xiàn)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體和牙周組織再生，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和炎癥控制等多方面作用。但在SHED的臨床應(yīng)用前還有許多需要考慮的地方，如有研究[42]發(fā)現(xiàn)：鎵鋁砷化鎵（GaAlAs）二極管激光照射、次氯酸鈉、臭氧水和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對SHED可能存在細(xì)胞毒性作用，作用大小還需取決于具體的劑量和濃度，所以研究者應(yīng)思考清理根管的材料是否影響SHED的活性。另外，即使低劑量的錐形束CT（cone beam CT，CBCT）檢查也有潛在風(fēng)險，電離輻射會導(dǎo)致SHED的DNA損傷和持續(xù)的炎癥反應(yīng)[43]，這使得可行的判定療效的方法十分重要。除了SHED移植治療外，干細(xì)胞的外泌體作為干細(xì)胞發(fā)揮作用的重要介質(zhì)，可以發(fā)揮和干細(xì)胞相似的療效，從而作為一種無細(xì)胞治療策略為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供一種新的思路，SHED衍生的外泌體的無細(xì)胞治療可能也是一種理想的口腔組織再生與修復(fù)方式。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。