葉文斌，曹延龍，董 東，吳美麗，南旭陽，張 凱

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500；2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣742500；3.甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 天水 741000)

油橄欖(Oleaeuropaea)是著名的木本油料植物[1]，而隴南地區(qū)是全國油橄欖主要的生長區(qū)，也是全國最大的油橄欖種植栽培和橄欖油加工產(chǎn)區(qū)[1-2].在油橄欖鮮榨過程中會產(chǎn)生40%左右的果渣[3-5]，這些果渣長期得不到有效的利用，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6-7].油橄欖果渣中含有羥基酪醇、齊墩果酸、沒食子酸、原兒茶酸等多種活性物質(zhì)[8-9]，具有抗菌消炎、降血糖、降血脂、抗人類免疫缺陷病毒、抗腫瘤、清除自由基等多種藥理和生理功能[10-11]，具有開發(fā)為功能性食品的巨大潛力[12-14].另外，甘肅省隴南林區(qū)黃果槲寄生藥源充足，黃果槲寄生果實(shí)多糖是其主要的生物活性物質(zhì)和有效成分[15-16]，具有保肝和提高免疫力等多種生物功能[17-19].

隨著甘肅隴南油橄欖種植面積不斷擴(kuò)大、產(chǎn)量不斷增加，橄欖油加工廢棄物也將大量產(chǎn)生.為了減少資源浪費(fèi)和提高油橄欖果渣的再利用率，本文以隴南油橄欖果渣為研究對象，復(fù)配黃果槲寄生果實(shí)多糖，添加木糖醇、檸檬酸、氯化鈣和D-異抗壞血酸鈉等食品添加劑研制無糖果渣粉，并進(jìn)行安全和保健功能評價(jià)，以期為隴南地區(qū)油橄欖加工廢棄物的綜合利用與黃果槲寄生果實(shí)多糖的深入研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

油橄欖新鮮果渣由隴南市經(jīng)濟(jì)林研究院提供；小鼠(SPFKM)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，許可證號為SCXK(甘)2020-0002；黃果槲寄生果實(shí)多糖由隴南師范高等專科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院食品實(shí)驗(yàn)室提供，純度為99.65%.主要的實(shí)驗(yàn)試劑有硫酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、無水乙醇、葡萄糖、苯酚、鹽酸、蘆丁、硝酸鋁、亞硝酸鈉、醋酸鉀和石油醚等，均為分析純；木糖醇、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈣均為食品級.SOD、CAT、GSH-Px酶活性和MAD含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司.

主要的儀器設(shè)備有脂肪測定儀(上海新嘉電子有限公司，SZF-06A)、定氮儀(上海雙旭電子有限公司，KDN-08D)、粗纖維測定儀(上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，SLQ-6)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國熱電公司)、氨基酸分析儀(德國SYKAM公司，S-433D)、紫外-可見分光光度計(jì)(成都安恒達(dá)科技有限公司，UV2800)、氣相色譜儀(美國安捷倫公司，7890A)、冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-18N)、微量超細(xì)粉碎機(jī)(北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司，F(xiàn)DV-SS)、高效液相色譜儀(日本島津公司，Nexera LC-30A).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程與要點(diǎn) ① 工藝流程：隴南油橄欖果渣→烘干→過篩→粉碎→加入氯化鈉溶液→添加黃果槲寄生果實(shí)多糖粉末→添加木糖醇→添加檸檬酸→添加氯化鈣→添加D-異抗壞血酸鈉→添加麥芽糊精→攪拌冷凍干燥→裝瓶→封口→滅菌→冷卻→包裝.②工藝要點(diǎn)：將新鮮的隴南油橄欖果渣在50 ℃烘箱中干燥殺青，先過100目篩，后經(jīng)超微粉碎6 000目過篩成粉；添加0.1%的氯化鈉溶液在搖床中搖晃10 min，攪拌均勻，添加黃果槲寄生果實(shí)多糖粉末在搖床中搖晃10 min，攪拌均勻；再添加0.01%的氯化鈣和0.03%的D-異抗壞血酸鈉繼續(xù)搖晃攪拌10 min，最后添加0.01%的麥芽糊精搖晃攪拌10 min；待穩(wěn)定后迅速冷凍干燥，脫氣滅菌灌裝后于室溫陰涼干燥處保存.

1.2.2 隴南油橄欖無糖果渣粉單因素實(shí)驗(yàn) 將烘干過篩粉碎的隴南油橄欖果渣粉末，加入到用蒸餾水配制的質(zhì)量濃度為0.10%的氯化鈉溶液中，添加16%的木糖醇、0.18%的檸檬酸、0.25%的黃果槲寄生果實(shí)多糖、0.01%的氯化鈣和0.03%的D-異抗壞血酸鈉，開展無糖油橄欖果渣粉制備的單因素篩選.考慮果渣的顏色、光澤、粉質(zhì)狀態(tài)、溶解度、協(xié)效性和口感幾個(gè)因素進(jìn)行綜合感官評定；木糖醇的添加量以12%、14%、16%、18%和20%來進(jìn)行篩選，在其他條件不變的情況下，檸檬酸的添加量以0.14%、0.16%、0.18%、0.20%和0.22%來進(jìn)行篩選，黃果槲寄生果實(shí)多糖的添加量以0.15%、0.20%、0.25%、0.30%和0.35%來進(jìn)行篩選.

1.3 感官綜合評價(jià)與指標(biāo)測定

1.3.1 感官綜合評價(jià) 將制備好的無糖油橄欖果渣粉陰涼干燥放置7 d，邀請10名食品專業(yè)相關(guān)人員根據(jù)顏色、光澤、粉質(zhì)狀態(tài)、溶解度、協(xié)效性和口感進(jìn)行綜合感官評價(jià)，評價(jià)等級和標(biāo)準(zhǔn)參考李洪燕等[20]和蔡泓瀅等[21]的方法并修改，感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示.

1.3.2 指標(biāo)測定 依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，油橄欖果渣粉中水分含量采用GB 5009.3-2016中的干燥法測定，粗蛋白質(zhì)含量測定采用GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用GB 50095-2010中的索氏抽提法測定，灰分采用GB 5009.4-20中的高溫灼燒法測定，粗纖維含量采用GB/T 5009.10-2003中的重量法測定，果膠含量測定采用咔唑比色法，多糖含量采用苯酚硫酸法進(jìn)行測定，礦物質(zhì)含量測定采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法，多肽用雙縮脲法測定，總砷按照GB/T 5009.11中的銀鹽法測定，總鉛按照GB/T 5009.12中的石墨爐原子吸收光譜法測定，總鎘按照GB/T 5009.15-2014中的石墨爐原子吸收光譜法測定，總汞按照GB/T 5009.17-2014中的原子熒光光譜分析法測定，商業(yè)無菌條件按GB/T 4789.26中的方法測定，霉菌計(jì)數(shù)按GB/T 4789.15-2003中附錄A規(guī)定的方法測定，沙門氏菌按照GB 4789.4-2016中的方法測定，金黃色葡萄球菌按照GB 4789.10-2016中的方法測定.

表1 隴南油橄欖無糖果渣粉感官評價(jià)Tab.1 Sensory evaluation of candied fruit residue powder of Longnan olive

1.3.3 油橄欖無糖果渣粉對小鼠急慢性毒理實(shí)驗(yàn) 選取體重25～28 g的KM小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，后隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半.采用最大耐受劑量法，先取30只小鼠分別灌胃制備好的果渣粉，將果渣粉配成溶液，分別以20 000、25 000和30 000 mg/kg體重標(biāo)準(zhǔn)空腹一次性灌胃；后取10只小鼠以40 mL/kg體重標(biāo)準(zhǔn)灌胃生理鹽水作為急性毒理對照，灌胃后觀察其急性中毒癥狀、體征；對所有小鼠正常供給飼料和水，連續(xù)觀察7 d，檢測急性LD50等生理指標(biāo).再取10只小鼠灌胃制備好的果渣粉溶液，以400 mg/kg體重標(biāo)準(zhǔn)空腹灌胃；最后對剩余10只小鼠以5 mL/kg體重標(biāo)準(zhǔn)灌胃同等劑量的生理鹽水作為慢性毒理對照；所有小鼠連續(xù)灌胃90 d，飼料和水正常供給，觀察其慢性中毒癥狀、體征及生活情況，檢測90 d后的生理指標(biāo).小鼠急慢性毒理實(shí)驗(yàn)中血清SOD、CAT、GSH-Px酶活性和MAD含量全部用相應(yīng)試劑盒中的方法檢測.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用 SPSS17.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示顯著性，P<0.01表示極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)與綜合感官評價(jià)

木糖醇、檸檬酸和黃果槲寄生果實(shí)多糖添加量對隴南油橄欖無糖果渣粉的綜合感官評價(jià)由圖1所示.結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，無糖果渣粉的綜合感官評價(jià)分值隨著3種食品添加劑的添加量升高而逐漸增加；當(dāng)木糖醇、檸檬酸和黃果槲寄生果實(shí)多糖的添加量分別為16% 、0.18%和0.25%時(shí)，果渣的綜合感官評價(jià)分?jǐn)?shù)

圖1 不同添加量的木糖醇、檸檬酸和黃果槲寄生果實(shí)多糖對油橄欖無糖果渣粉感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect ofxylitol,citric acil and Viscum coloratum fruit polysaccharides of different addition on sensory quality of olive sugar-free pomace

最高，分別達(dá)到了93.36分、94.85分和93.49分.木糖醇添加量為14%和18%、檸檬酸添加量為0.16%和0.20%、黃果槲寄生果實(shí)多糖添加量為0.30%和0.35%時(shí)，果渣的綜合感官評價(jià)分?jǐn)?shù)都有所降低.根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)分析，選擇添加量為14%、16%和18%的木糖醇、0.16%、0.18%和0.20%的檸檬酸以及0.20%、0.25%和0.30%黃果槲寄生果實(shí)多糖做后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，來優(yōu)化無糖果渣粉加工工藝.

表2 響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工藝因素與水平Tab.2 Factors and levels of Box-Behnken design

2.2 油橄欖無糖果渣粉Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇油橄欖無糖果渣粉感官評價(jià)的單因素實(shí)驗(yàn)所確定的木糖醇添加量(A)、檸檬酸添加量(B)和黃果槲寄生果實(shí)多糖添加量(C)3個(gè)因素為自變量，以1、0、-1表示自變量的高低水平，以果渣粉的綜合感官評分為響應(yīng)值[22]，開展3因素3水平的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化加工工藝.實(shí)驗(yàn)因素和水平見表2，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和表4所示.

表3 油橄欖無糖果渣粉響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Technological Box-Behnken design and experimental results of olive sugar-free pomace

表4 油橄欖無糖果渣粉工藝條件響應(yīng)面模型及方差分析Tab.4 Response surface and ANVOA analysis of olive sugar-free pomace

油橄欖無糖果渣粉響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所涉及的3個(gè)因子的響應(yīng)面回歸模型方程為：

Y=92.38+4.29A-1.89B+1.55C-3.29AB+2.87AC-4.52BC-4.98A2-3.68B2-4.87C2.

表5 油橄欖無糖果渣粉營養(yǎng)成分和質(zhì)量指標(biāo)Tab.5 Nutritional composition quality index of olive sugar-free pomace

2.3指標(biāo)測定

按照最佳優(yōu)化工藝參數(shù)制備的油橄欖無糖果渣粉細(xì)膩均勻一致，香味協(xié)調(diào)風(fēng)味獨(dú)特.對果渣粉進(jìn)行理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)檢測，結(jié)果如表5、表6所示.各項(xiàng)指標(biāo)均符合果粉的國標(biāo)要求，未檢出致病菌，重金屬含量<0.05mg/kg.

表6 油橄欖無糖果渣粉微生物指標(biāo)Tab.6 Microbiological index of olive sugar-free pomace

在優(yōu)化的配方中用木糖醇作為甜味劑，不但豐富了營養(yǎng)成分，還使產(chǎn)品適用于糖尿病患者[23-24]；添加檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉，既可以增加立體的酸味感覺，又能提高保存時(shí)間，阻止氧化酸敗，穩(wěn)定產(chǎn)品的顏色[23-25]；添加氯化鈣可以強(qiáng)化果渣粉的均一性[23-26]；添加黃果槲寄生果實(shí)多糖不但增添了產(chǎn)品的保健功能[13-14]，還能增添口感的層次性.

2.4 油橄欖無糖果渣對小鼠急慢性毒理實(shí)驗(yàn)

隴南油橄欖無糖果渣粉小鼠口服(灌胃)急性毒理實(shí)驗(yàn)中，按照表7所示劑量一次性灌服，灌胃后籠邊觀察7d，小鼠外觀毛色正常，無竄動(dòng)、扭體等異常反應(yīng)，攝食和大小便均無異常，小鼠活動(dòng)自如.7d后對小鼠

表7 油橄欖無糖果渣粉對小鼠急慢性毒理生理指標(biāo)的影響Tab.7 Effects of olive sugar-free pomace on acute chronic toxicological and physiological indexes in mice

進(jìn)行頸椎脫臼處死，進(jìn)行重要臟器病理檢查，沒有出現(xiàn)明顯病理變化.生理鹽水對照組小鼠體重稍高于油橄欖無糖果渣粉灌胃組，但無顯著性差異(P>0.05)；生理鹽水組小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量均稍低于油橄欖無糖果渣粉組.急性毒性實(shí)驗(yàn)中，除劑量30 000mg/kg的果渣粉組體重和生理鹽水組小鼠相比有顯著性差異之外，其余2組無糖果渣粉組(劑量20 000mg/kg和25 000mg/kg)體重與生理鹽水組小鼠相比均無顯著性差異(P>0.05)，說明油橄欖無糖果渣粉對小鼠體重和生化指標(biāo)影響不大.根據(jù)毒理學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，LD50>10 000mg/kg體重，屬于急性無毒性物質(zhì).

慢性毒理實(shí)驗(yàn)中，小鼠灌胃90d后檢測小鼠體重，發(fā)現(xiàn)2組小鼠體重都隨著時(shí)間而增長，但生理鹽水組小鼠體重均明顯低于油橄欖無糖果渣粉組，而且二者之間存在極顯著差異(P<0.01).經(jīng)檢測，生理鹽水組小鼠血清中SOD、CAT和GSH-Px活性均低于油橄欖無糖果渣粉組，而且2組之間差異極顯著(P<0.01)；另外，檢測發(fā)現(xiàn)生理鹽水組小鼠體內(nèi)血清中的MDA含量顯著高于油橄欖無糖果渣粉組(P<0.01).結(jié)果說明油橄欖無糖果渣粉不但屬于慢性無毒性物質(zhì)，還具有一定的減小體重、提高抗氧化能力的作用.

3 結(jié)論

以隴南油橄欖加工廢棄物果渣為材料復(fù)配黃果槲寄生果實(shí)多糖，添加木糖醇、檸檬酸、氯化鈣和D-異抗壞血酸鈉等食品添加劑研制無糖果渣粉.根據(jù)感官評分，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；結(jié)果表明優(yōu)化配方是木糖醇、檸檬酸和黃果槲寄生果實(shí)多糖添加量分別為16%、0.18%和0.25%，同時(shí)添加0.01%的氯化鈣和0.03%的D-異抗壞血酸鈉.通過優(yōu)化配方制備的油橄欖無糖果渣粉，實(shí)際測得感官評分與模型預(yù)測值相近；經(jīng)檢測，重金屬含量小于國家安全標(biāo)準(zhǔn)(<0.05mg/kg)，且未檢出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等致病菌，大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家安全標(biāo)準(zhǔn).用制備的無糖果渣粉對小鼠一次性灌胃20 000、25 000和30 000mg/kg觀察7d，并以400mg/kg標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)灌胃小鼠90d，分別作為急慢性毒理實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明制備的無糖果渣粉無急慢性毒理作用，但有很好的抗氧化能力，還能有效降低小鼠體重，說明制備的產(chǎn)品具有一定的應(yīng)用前景.