周貴華，梅 邢，程 超

(湖北民族大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，湖北 恩施 445000)

藻藍(lán)蛋白(phycocyanin)是一種天然色素蛋白[1]，具有抗氧化[2]、抗癌[3]、抗炎[4]、增強(qiáng)免疫力[5]等生物活性.藻藍(lán)蛋白是包含α和β 2個亞基的聚合體，而α和β亞基是由脫輔基蛋白和藻膽素以硫醚鍵共價連接而成的，藻藍(lán)蛋白的純度通常以溶液Amax/A280的比值來評估[6].有研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白的色基丟失或者脫輔基蛋白結(jié)構(gòu)改變會影響藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性[7-9]，但尚不明確藻藍(lán)蛋白的色基和脫輔基蛋白對其抗氧化活性哪個影響較大.

抗氧化動力學(xué)反映了反應(yīng)速率與影響因素間的函數(shù)關(guān)系，可定量表示抗氧化劑抗氧化效果隨時間的變化規(guī)律，對深入探究抗氧化劑的作用機(jī)理有重要意義[10].陳凌等[11]發(fā)現(xiàn)干制馬齒莧多糖的抗氧化反應(yīng)接近一級反應(yīng)動力學(xué)方程.李慧卿等[12]發(fā)現(xiàn)浸提與蒸餾毛建草精油清除DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazy)反應(yīng)接近二級反應(yīng)動力學(xué)方程.劉璐等[13]探究不同溫度下番茄紅素對核桃油抗氧化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)核桃油的氧化速率與溫度和番茄紅素添加量均有關(guān)，其核桃油的Ln K與1/T之間為線性關(guān)系，符合阿倫尼烏斯動力學(xué)模型.劉曉庚等[14]發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素清除DPPH的變化規(guī)律符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型.但目前未見色素蛋白類的抗氧化動力學(xué)報道，因此本文以典型的色素蛋白藻藍(lán)蛋白為研究對象，系統(tǒng)測定其清除自由基的反應(yīng)動力學(xué)特征.

目前體外抗氧化活性測定方法主要有：ABTS陽離子自由基法[15]、DPPH法[16]、鄰苯三酚自氧化法[17]、氧自由基吸收能力法[18]、鐵離子總還原法[19]等.DPPH法由于其親脂性，在水溶性試樣的抗氧化研究中有局限性；氧自由基吸收能力法耗時相對較長；鐵離子總還原法檢測時間很短，不適合同時測定多種試樣；鄰苯三酚自氧化體系則存在檢測波長、緩沖液組成及pH值等外部因素顯著影響檢測結(jié)果、且檢測時間較短等缺陷；相比之下ABTS陽離子自由基法簡單便捷、靈敏度高，是目前常用的抗氧化活性測定方法之一.鑒于此，重點(diǎn)研究5種不同純度的藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基能力的差異，進(jìn)而建立抗氧化動力學(xué)模型，確定藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基反應(yīng)的速率常數(shù)與藻藍(lán)蛋白的純度、色基和蛋白質(zhì)含量的關(guān)系，從而為藻藍(lán)蛋白抗氧化活性的相關(guān)研究提供新的數(shù)據(jù)資料.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藻藍(lán)蛋白A、B分別購于韻樂生物科技有限公司、化成工業(yè)株式會社；藻藍(lán)蛋白E、F購于安欣祿生物科技有限公司；藻藍(lán)蛋白C是湖北民族大學(xué)食品科學(xué)與工程實驗室自制；除藻藍(lán)蛋白C由葛仙米提取，其余4種藻藍(lán)蛋白均源于螺旋藻.過硫酸鉀為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS為分析純，購于東京化成工業(yè)株式會社.

1.2 實驗儀器

主要儀器包括紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司，UV-9000S)、酶標(biāo)儀(帝肯貿(mào)易有限公司，Infinite200pro).

1.3 實驗方法

1.3.1 5種藻藍(lán)蛋白色基、純度和蛋白質(zhì)含量 分別稱取5種藻藍(lán)蛋白100 mg，避光用蒸餾水配制成1 mg/mL溶液，在250～750 nm進(jìn)行光譜掃描，藻藍(lán)蛋白色基和蛋白質(zhì)含量分別用可見光區(qū)最大吸收峰吸光度值A(chǔ)max和280 nm蛋白質(zhì)特征吸收峰吸光度值A(chǔ)280表示，純度為藻藍(lán)蛋白溶液Amax與A280之比(Amax/A280)[20].

1.3.2 ABTS陽離子自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照文獻(xiàn)[21]，ABTS陽離子自由基工作液配制方法：7 mmol/L的ABTS溶液5 mL與140 mmol/L過硫酸鉀溶液88 μL混合均勻后靜置12 h.用蒸餾水將工作液配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mmol/L的ABTS陽離子自由基溶液，測定其734 nm吸光度值，將ABTS陽離子自由基濃度作為橫坐標(biāo)，734 nm的吸光度值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.915 2x-0.002 3，R2=0.999 6.

1.3.3 5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的反應(yīng)動力學(xué) 按照1.3.1的方法將藻藍(lán)蛋白C配置成0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 mg/mL的溶液，其余4種藻藍(lán)蛋白配置成1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL的溶液，分別與ABTS陽離子自由基工作液以1∶4比例混合，旋渦振蕩混勻后立即用酶標(biāo)儀在734 nm處按1 次/s的頻率測定吸光度值，連續(xù)記錄其在360 s內(nèi)的吸光度值A(chǔ)x，并用蒸餾水為對照組，記錄吸光度值A(chǔ)1，按照式(1)計算藻藍(lán)蛋白的清除率，并繪制5種藻藍(lán)蛋白隨時間延長對ABTS陽離子自由基清除率反應(yīng)的曲線[22-23].

(1)

式(1)中：a表示ABTS陽離子自由基清除率(%)；Ax是樣品組的吸光度值；A1是對照組的吸光度值；A0=0.70±0.02.

根據(jù)藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的時間效應(yīng)曲線，按式(2)建立反應(yīng)動力學(xué)模型[24-25].

(2)

因此，準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)方程式分別為式(3)和式(4).

ln(1-a)=-k1t，

(3)

(4)

由于St=S0×(1-a)，因此式(4)可以轉(zhuǎn)換成式(5).

(5)

式中：St是tmin時ABTS陽離子自由基濃度(mmol/L)；S0為0 min時ABTS陽離子自由基濃度(mmol/L)；A是ABTS陽離子自由基剩余率(%)；k1為擬一級反應(yīng)速度常數(shù)(min-1)；k2為擬二級反應(yīng)速率常數(shù)(mmol·L-1·min-1).

表1 5種藻藍(lán)蛋白的紫外掃描圖譜及蛋白質(zhì)、色基和純度Tab.1 The ultraviolet scanning and chromophore,proteins,purity of five phycocyanins

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，利用Origin 2018軟件作圖并進(jìn)行擬合.

2 結(jié)果與分析

2.1 5種藻藍(lán)蛋白的紫外-可見光譜分析

5種藻藍(lán)蛋白色基、蛋白質(zhì)的特征吸收峰及其紫外掃描光譜結(jié)果如表1所示.由表1中紫外掃描圖譜可知，藻藍(lán)蛋白C的可見光區(qū)的最大吸收峰為620 nm，其他4種藻藍(lán)蛋白溶液的可見光區(qū)的最大吸收峰在614～618 nm，產(chǎn)生差異的主要原因可能是樣品C源于藍(lán)藻葛仙米，其他4種源于藍(lán)藻螺旋藻.樣品C除了620 nm波長附近有吸收峰外，在559 nm左右還有一個微弱吸收峰，結(jié)合文獻(xiàn)[26]判斷藻藍(lán)蛋白C可能為R-藻藍(lán)蛋白，其他4 種為C-藻藍(lán)蛋白.

藻藍(lán)蛋白色基含量以可見光區(qū)最大吸收波長的吸光度值表示(Amax)，蛋白質(zhì)含量以280 nm吸光度值表示(A280).由表1可知：5種藻藍(lán)蛋白純度為A>B>F>E>C，蛋白質(zhì)含量即A280：C>E>F>B>A，色基含量即Amax：E>A>F>B>C.

2.2 5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的劑量時間效應(yīng)關(guān)系

5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的劑量時間效應(yīng)曲線如圖1所示.由圖1可以看出，5種藻藍(lán)蛋白對ABTS陽離子自由基清除能力隨反應(yīng)時間的延長均增強(qiáng)，但不同質(zhì)量濃度的不同藻藍(lán)蛋白的時間劑量效應(yīng)關(guān)系存在一定的差異.由于藻藍(lán)蛋白C對ABTS陽離子自由基的清除效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他4種，因此實驗過程中藻藍(lán)蛋白A、B、E、F選擇0.2～1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度，而藻藍(lán)蛋白C選擇0.1～0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度.在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基具有劑量效應(yīng)關(guān)系，其中藻藍(lán)蛋白A最高清除率達(dá)82.3%，藻藍(lán)蛋白E和F的清除效果劣于其他3種藻藍(lán)蛋白.另外，低質(zhì)量濃度的藻藍(lán)蛋白溶液對ABTS陽離子自由基清除反應(yīng)約在60～120 s內(nèi)達(dá)到平衡，隨著質(zhì)量濃度增加，藻藍(lán)蛋白清除速度達(dá)到平衡的時間逐漸延長.可能是因為藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基無選擇性，當(dāng)藻藍(lán)蛋白在低質(zhì)量濃度時，含有的抗氧化基團(tuán)有限，但ABTS陽離子自由基很充足，ABTS陽離子自由基與藻藍(lán)蛋白抗氧化基團(tuán)快速結(jié)合達(dá)到平衡；相反，當(dāng)藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度較高時，ABTS陽離子自由基和抗氧化基團(tuán)均很充足，所以結(jié)合需要一定的時間，這也可能是1.0 mg/mL的藻藍(lán)蛋白B清除ABTS自由基初始清除率有輕微下降的原因.

圖1 5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的劑量時間效應(yīng)關(guān)系Fig.1 Dose-time-effect relationship for the scavenging on ABTS+·of five phycocyanins

圖2 5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)方程Fig.2 Pseudo first order reaction kinetic equation for the scavenging on ABTS+·of five phycocyanins

2.3 5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的反應(yīng)動力學(xué)

為探討藻藍(lán)蛋白抗氧化能力隨質(zhì)量濃度和反應(yīng)時間的變化規(guī)律，根據(jù)式(3)建立準(zhǔn)一級動力學(xué)模型，擬合5種不同質(zhì)量濃度藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)方程和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示.同理根據(jù)式(4)建立準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)模型，擬合5種不同質(zhì)量濃度藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)方程和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示.

圖3 5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)方程Fig.3 Pseudo second order reaction kinetic equation for the scavenging on ABTS+·of five phycocyanins

表2 5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基動力學(xué)擬合方程及相關(guān)系數(shù)Tab.2 Kinetic fitting equations and correlation coefficients of five phycocyanins scavenging ABTS+·

準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)模型的擬合方程、相關(guān)系數(shù)及速率常數(shù)如表2所示.由表2可知，R2=0.994 1是準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)擬合中最高的相關(guān)系數(shù)，而R2=0.998 1是準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)擬合中最高相關(guān)系數(shù)，且所有準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)擬合方程中的相關(guān)系數(shù)均比準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)的相關(guān)系數(shù)高，說明5種藻藍(lán)蛋白對ABTS陽離子自由基清除率，隨時間的變化規(guī)律均符合準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)模型，且準(zhǔn)二級動力學(xué)模型擬合效果更優(yōu)，即準(zhǔn)二級動力學(xué)模型能更好地定量描述藻藍(lán)蛋白對ABTS陽離子自由基的清除作用隨時間的變化關(guān)系.

表3 反應(yīng)速率常數(shù)與藻藍(lán)蛋白色基、蛋白質(zhì)含量、純度相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between reaction rate constant and phycocyanin chromophore,protein content and purity

利用SPSS軟件對表2反應(yīng)速率常數(shù)k1、k2與表1中藻藍(lán)蛋白的色基含量、蛋白質(zhì)含量及純度進(jìn)行偏相關(guān)分析，結(jié)果如表3所示.由表3可以看出，在0.01水平上，藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級的反應(yīng)速率常數(shù)k1、k2既與蛋白質(zhì)含量又與純度呈顯著正相關(guān)，但色基與其相關(guān)性不強(qiáng)或顯著負(fù)相關(guān)，說明藻藍(lán)蛋白在ABTS陽離子自由基體外抗氧化中，藻藍(lán)蛋白的蛋白質(zhì)可能是發(fā)揮抗氧化作用的主要部分，這與梅邢等[26]的報道一致.

3 結(jié)論

以5種不同的藻藍(lán)蛋白為原料，初步探究了5種不同藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基隨時間的變化規(guī)律，建立不同質(zhì)量濃度藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基反應(yīng)動力學(xué)模型，并分析其反應(yīng)動力學(xué)的反應(yīng)速率常數(shù)與藻藍(lán)蛋白的純度、色基含量和蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性.結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基具有劑量時間效應(yīng)關(guān)系，即隨著藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度的增加和時間延長清除率升高；隨著時間的延長，5種藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的能力均增加，但反應(yīng)達(dá)到平衡的時間有差異，藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的時間變化規(guī)律更適合用準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)方程描述；此外在ABTS抗氧化體系中，藻藍(lán)蛋白中蛋白質(zhì)含量和純度越高時，準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級的反應(yīng)速率常數(shù)也越大.但不同藻藍(lán)蛋白清除ABTS陽離子自由基的具體機(jī)理仍有待于進(jìn)一步探討.