陳臣 黃芝陽(yáng) 于海燕 袁海彬 田懷香

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

繼Francois Jacob和Jacques Monod在操縱子學(xué)說(shuō)中提出基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的概念之后，科學(xué)家開(kāi)始意識(shí)到轉(zhuǎn)錄調(diào)控在原核生物調(diào)控中的重要性。1995年實(shí)現(xiàn)了第一個(gè)原核生物的全基因組測(cè)序［1］，隨著測(cè)序技術(shù)不斷地進(jìn)步，大量完整的基因組序列快速出現(xiàn)［2-3］，尤其是人類(lèi)基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，使得研究的焦點(diǎn)由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)過(guò)渡為功能基因組學(xué)［4］，而基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控正是功能基因組學(xué)的一個(gè)重要內(nèi)容。

基因的調(diào)控可在多個(gè)層次上進(jìn)行，包括基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平的調(diào)控。與真核生物相比，原核生物的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，根據(jù)調(diào)控機(jī)制的不同可分為負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由于調(diào)控的關(guān)鍵步驟主要是在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄階段，所以對(duì)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄進(jìn)行研究具有重要的意義。啟動(dòng)子附近存在一段特定序列能夠結(jié)合稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）的蛋白質(zhì)，結(jié)合RNA聚合酶并由此起始基因轉(zhuǎn)錄［5］，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)細(xì)菌中的基因表達(dá)方面起核心作用，它通過(guò)與位于啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)（transcription factor binding sites，TFBSs）相結(jié)合，從而激活或抑制相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。歷史上，研究最多的轉(zhuǎn)錄因子之一是大腸桿菌（Escherichia coli）的乳糖阻遏蛋白［6］。近年來(lái)，在解析微生物生理功能或某些功能成分生物合成研究中的轉(zhuǎn)錄因子不斷被挖掘，轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)合位點(diǎn)及其調(diào)控方式已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。大量研究表明，找到這些特定的片段和位點(diǎn)對(duì)于研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有重要的意義，有助于進(jìn)一步揭開(kāi)蛋白質(zhì)與核酸相互作用的規(guī)律，了解原核生物的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。隨著分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)研究不斷發(fā)展與完善，一些新的方法應(yīng)運(yùn)而生，為闡明原核生物的基因調(diào)控提供了有力的工具。通過(guò)改造原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)整代謝流向構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠(chǎng)，更好發(fā)揮原核生物作為生產(chǎn)宿主的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于突破傳統(tǒng)代謝工程方法改變細(xì)胞表型及提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量等方面具有廣闊的前景［7］。

本文主要綜述了有關(guān)原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控中核酸-蛋白質(zhì)相互作用現(xiàn)有的一些研究技術(shù)，包括凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、DNase I footprinting技術(shù)、染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）技術(shù)、微量熱泳動(dòng)技術(shù)（MicroScale Thermophoresis，MST）、等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）及細(xì)菌單雜交系統(tǒng)（bacterial-one-hybrid system，B1H），分別從6種方法的原理、應(yīng)用和優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行介紹（表1），并展望了未來(lái)的研究熱點(diǎn)，為進(jìn)一步闡明原核生物的基因調(diào)控提供借鑒。

表1 原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究技術(shù)總結(jié)Table 1 Summary of research techniques on transcriptional regulation in prokaryotes

1 凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）

1.1 EMSA基本原理

EMSA是一種在體外研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用的簡(jiǎn)單、廉價(jià)、快速而靈敏的技術(shù)，它可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白與核酸作用的定性和定量分析［8，17］，此外，還可用于熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的定量測(cè)量以及構(gòu)象變化的分析［18］。EMSA的作用原理為（圖1）：通常是將寡核苷酸標(biāo)記的DNA或RNA探針與DNA特異結(jié)合蛋白或RNA一同孵育，隨后通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（non denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）分離蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物與游離的探針。由于目的蛋白與核酸探針結(jié)合后分子量增大，故其電泳遷移率會(huì)降低，在凝膠中將會(huì)看到阻滯的條帶［17］。其電泳遷移率是生物分子的固有物理性質(zhì)，與生物大分子大小、電荷和分離介質(zhì)的粘度有關(guān)［19］。根據(jù)所顯示滯后帶的有無(wú)和量的多少，來(lái)反映DNA結(jié)合蛋白與DNA探針的結(jié)合活性和特異性，并可以計(jì)算出兩者的結(jié)合常數(shù)或解離常數(shù)。

圖1 EMSA實(shí)驗(yàn)的基本原理Fig.1 Basic principle of EMSA experiment

1.2 EMSA鑒定轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-結(jié)合位點(diǎn)直接相互作用及適用性分析

EMSA實(shí)驗(yàn)有許多優(yōu)點(diǎn)，傳統(tǒng)的EMSA實(shí)驗(yàn)一般采用放射性同位素（32P）標(biāo)記核酸探針，其基本操作技術(shù)簡(jiǎn)單，靈敏度高，研究表明，即使待測(cè)樣品的濃度≤0.1 nmol/L，樣品的體積≤20 μL也可進(jìn)行測(cè)定［8］。但是同位素的半衰期短，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，對(duì)人體及環(huán)境均會(huì)產(chǎn)生危害且處理成本高［20］。因此許多研究者對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，出現(xiàn)了采用生物素或地高辛標(biāo)記的核酸探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)的放射性同位素標(biāo)記的探針，利用堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)［21］。例如葛興楓等［22］利用經(jīng)蛋白酶K消化步驟優(yōu)化的生物素標(biāo)記的EMSA方法，也可明顯觀察到核酸適配體與靶蛋白結(jié)合的阻滯條帶，與同位素標(biāo)記的EMSA實(shí)驗(yàn)無(wú)明顯差異。此外這兩種方法安全、成本低且檢測(cè)時(shí)間短。然而Vavrova等［20］研究表明，網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)體外翻譯蛋白質(zhì)不適用于非放射性EMSA，因?yàn)榫W(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中存在干擾的生物素化蛋白質(zhì)；Tokunaga等［23］也發(fā)現(xiàn)在使用地高辛標(biāo)記的探針檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)程中陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)存在相當(dāng)大的非特異性變化帶的問(wèn)題，影響目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。另一個(gè)限制因素是電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)與核酸的復(fù)合物處于非化學(xué)平衡狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合作用可能被減弱，同時(shí)某些絡(luò)合物在凝膠中的穩(wěn)定性顯著高于溶液環(huán)境，使得轉(zhuǎn)錄因子與DNA的親和力檢測(cè)結(jié)果偏低，或是EMSA實(shí)驗(yàn)對(duì)某些相互作用分子的研究效果不佳［8，24］。

EMSA實(shí)驗(yàn)的主要應(yīng)用之一是鑒定轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合蛋白的作用位點(diǎn)，Brown等［25］在研究德氏乳桿菌乳酸亞種CRL581（Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis CRL 581）中與蛋白水解系統(tǒng)相關(guān)的基因時(shí)，通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YebC與蛋白水解酶系統(tǒng)相關(guān)基因prtL、oppA1和opts啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，表明YebC是關(guān)鍵蛋白水解酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。王麗濱［26］利用EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了碳代謝調(diào)控蛋白A（catabolite control protein A，CcpA）與肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）莢膜多糖基因座轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的結(jié)合，為研究肺炎鏈球菌的致病機(jī)理及防治提供了理論依據(jù)。本課題組研究植物乳桿菌CcpA對(duì)碳分解代謝抑制作用（carbon catabolite repression，CCR）的調(diào)控作用時(shí)，通過(guò)EMSA證實(shí)CcpA與分解代謝反應(yīng)元件（catabolite responsive element，cre）位點(diǎn)的結(jié)合［27］。

EMSA是一項(xiàng)較為成熟的研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，可獲得蛋白質(zhì)-核酸相互作用的親和力、特異性、動(dòng)力學(xué)特性及最小結(jié)合位點(diǎn)。EMSA的優(yōu)點(diǎn)是可以分析與核酸結(jié)合的多個(gè)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體，但EMSA在體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)不能精確揭示體內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA的相互作用，轉(zhuǎn)錄因子需要通過(guò)硫酸銨分步沉淀、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析等技術(shù)進(jìn)行一定程度的純化，增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性。此外有許多變量只能通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定，要根據(jù)具體相互作用的物質(zhì)調(diào)整反應(yīng)條件和凝膠運(yùn)行條件，核酸靶標(biāo)、結(jié)合反應(yīng)的條件以及凝膠電泳的條件是實(shí)驗(yàn)優(yōu)化主要考慮的因素［28］。

2 DNase I footprinting技術(shù)

2.1 DNase I footprinting基本原理

DNase I footprinting技術(shù)是用于體外研究蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合位點(diǎn)的方法。它的原理是（圖2）：首先對(duì)待測(cè)雙鏈DNA片段中一條鏈的一端選擇性地進(jìn)行標(biāo)記，再加入適當(dāng)濃度的脫氧核糖核酸酶I（DNase I），在DNA雙鏈上形成缺口，經(jīng)過(guò)變性后聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影，即形成以相差一個(gè)核苷酸為梯度的DNA條帶［29］。但當(dāng)DNA片段與相應(yīng)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后，DNA結(jié)合蛋白可局部抑制DNase I對(duì)相應(yīng)DNA片段的消化，因此在放射自顯影圖譜上，DNA梯度條帶在結(jié)合區(qū)域中斷，從而形成一空白區(qū)域，恰似蛋白質(zhì)在DNA片段上留下的足跡，根據(jù)其放射自顯影呈現(xiàn)的結(jié)果把這種研究DNA-蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的方法形象地稱(chēng)為足跡法。如果要得出與目的蛋白特異性結(jié)合的堿基序列，可以進(jìn)一步對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過(guò)40余年的發(fā)展DNase I footprinting技術(shù)不斷得到完善，包括：（1）對(duì)雙鏈DNA片段其中一條鏈進(jìn)行標(biāo)記時(shí)采用生物素進(jìn)行末端標(biāo)記，避免放射性同位素的摻入，減少危害；（2）可利用固定相磁珠對(duì)傳統(tǒng)DNase I footprinting技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，在獲取特異性DNA結(jié)合蛋白時(shí)省略了硫酸銨分步沉淀、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等蛋白純化步驟，可適用于未經(jīng)純化的蛋白粗提物內(nèi)特異性DNA結(jié)合蛋白的研究，與傳統(tǒng)方法相比具有操作簡(jiǎn)便、效率高、使用范圍更廣泛等顯著優(yōu)勢(shì)［30］。

圖2 DNase I footprinting技術(shù)基本原理Fig.2 Basic principle of DNase I footprint technology

2.2 DNase I footprinting獲取結(jié)合位點(diǎn)及適用性分析

DNase I footprinting技術(shù)在研究生物體轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有廣泛的應(yīng)用，常用來(lái)得到對(duì)某個(gè)確定基因具有調(diào)控作用的調(diào)控因子在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。Gong等［31］研究短鏈乳桿菌（Lactobacillus brevis）GlnR對(duì)谷氨酸依賴(lài)的耐受性的調(diào)節(jié)作用，為確定GadR基因和gadCB操縱子的GlnR結(jié)合位點(diǎn)，用6-羧基熒光素（6-FAM）標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行DNase I footprinting分析發(fā)現(xiàn)了PgadR’和PgadCB’分別和GInR的結(jié)合序列。Ihara等［32］研究大腸桿菌在L-丙氨酸積累后，編碼一種L-丙氨酸輸出蛋白的alaE基因的表達(dá)受到氮代謝全局調(diào)控因子亮氨酸反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（LRP）的正向調(diào)控，為進(jìn)一步識(shí)別LRP的結(jié)合位點(diǎn)采用了DNase I footprinting技術(shù)找出LRP與alaE上游區(qū)域-161- -83 bp的核苷酸序列結(jié)合。較多情況下轉(zhuǎn)錄因子與受到調(diào)控作用的基因存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，DNase I footprinting技術(shù)能找出位于同一片段不連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)并獲得各自的結(jié)合序列。Yang等［33］研究植物乳桿菌（Lactobacillus pl-antarum）在高濃度乙醇環(huán)境下的強(qiáng)適應(yīng)性發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)因子AcrR與編碼3-羥基?；?ACP脫水酶（FabZ1）基因的啟動(dòng)子PFabZ1結(jié)合調(diào)控FabZ1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，利用DNase I footprinting技術(shù)獲得PFabZ1上兩個(gè)特異的AcrR結(jié)合位點(diǎn)。

與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究技術(shù)相比，DNase I footprinting技術(shù)不僅證實(shí)了DNA序列與目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，還可以得出調(diào)控因子與DNA調(diào)控元件特異性結(jié)合的DNA序列，為研究生物體轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了極大的便利。DNase I footprinting也可用于研究EMSA技術(shù)表現(xiàn)不佳的轉(zhuǎn)錄因子，例如一種相對(duì)低親和力的DNA結(jié)合蛋白xUBF在DNase I footprinting分析中取得比EMSA更好的效果［13］。但在進(jìn)行DNase I footprinting分析時(shí)要有足夠多的蛋白質(zhì)才能產(chǎn)生清晰的足跡，而蛋白質(zhì)含量增加要求DNase I濃度也要相應(yīng)升高，由于DNase I本身是一種蛋白，也可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在相應(yīng)的位點(diǎn)干擾蛋白質(zhì)結(jié)合靶基因出現(xiàn)假陽(yáng)性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，所以實(shí)驗(yàn)前必須仔細(xì)滴定DNase I濃度［34］。

3 染色質(zhì)-免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）

3.1 ChIP基本原理

ChIP技術(shù)是研究蛋白質(zhì)和基因組DNA特定區(qū)域相互作用一種有效的方法［35］，是用于評(píng)估蛋白質(zhì)與體內(nèi)特定DNA區(qū)域結(jié)合的多用途技術(shù)。1993年，在果蠅的培養(yǎng)細(xì)胞中，Polycomb阻遏蛋白是第一個(gè)使用ChIP技術(shù)進(jìn)行定位的蛋白質(zhì)，為了解其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)［36］。ChIP技術(shù)是一個(gè)多步驟的過(guò)程，每個(gè)步驟都需要標(biāo)準(zhǔn)化以獲得最佳結(jié)果。其作用原理為（圖3）［37］：通常是在生理狀態(tài)下將細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起［37］，通過(guò)機(jī)械或酶消化將染色質(zhì)碎片化后，用目的蛋白的特異性抗體免疫沉淀富集DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)復(fù)合體［38］，只有與目的蛋白結(jié)合的DNA才能被沉淀下來(lái)，獲得目的蛋白結(jié)合的DNA后，通過(guò)PCR、芯片和測(cè)序技術(shù)等，以定量檢測(cè)特定的DNA靶標(biāo)［15］。ChIP技術(shù)可用于分析轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔因子、DNA復(fù)制因子和DNA修復(fù)蛋白的結(jié)合［39］，是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA相互作用的重要技術(shù)。

圖3 ChIP實(shí)驗(yàn)的基本原理Fig.3 Basic principle of ChIP experiment

3.2 ChIP篩選結(jié)合位點(diǎn)及適用性分析

最初，ChIP技術(shù)用于研究高乙酰化組蛋白與特定DNA序列的結(jié)合，以進(jìn)一步了解組蛋白乙?；谵D(zhuǎn)錄中的作用［40］。近年來(lái)，為確定轉(zhuǎn)錄因子在基因組內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)并監(jiān)測(cè)其分布的動(dòng)態(tài)變化，開(kāi)發(fā)了與芯片雜交結(jié)合的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP-chip），并且已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于鑒定真核生物基因組上DNA結(jié)合蛋白的位置［41］，研究表明此方法也可用于原核生物。Ratib等［42］利用ChIP-chip技術(shù)先在體內(nèi)交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物再與基因芯片雜交檢測(cè)到ChvI蛋白除EMSA實(shí)驗(yàn)獲得的其他結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)ChIP-chip技術(shù)獲得了較其他體外檢測(cè)方法更多的與ChvI蛋白直接結(jié)合的靶基因。Yun等［43］利用ChIP-chip技術(shù)篩選惡臭假單胞菌KT2440（Pseudomonas putida KT2440）基因組中調(diào)控因子Pmr、TurA和TurB的結(jié)合區(qū)域。

ChIP與高通量測(cè)序相結(jié)合（ChIP-seq）是體內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA相互作用的全基因組分析的有力工具?；驹硎窍全@得與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子特異性結(jié)合的DNA片段，再通過(guò)測(cè)序技術(shù)確定其基因序列。近年來(lái)，ChIP-seq逐漸超越了ChIP-chip，越來(lái)越多地應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中。Shao等［44］在研究囊性纖維化患者的條件致病菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）內(nèi)一種全局調(diào)控因子RpoN對(duì)銅綠假單胞菌一組毒力因子和群體感應(yīng)基因的作用，利用ChIP-seq鑒定了RpoN的1 068個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)EMSA等技術(shù)證實(shí)它們之間存在特異性結(jié)合作用。2012年，Bard等［45］通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄因子EVI1靶向序列的特征，發(fā)現(xiàn)在EVI1的ChIP-seq峰附近常常伴隨有低聚果糖結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)ChIP-seq和芯片技術(shù)證實(shí)FOS是EVI1的相互作用分子。本課題組通過(guò)ChIP-seq技術(shù)證實(shí)兩個(gè)調(diào)控植物乳桿菌中FOS代謝的基因簇的預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域存在6個(gè)潛在的CcpA結(jié)合cre位點(diǎn)，揭示了依賴(lài)CcpA的CCR作用調(diào)節(jié)FOS代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［27］。

ChIP技術(shù)是研究DNA-蛋白質(zhì)互作的常用技術(shù)，具有特異性較強(qiáng)且DNA富集效率高的特點(diǎn)。從研究目的來(lái)說(shuō)，更多情況下研究者希望得到真實(shí)反映在相應(yīng)生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合情況，作為一種體內(nèi)研究方法ChIP技術(shù)則能很好滿(mǎn)足這一需求。但ChIP技術(shù)也相對(duì)考驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，ChIP技術(shù)對(duì)染色質(zhì)片段的長(zhǎng)度以及實(shí)驗(yàn)中其他影響因素有較高要求，如以甲醛為交聯(lián)劑時(shí)影響轉(zhuǎn)錄因子的分布情況，使用交聯(lián)劑時(shí)需要注意交聯(lián)劑濃度和交聯(lián)時(shí)間、優(yōu)化超聲破碎參數(shù)使染色質(zhì)的破碎片段長(zhǎng)度在一定范圍、需要選擇合適的抗體等，結(jié)果分析時(shí)也需要格外注意，與目的蛋白結(jié)合的其他蛋白質(zhì)也會(huì)與DNA結(jié)合影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［46］。

4 微量熱泳動(dòng)技術(shù)（MST）

4.1 MST基本原理

MST是一種基于熒光檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，與熱泳動(dòng)相結(jié)合，能快速、精確量化微升溶液中生物分子相互作用的方法。這項(xiàng)技術(shù)的基礎(chǔ)是一種稱(chēng)為熱泳的物理效應(yīng)，它描述了分子通過(guò)溫度梯度的定向運(yùn)動(dòng)。分子的熱泳特性取決于其大小、電荷和水化層［47］。其作用原理為（圖4）［48］：運(yùn)行MST實(shí)驗(yàn)時(shí)，紅外激光瞬間加熱生成一個(gè)微觀溫度梯度場(chǎng)，通過(guò)共價(jià)結(jié)合的熒光染料、熒光融合蛋白或蛋白自身色氨酸熒光來(lái)監(jiān)測(cè)并定量分析分子的定向移動(dòng)［49］，以檢測(cè)相互作用的生物分子間的親和性。簡(jiǎn)而言之，其中一種分子用熒光染料標(biāo)記并保持恒定的濃度，另一種分子被稀釋至適宜的倍數(shù)，建立等濃度梯度稀釋系列，以此產(chǎn)生大量濃度范圍，隨后將這兩種分子混合并加載到用以?huà)呙璧拿?xì)管中，樣品經(jīng)溫度梯度，熒光探測(cè)器跟蹤熒光標(biāo)記分子的運(yùn)動(dòng)。分子在初始溫度和新溫度下的熒光差異產(chǎn)生未標(biāo)記分子的結(jié)合曲線(xiàn)［50］。另外，MST還可以進(jìn)行分子間競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、多結(jié)合配體的測(cè)定、穩(wěn)定性測(cè)定和篩選測(cè)定，獲取化學(xué)計(jì)量和熱力學(xué)參數(shù)等［51］。

圖4 MST實(shí)驗(yàn)的基本原理Fig.4 Basic principle of MST experiment

4.2 MST定量分析結(jié)合相互作用及適用性分析

近年來(lái)，MST成功地用于分析各種生物分子相互作用，如寡核苷酸相互作用［52］、蛋白質(zhì)-DNA相互作用［53］、蛋白質(zhì)-小分子蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用［54-55］。在蛋白質(zhì)與DNA的相互作用研究中，Papageorgiou 等［56］用MST方法檢測(cè)嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）組蛋白類(lèi)DNA結(jié)合蛋白HUTth 與pUC18質(zhì)粒DNA的相互作用，測(cè)得了HUTth與pUC18結(jié)合的解離常數(shù)，并在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定了另外兩個(gè)HU蛋白與pUC18的親和力得出了HU蛋白與DNA分子結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比，發(fā)現(xiàn)MST方法重復(fù)性好。MST技術(shù)提供了方便的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要配置了多種曲線(xiàn)擬合的選項(xiàng)，在數(shù)據(jù)采集的動(dòng)態(tài)過(guò)程中即可分析數(shù)據(jù)［47］。而且MST技術(shù)在幾乎任何的溶液環(huán)境都適用，使某些復(fù)雜體系如細(xì)胞裂解液中相互作用分子的測(cè)量更加簡(jiǎn)便［57］。

MST技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是快速、靈敏、所需樣品量少、對(duì)研究對(duì)象并無(wú)特殊的選擇性、無(wú)相互作用分子質(zhì)量和大小以及相互作用后尺寸變化較大等要求［14］，同時(shí)由于MST的檢測(cè)過(guò)程是在溶液中進(jìn)行所以該技術(shù)提供了接近自然狀態(tài)的檢測(cè)方法［58］，并且利用檢測(cè)儀器分析軟件得出MST結(jié)合曲線(xiàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可以方便得出配體分子是否結(jié)合、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量及親和力等信息［59］。因此MST技術(shù)已廣泛用于生命科學(xué)研究的諸多方面。但是，MST也存在一定的局限性，比如儀器價(jià)格昂貴、不能直接確定具體的結(jié)合位點(diǎn)等。

5 等溫滴定量熱法（ITC）

5.1 ITC基本原理

ITC是一種廣泛用于研究分子間結(jié)合相互作用的方法，ITC實(shí)驗(yàn)的主要數(shù)據(jù)是熱分析圖，圖中記錄了絕熱的對(duì)照池和樣品池之間保持恒定的溫差所需的時(shí)間進(jìn)程。其原理為（圖5）［10］將已知濃度的反應(yīng)物滴定到樣品中，每次樣品的注入都會(huì)引起樣品池中溶液成分的變化，并且在其反應(yīng)達(dá)到新的平衡期間，系統(tǒng)將記錄反應(yīng)熱并形成相應(yīng)的峰，每個(gè)峰的面積表示在樣品與樣品池中組分反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生或消耗的總熱量。例如，在模擬整合加熱的等溫線(xiàn)之后，可以得到反應(yīng)焓變、結(jié)合親和力和結(jié)合化學(xué)計(jì)量等信息［60］。

圖5 ITC實(shí)驗(yàn)的基本原理Fig.5 Basic principle of ITC experiment

5.2 ITC研究結(jié)合作用模式及適用性分析

在過(guò)去的幾十年里，ITC已經(jīng)被應(yīng)用到眾多的系統(tǒng)中。這些研究大多集中于分子間的相互作用，如蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與小配體之間、DNA與其他大分子系統(tǒng)之間以及酶動(dòng)力學(xué)中［61］。在原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中，Zhuo等［62］研究黃色粘球菌DK1622（Myxococcus xanthus DK1622）groELs差異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)ITC技術(shù)用DNA滴定粘球菌DK1622的HrcA蛋白，分析HrcA蛋白和分子伴侶表達(dá)反向重復(fù)序列（controlling inverted repeat of chaperone expression，CIRCE）之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)HrcA蛋白不能與CIRCE2groESL1元件結(jié)合，而傾向于與CIRCE1groESL1結(jié)合，其次是CIRCEgroEL2。2014年，Wang等［63］通過(guò)該方法對(duì)一些調(diào)控因子與啟動(dòng)子的結(jié)合參數(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的表征，另外還對(duì)調(diào)控因子結(jié)合效應(yīng)物小分子的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了分析，展示了外源抗生素JdB 對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌ScbR2（Streptomyces coelicolor ScbR2）的結(jié)合情況，數(shù)據(jù)表明它們近似1∶1結(jié)合，取得了較好的研究效果。雖然ITC技術(shù)可應(yīng)用于多種系統(tǒng)相互作用的研究，但傳統(tǒng)的ITC技術(shù)直接滴定的方法難以用于超高（Ka＞108M-1）/超低（Ka＜104M-1）親和力系統(tǒng)的測(cè)定，利用與目標(biāo)分子具有較弱親和作用的競(jìng)爭(zhēng)性配體采取置換滴定的方式，可獲得準(zhǔn)確的熱力學(xué)信息，提高該方法的適用性［11-12］。ITC技術(shù)還可更進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的某一結(jié)構(gòu)域與DNA序列的關(guān)系，得出結(jié)合親和力的具體信息、反應(yīng)焓變和熵等參數(shù)可幫助研究相互作用分子之間的結(jié)合模式，為更深入研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子提供了豐富的信息［64］。

ITC在分子相互作用研究方面有兩大優(yōu)勢(shì)。首先，ITC主要應(yīng)用于天然蛋白，不需要對(duì)其進(jìn)行修飾；其次，ITC提供了豐富的熱力學(xué)信息，包括焓值、熵值和熱容量等。因此，該技術(shù)提供的豐富的信息常用來(lái)推斷分子間相互作用反應(yīng)機(jī)制，例如結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目、不同構(gòu)象反應(yīng)物滴定的熱力學(xué)差異等［65］。然而，傳統(tǒng)的ITC也存在局限性，其分析受到隨機(jī)熱譜圖噪聲影響，且單個(gè)滴定實(shí)驗(yàn)信息量有限。因此，Brautigam 等［66］提出一個(gè)基于自動(dòng)形狀分析注射峰的無(wú)偏差熱成像積分的方案，然后將來(lái)自不同量熱滴定實(shí)驗(yàn)的等溫線(xiàn)組合進(jìn)行全局分析，并將結(jié)合參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以圖形直觀地表示。

6 細(xì)菌單雜交系統(tǒng)（bacterial-one-hybrid system）

6.1 細(xì)菌單雜交系統(tǒng)基本原理

細(xì)菌單雜交系統(tǒng)是一種在體內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄因子和目的基因相互作用的研究技術(shù)，該技術(shù)是在酵母單雜交和細(xì)菌雙雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)。細(xì)菌單雜交系統(tǒng)的原理是轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶的α亞基融合表達(dá)，識(shí)別隨機(jī)文庫(kù)載體上的DNA片段并與之結(jié)合，使RNA聚合酶聚集到報(bào)告基因上游弱啟動(dòng)子區(qū)域，激活報(bào)告基因his3和ura3表達(dá)（圖6）［67］。該系統(tǒng)包括3個(gè)組成部分：轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體、結(jié)合隨機(jī)位點(diǎn)文庫(kù)的報(bào)告載體和營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌［68］。轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合激活報(bào)告基因his3和ura3，有利于組氨酸和尿嘧啶合成，轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體和隨機(jī)文庫(kù)報(bào)告載體轉(zhuǎn)化到營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌中使其在含有一定濃度3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）的缺乏組氨酸和尿嘧啶篩選平板上生長(zhǎng)，篩選出與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的DNA片段。

圖6 細(xì)菌單雜交系統(tǒng)基本原理Fig.6 Basic principle of bacterial one hybrid system

6.2 細(xì)菌單雜交篩選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及適用性分析

細(xì)菌單雜交系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用方面得到了廣泛的應(yīng)用，如Hebdon等［69］利用細(xì)菌單雜交系統(tǒng)篩選了艱難梭狀芽孢桿菌R20291（Clostridioides difficile R20291）反應(yīng)調(diào)節(jié)因子RR_1586的可能調(diào)控靶點(diǎn)，并利用EMSA驗(yàn)證了RR_1586與該段基因序列的結(jié)合，證實(shí)了RR_1586結(jié)合位點(diǎn)位于可能的靶基因上游。Zhai等［70］發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）在酸脅迫條件下預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Ldb0677表達(dá)上調(diào)1.84倍，用細(xì)菌單雜交和EMSA測(cè)定了Ldb0677的DNA結(jié)合特異性，表明它可能是保加利亞乳桿菌酸脅迫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。對(duì)于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，建立有關(guān)物種的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子數(shù)據(jù)庫(kù)，包括已經(jīng)證實(shí)的轉(zhuǎn)錄因子、全基因組結(jié)合位點(diǎn)、位置權(quán)重矩陣（position frequency matrix，PFM）等信息，對(duì)快速構(gòu)建相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有很大幫助，細(xì)菌單雜交系統(tǒng)因其較高的轉(zhuǎn)化效率被用于建立轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)［71］。

與EMSA相比，細(xì)菌單雜交系統(tǒng)不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白純化；此外，細(xì)菌生長(zhǎng)速度較快，具有更高的轉(zhuǎn)化效率，與酵母單雜交系統(tǒng)相比此技術(shù)可以搜索更大的隨機(jī)文庫(kù)。通過(guò)此方法有利于發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)DNA序列特異性結(jié)合的潛在轉(zhuǎn)錄因子。此方法具有操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜儀器且轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，適用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)鑒定并進(jìn)行高通量分析，但有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，所以往往需要與其他技術(shù)聯(lián)用來(lái)驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

7 總結(jié)與展望

基因表達(dá)調(diào)控是生物遺傳調(diào)控的一個(gè)重要方面，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是原核生物關(guān)鍵調(diào)控步驟且是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。本文總結(jié)了原核生物DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)，主要從基本原理、實(shí)驗(yàn)方法、注意事項(xiàng)及其進(jìn)展進(jìn)行綜述。通過(guò)其具體應(yīng)用了解這些研究技術(shù)在研究原核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要作用及其發(fā)展趨勢(shì)。

盡管上述的每項(xiàng)研究技術(shù)都是一項(xiàng)獨(dú)立的技術(shù)，但是目前看來(lái)某種研究技術(shù)都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用性，可以根據(jù)情況選擇合適的技術(shù)而且往往需要相互補(bǔ)充才能確認(rèn)DNA-蛋白質(zhì)相互作用的特異性和親和性，因此在研究中通常兩項(xiàng)或兩項(xiàng)以上技術(shù)結(jié)合使用。此外，對(duì)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究技術(shù)還有待于進(jìn)一步地發(fā)展，通過(guò)各種技術(shù)手段建立轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子之間的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為重要，以期能夠重新解釋原核生物的各種生理現(xiàn)象，為構(gòu)建更加復(fù)雜、更準(zhǔn)確地反映原核生物生命現(xiàn)象的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)提供更多的經(jīng)驗(yàn)。隨著后基因時(shí)代的發(fā)展，原核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究技術(shù)的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。對(duì)這些研究技術(shù)的改進(jìn)或在原有技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出新技術(shù)使其適用于更多的情況，為原核生物的基因改造提供新的靶點(diǎn)和思路，從而更好地發(fā)揮原核生物作為生產(chǎn)宿主的優(yōu)勢(shì)，助力創(chuàng)造綠色低碳、可持續(xù)發(fā)展的資源節(jié)約型生產(chǎn)方式，為人類(lèi)造福。