山琦 賈惠舒 姚文博 劉偉燦 李海燕

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118；2.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，?？?570228）

植物miRNA（microRNA）是一類具有調(diào)控作用的小分子RNA，其本身并不編碼功能蛋白，而是通過負(fù)調(diào)控靶mRNA行使功能。miR396是植物中保守存在的miRNA家族之一，并且植物中保守的生長調(diào)節(jié)因子（GRF）基因家族的多數(shù)成員已被證實(shí)是其作用的靶基因［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR396通過負(fù)調(diào)控生長調(diào)節(jié)因子GRF家族基因，可以影響植物葉片及花器官的形態(tài)建成、根和莖組織的伸展、種子的大小、數(shù)量等表型變化［2］，進(jìn)而影響植物的生物量及作物產(chǎn)量［3］，并可改善植物吸收氮和磷肥的能力及植物耐受逆境脅迫的響應(yīng)能力［4-5］。此外，最新的研究結(jié)果證明，GRF基因在基因工程技術(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，不僅可以顯著提高外植體的再生效率，還可拓展受體植物的基因型［6］。因此，miR396介導(dǎo)的GRF調(diào)控（miR396-GRF）模塊在改良植物生物量、作物產(chǎn)量、抗逆能力及提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率方面，已展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文介紹了miR396-GRF模塊的作用模式，綜述了近年來miR396-GRF模塊的生物學(xué)功能及分子機(jī)制研究進(jìn)展。為進(jìn)一步深入研究miR396-GRF模塊及其開發(fā)應(yīng)用提供思路和參考。

1 植物中的miR396與GRF基因及其互作模式

目前，在miRNA的序列數(shù)據(jù)庫（miRBase）中，共收錄了植物47個(gè)物種中的138個(gè)前體miR396（pre-miR396）和175個(gè)成熟體miR396（mat-miR396）序列（包括132個(gè)miR396-5p和43個(gè)miR396-3p序列）。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，不同物種中的mat-miR396序列具有高度的同源性（圖1）。并且，大多數(shù)matmiR396序列與擬南芥中的ath-miR396a-5p和athmiR396b-5p兩種成熟序列形式相同，其二者在序列長度上一致，但末位具有一個(gè)不同的核苷酸堿基（圖1）。并且，在目前已有的報(bào)道中，這兩種matmiR396序列也已被證實(shí)相比miR396家族的其它成員，具有更顯著的表征作用。

圖1 不同植物物種中miR396基因家族成熟區(qū)序列比對(duì)分析Fig.1 Alignment analysis of mature region sequences of miR396 gene family in different plant species

生長調(diào)節(jié)因子GRF是一類保守存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控植物生長發(fā)育等過程中起重要作用。GRF蛋白的N端普遍含有QLQ和WRC兩個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域（圖2）。在QLQ結(jié)構(gòu)域中，除保守的Q/Gln-L/Leu-Q/GLn氨基酸外，還含有疏水性的酸性氨基酸殘基 F/Phe、Y/Tyr、L/Leu、E/Glu和P/Pro等，或其他理化性質(zhì)類似的氨基酸（圖2-A）。這些氨基酸殘基可能在GRF蛋白與靶蛋白互作中起關(guān)鍵作用。在WRC結(jié)構(gòu)域中，含有保守的W/Trp-R/Arg-C/Cys氨基酸殘基，以及由3個(gè)C/Cys和一個(gè)H/His組成的C3H motif，這些高度保守的氨基酸位點(diǎn)可能在決定GRF蛋白核定位和結(jié)合下游基因順式作用元件過程中起重要作用（圖2-B）［7］。值得注意的是，緊隨C3H motif區(qū)域之后，有一個(gè)保守的“RSRK-VE區(qū)”（圖2-B），該區(qū)域?qū)?yīng)的核苷酸編碼序列大多高度保守，且與成熟的miR396序列近乎互補(bǔ)。目前已證實(shí)，miR396在此保守位點(diǎn)的“CGUUCAAGAA”和“AGCNUGUGGAA”之間剪切GRF基因的mRNA序列（圖3），進(jìn)而負(fù)調(diào)控GRF基因的表達(dá)［1］。但是，也有少數(shù)GRF成員的“RSRK-VE”區(qū)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列不能與成熟miR396序列互補(bǔ)配對(duì)，因此不被miR396剪切調(diào)控。例如，在擬南芥9個(gè)AtGRF家族成員中，AtGRF5和AtGRF6雖含有保守的“RSRKVE”，但其核苷酸編碼序列卻不能與成熟miR396序列互補(bǔ)，因此不受miR396調(diào)控［8］。此外，植物中GRF蛋白家族的C端氨基酸序列高度可變，推斷其可能與GRF蛋白功能的多樣性或轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)［9］。

圖2 不同植物物種中GRF蛋白家族氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)分析Fig.2 Alignment analysis of the conserved domains of GRF protein family amino acid sequences in different plant species

圖3 不同植物物種中miR396在GRF基因序列上的作用位點(diǎn)及剪切位點(diǎn)Fig.3 Action sites and splicing sites of miR396 on GRF gene sequences in different plant species

2 miR396-GRF模塊的生物學(xué)功能及應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 miR396-GRF模塊對(duì)植物生長發(fā)育及生物量的影響

自miR396-GRF模塊被發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的研究證實(shí)了miR396-GRF模塊具有影響植物組織器官形態(tài)建成過程的調(diào)控功能。當(dāng)突變體中的miR396基因被插入失活，或是miR396基因被敲除表達(dá)，以及在超表達(dá)GRF基因的植物材料中，miR396-GRF模塊通常表現(xiàn)出促進(jìn)植物組織生長發(fā)育過程的趨勢。例如，在擬南芥中過表達(dá)內(nèi)源的AtGRF3基因［10］、異源的煙草 NtGRF8［11］、白菜 RbGRF8［12］，或是在水稻中過表達(dá)rOsGRF1基因（氨基酸同義突變，但核酸序列上消除了miR396靶位點(diǎn)）等［13］，都促使轉(zhuǎn)基因植株變高，葉片變大，根系粗壯，種子及花器官發(fā)育延緩等形態(tài)變化［14-16］。并且，同義突變處理后的rGRF基因促進(jìn)植物增長的效果更加顯著［10］。相反，當(dāng)在植物中超表達(dá)miR396基因，或是突變體中的GRF基因被插入失活，以及GRF基因在植物材料中被抑制表達(dá)，miR396-GRF模塊通常會(huì)表現(xiàn)出抑制植物組織生長發(fā)育過程的趨勢。例如，在擬南芥［17］和水稻［18］等植物中過表達(dá)同源或異源miR396的轉(zhuǎn)基因株系，都表現(xiàn)出生長遲緩，植株矮小，根系變短，葉片也變得窄小的形態(tài)變化，這些表型與grf突變體相似［19］。因此，miR396與GRF基因在調(diào)控植物組織器官生長發(fā)育的過程中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，二者之間的靶向作用平衡制約著植物的形態(tài)表征。

此外，miR396-GRF模塊在一些經(jīng)濟(jì)類植物中的表達(dá)調(diào)控，也表現(xiàn)出了一些有益的表型變化。例如，Wang等［20］在我國木材主要來源的楊樹（Populus alba × P.glandulosa）中，證實(shí)了PagGRF12a基因的表達(dá)調(diào)控作用可增加楊樹木質(zhì)部的寬度，促進(jìn)木材的建成。Liu等［21］在可用于生物燃料生產(chǎn)的植物柳枝稷（Panicum virgatum L.）中，證實(shí)了rPVGRF9基因的過表達(dá)可改變其生物量及原料質(zhì)量。此外，在生菜（Lactuca sativa）中過表達(dá)LsaGRF5基因后，生菜葉片明顯變大，可顯著提升蔬菜的生物量產(chǎn)出［22］。以及在可用作牧飼材料的苜蓿［23］中，利用Target mimicry技術(shù)敲降表達(dá)miR396后的MIM396苜蓿材料，葉片的生物量也顯著增加，并且根系粗壯發(fā)達(dá)。綜上所述，miR396-GRF模塊的調(diào)控作用在提升植物生物量方面展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 miR396-GRF模塊對(duì)產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀的影響

基于對(duì)植物生長發(fā)育過程的影響作用，miR396-GRF模塊也展現(xiàn)出了對(duì)作物產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀的影響能力。例如，miR396沉默體 MIM396水稻［14］、mir396ef突變體水稻［24］和GRF基因過表達(dá)后的水稻和小麥植株［25-27］，都表現(xiàn)出了穗數(shù)的顯著增加，以及粒長和粒寬的增長現(xiàn)象，并且它們相對(duì)野生型能獲得更高的糧食產(chǎn)量。在果蔬植物番茄中，miR396通過調(diào)控不同的GRFs靶基因，也影響著番茄果實(shí)的多方面變化，過表達(dá)rGRF4和rGRF5的轉(zhuǎn)基因番茄可通過增加果皮厚度和果實(shí)心室數(shù)使果實(shí)重量明顯增加［28］。在油菜中，本源表達(dá)BnGRF2基因后的轉(zhuǎn)基因油菜的種子千粒重和含油量也得到顯著提升［29］。因此，miR396-GRF模塊的調(diào)控作用在提升作物產(chǎn)量及品質(zhì)方面也展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。

另外，目前的研究報(bào)道顯示，miR396-GRF模塊還具有提升植物氮肥和磷肥利用率的能力。在缺氮條件下，過表達(dá)ZmGRF1基因的玉米可正向調(diào)控玉米氮素相關(guān)途徑基因的表達(dá)，促進(jìn)氮肥吸收［30］。OsGRF4蛋白在水稻中的高水平積累也可以提高光合作用和氮肥利用效率［5］。此外，在高供磷條件下，過表達(dá)SlGRF9的轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)土壤中磷的利用率也顯著提高。所以，miR396-GRF模塊在植物調(diào)控肥料吸收能力方面也有益于農(nóng)藝生產(chǎn)。

2.3 miR396-GRF模塊在逆境脅迫響應(yīng)過程中的調(diào)控作用

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物體對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)能力也是影響田間生產(chǎn)的重要因素。近年來的研究表明，miR396-GRF模塊在調(diào)控植物響應(yīng)逆境脅迫的過程中發(fā)揮著積極的調(diào)控作用。例如，MIM396番茄植株中由于miR396的下調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致其在缺水脅迫下的蒸騰速率（E）降低，水分利用效率（WUE）顯著提高［31］。并且，在番茄中過表達(dá)AtGRF9基因，可提升根系蔗糖和干物質(zhì)的含量，增強(qiáng)根系分泌質(zhì)子的能力。所以，miR396-GRF模塊的調(diào)節(jié)作用對(duì)于番茄響應(yīng)干旱等多種逆境脅迫過程都具有積極的意義［32］。在草坪草匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）中，超表達(dá)Osa-miR396c的轉(zhuǎn)基因植株在高鹽度環(huán)境中保水性增強(qiáng)、葉綠素含量相對(duì)較高、且細(xì)胞膜具有較好的完整性和鈉離子排除能力，由此表明其具有較強(qiáng)的鹽脅迫適應(yīng)能力［33］。此外，OsGRF4基因突變體水稻在苗期的耐寒性增強(qiáng)，冷脅迫處理后幼苗的存活率顯著升高［3］。擬南芥經(jīng)UV-B輻射后，miR396抑制AtGRF1/2/3表達(dá)，降低細(xì)胞增殖速率的同時(shí)抑制葉片生長，起到耐紫外線的作用。因此，miR396-GRF模塊在調(diào)控植物響應(yīng)多種非生物脅迫的過程中具有積極意義。

在植物響應(yīng)生物脅迫的過程中，miR396-GRF模塊也同樣具有調(diào)控功能。在大豆中，通過過表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)干擾miR396-GmGRF調(diào)控途徑，會(huì)抑制大豆孢囊線蟲幼體向成體的發(fā)育［34］。此外，稻瘟病毒嚴(yán)重影響著水稻的生長和產(chǎn)出。研究發(fā)現(xiàn)，OsamiR396d抑制OsGRF6/7/8/9表達(dá)，延緩水稻生長發(fā)育，減少病毒向新生組織擴(kuò)散，從而提高了抵抗稻瘟病的能力［35］。因此，miR396-GRF模塊在調(diào)控植物響應(yīng)生物脅迫的過程中也展現(xiàn)出了積極作用。

2.4 GRF提高植物再生效率的研究

轉(zhuǎn)基因受體材料遺傳轉(zhuǎn)化效率低及基因型的限制（即小麥等物種中僅有少數(shù)基因型的品種材料才可以被成功遺傳轉(zhuǎn)化）是基因功能研究及基于基因組編輯育種技術(shù)的主要瓶頸。2020年Kong等［6］研究發(fā)現(xiàn)，將AtGRF5及其同源基因?qū)胩鸩?、油菜、大豆和向日葵中均可有效提高轉(zhuǎn)化效率并產(chǎn)生完全可育的轉(zhuǎn)基因植株。緊隨其后，Pan等［36］進(jìn)一步證實(shí)了在AtGRF5基因的輔助轉(zhuǎn)化作用下，西瓜外植體材料的轉(zhuǎn)化效率提高了40倍。同期，Debernardi等［37］研究發(fā)現(xiàn)小麥TaGRF4-TaGIF1嵌合體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)顯著提高了4個(gè)品種小麥的再生效率，并且外植體再生過程周期短，不依賴激素調(diào)節(jié)，且轉(zhuǎn)化體沒有負(fù)面表型影響，從而拓展了小麥被轉(zhuǎn)化受體材料的基因型。此后，高彩霞團(tuán)隊(duì)通過共轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)GRF-GIF嵌合體蛋白也證實(shí)了其有效性，并且小麥TaGRF4-TaGIF1嵌合體與基因編輯體系共表達(dá)也被證實(shí)可以高效地獲得編輯成功的突變體材料［38］。目前已被證實(shí)，GRF基因及其嵌合體相比以往使用的提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的生長調(diào)節(jié)基因如BBM、WUS、IPT等更加有效［39］。顯然，GRF基因在改善雙子葉和單子葉植物外植體再生效率，及提高基因編輯效率方面都展現(xiàn)出了誘人的應(yīng)用前景。

3 植物miR396-GRF模塊作用的分子機(jī)制研究

3.1 GIF作為輔激活因子可增強(qiáng)GRF蛋白的活性及功能

目前，在多篇研究報(bào)道中，都證實(shí)了不同物種中的 GRF 和 GIF 之間存在著蛋白互作關(guān)系［7，20，40］，GIF蛋白也由此而得名為GRF蛋白相互作用因子（GRF-interacting factor，GIF）。Lu 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OsGIF1基因的水稻沒有顯著的表型變化，而OsGIF1基因敲除后的水稻表現(xiàn)為植株矮小等表型形態(tài)，與OsGRF1基因敲除后的水稻形態(tài)相似。并且，mOsGRF1基因過表達(dá)和OsGIF1基因敲除的雜交系水稻植株也呈現(xiàn)矮小狀態(tài)。因此推斷，GIF蛋白雖然不能獨(dú)立行使功能，但確是生長調(diào)節(jié)因子GRF調(diào)控植物生長發(fā)育過程中不可或缺的因素。

進(jìn)一步的深入研究表明，GRF和GIF蛋白首先在細(xì)胞核內(nèi)形成功能復(fù)合物，然后GIF蛋白負(fù)責(zé)招募SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物，借助染色質(zhì)重塑酶BRM，利用ATP水解產(chǎn)生的能量，破壞組蛋白與DNA的相互作用，使DNA和組蛋白之間變得松散，以便作為轉(zhuǎn)錄因子的GRF蛋白與順勢作用元件結(jié)合并激活或抑制下游目的基因的轉(zhuǎn)錄［9，39］，進(jìn)而發(fā)揮各種生物學(xué)功能。因此，GIF作為GRF蛋白的輔激活因子，具有增強(qiáng)GRF蛋白活性的功能。

此外，植物細(xì)胞的去分化和再生能力，直接影響著植物外植體材料的遺傳轉(zhuǎn)化效率。一般來說，分化細(xì)胞具有緊密的染色質(zhì)狀態(tài)，而去分化過程使染色質(zhì)變?yōu)殚_放松弛狀態(tài)［39］。由于GRF-GIF復(fù)合體可以使染色質(zhì)重塑而變得松散，因此可以有助于提升植物外植體材料的再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化效率。

3.2 miR396-GRF模塊調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

目前已有的研究結(jié)果顯示，在植物成熟的葉片、根和莖等組織中，miR396的表達(dá)量相對(duì)較高，GRF基因的表達(dá)量相對(duì)較低；而在根尖、花芽和幼嫩的葉片等初生組織中，miR396的表達(dá)量相對(duì)較低，GRF基因的表達(dá)量卻相對(duì)較高［41］。

其中，KNOX蛋白是促進(jìn)莖尖組織分生的關(guān)鍵因子。Kuijt等［42］證實(shí)，水稻OsGRF3和OsGRF10基因通過與KNOX家族基因啟動(dòng)子區(qū)的相互結(jié)合，從而抑制OsKN2基因的表達(dá)，并影響植物分生組織的發(fā)育。

另外，在植物中過表達(dá)miR396或敲除GRF基因可觀測到植株矮小，器官發(fā)育延緩等現(xiàn)象，但這種變化可以被GRF基因的表達(dá)所恢復(fù)［14-16］。細(xì)胞水平的檢測結(jié)果證實(shí)，上述轉(zhuǎn)基因材料葉片單位面積內(nèi)的表皮細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞分裂增殖受到了抑制［1，19］。轉(zhuǎn)錄組測序和熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，miR396-GRF模塊的遺傳轉(zhuǎn)化材料中，一些與DNA 復(fù)制、細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等有關(guān)的基因具有顯著表達(dá)差異，如MAPK、CYC家族基因等［29，33］。因此說明，miR396-GRF 模塊通過控制植物組織細(xì)胞的分裂增殖過程［19，33］，進(jìn)而影響著植物組織的生長發(fā)育過程。

3.3 miR396-GRF模塊的激素調(diào)節(jié)機(jī)制研究

植物激素是植物細(xì)胞接受環(huán)境信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性物質(zhì)。在細(xì)胞分裂分化、開花結(jié)實(shí)、成熟衰老等多個(gè)方面，植物激素對(duì)植物的生長發(fā)育過程起著重要的調(diào)控作用［43-44］。已有的研究報(bào)道表明，miR396-GRF模塊調(diào)控植物生長發(fā)育的過程與赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）等激素調(diào)節(jié)及合成過程有著密切關(guān)系（圖4）。Zhang等［24］對(duì)水稻雙突變體osmir396ef的葉片進(jìn)行了液相質(zhì)譜色譜聯(lián)用及代謝組分析，發(fā)現(xiàn)GA3，GA4，GA7水平以及GA合成前體甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）水平均明顯提高，由此說明，miR396-GRF模塊間接影響著IAA的生物合成。此外，郭涇磊等［45］分析發(fā)現(xiàn)，在小麥TaGRF基因的啟動(dòng)子區(qū)存在大量IAA的響應(yīng)元件，在外源施加IAA處理后，可顯著上調(diào)TaGRF基因的表達(dá)，進(jìn)而影響小麥分蘗。此外，在水稻和擬南芥中，都證實(shí)了AtGRF基因的下調(diào)表達(dá)，會(huì)進(jìn)一步調(diào)控IAA生物合成途徑的關(guān)鍵基因，如YUC和ARF基因等，進(jìn)而影響IAA的生物合成。因此，GRF基因的表達(dá)受到了IAA的誘導(dǎo)調(diào)控，GRF基因的表達(dá)又影響IAA的生物合成。綜上，miR396-GRF模塊參與了植物激素的調(diào)節(jié)過程，但大多缺少直接聯(lián)系的作用證據(jù)，還需進(jìn)一步開展深入的研究。

圖4 miR396-GRF模塊調(diào)控植物生長發(fā)育的過程Fig.4 Process of miR396-GRF module regulating plant growth and development

3.4 miR396-GRF模塊調(diào)控植物逆境脅迫響應(yīng)的機(jī)制研究

植物由于其固著的生活方式而不得不連續(xù)暴露于可能存在各種逆境脅迫的環(huán)境之中。為應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，植物進(jìn)化出了各種復(fù)雜的防御機(jī)制，包括信號(hào)傳感和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、調(diào)控下游脅迫反應(yīng)相關(guān)功能基因的表達(dá)等，從而通過氣孔關(guān)閉、細(xì)胞生長、光合作用抑制、可溶性物質(zhì)積累等各種生物過程，保護(hù)植物免受損害并增加生存機(jī)會(huì)。有關(guān)miR396-GRF模塊遺傳轉(zhuǎn)化材料的轉(zhuǎn)錄組及Go富集分析發(fā)現(xiàn)，除了與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因外，還存在很多與表達(dá)調(diào)控、激素合成、抗氧化還原反應(yīng)等各種與逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)基因的差異表達(dá)［33］。因此說明，miR396-GRF模塊在植物響應(yīng)逆境脅迫的過程中，也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

根據(jù)目前研究獲得的數(shù)據(jù)表明，miR396-GRF模塊在植物中響應(yīng)逆境脅迫的潛在信號(hào)通路大致為：在逆境脅迫下，miR396-GRF模塊被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后，首先控制蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)蛋白；然后這些調(diào)節(jié)蛋白激活或抑制下游逆境響應(yīng)相關(guān)的功能基因，進(jìn)而響應(yīng)逆境脅迫過程（圖5）。例如，Yuan等［33］通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在miR396的轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎中，WRKY、MADS和AP2等調(diào)節(jié)作用基因被下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而下游Na+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AsSOS1的作用被激活，從而影響了植株的耐鹽脅迫響應(yīng)能力。Vall等［46］研究發(fā)現(xiàn)，GRFs的下調(diào)表達(dá)將導(dǎo)致控制活性氧（ROS）產(chǎn)生的乙烯反應(yīng)因子ERF1基因的上調(diào)，從而阻斷乙烯反應(yīng)，降低抗氧化酶活性。Kim等［47］的研究揭示，擬南芥AtGRF7基因可直接作用到與脫水反應(yīng)有關(guān)的DREB2A基因的啟動(dòng)子區(qū)，并抑制其表達(dá)，從而導(dǎo)致atgrf7突變體在高鹽與干旱條件下的耐受性增強(qiáng)。Fracasso等［31］研究結(jié)果顯示，MIM396番茄植株中，GRF基因的上調(diào)表達(dá)可刺激表皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致氣孔密度增加，氣孔變??；并可促進(jìn)茉莉酸（JA）和γ-氨基丁酸（4-aminobutyric acid，GABA）的積累，從而調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉和維系光合作用過程，改變植物的逆境適應(yīng)能力?？傊?，關(guān)于miR396-GRF模塊的研究有很多報(bào)道，但是其在植物中響應(yīng)脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在很大程度上仍然是未知的，也需進(jìn)一步開展深入的研究工作。

圖5 miR396-GRF調(diào)控模塊在脅迫響應(yīng)過程中的可能調(diào)控途徑Fig.5 Feasible regulation approach of miR396-GRF module in the process of stress response

4 結(jié)語

目前已有的研究結(jié)果表明，miR396-GRF模塊不僅可以調(diào)控水稻及小麥等的株高、分蘗、穗數(shù)、籽粒大小及灌漿過程而影響作物產(chǎn)量［25-27］、提高油菜籽的出油率［29］；還可改善番茄的抗旱能力［31］，草坪草的耐鹽能力［33］及水稻的耐寒能力［3］等，并影響大豆感染孢囊線蟲［34］及水稻感染稻瘟病毒的過接證據(jù)。第四，miR396-GRF模塊在影響植物生長發(fā)育方面的研究報(bào)道進(jìn)展較快，但是關(guān)于其影響植物逆境脅迫響應(yīng)的研究相對(duì)薄弱。第五，miR396-GRF模塊調(diào)控作用的分子機(jī)制還很不清楚，缺乏調(diào)控途徑之間的直接關(guān)聯(lián)證據(jù)。第六，在大豆、玉米等重要物種中及同一物種中的不同基因型品種中，GRF基因可提升遺傳轉(zhuǎn)化效率的有效性正亟待實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與基因編輯模塊的聯(lián)合應(yīng)用更有待開發(fā)。

綜上，miR396-GRF作為植物分子育種領(lǐng)域的候選基因，進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用之前還需要很多的研究準(zhǔn)備工作。建議加強(qiáng)miR396-GRF模塊在標(biāo)的物種中的全方面調(diào)控作用研究，深入闡明其調(diào)控作用的分子機(jī)制；并大力開發(fā)高效有益的miR396-GRF基因用于植物品種改良，快速推進(jìn)GRF基因在遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯系統(tǒng)中的有效運(yùn)用。在此，本文僅為進(jìn)一步深入研究miR396-GRF途徑及其開發(fā)應(yīng)用整理思路和提供參考。程［35］。此外，GRF基因被證實(shí)能有效提升小麥等植物基因轉(zhuǎn)化及外植體再生效率［39］。因此，miR396-GRF模塊在提高作物產(chǎn)量、改良植物抗逆能力及提升植物遺傳轉(zhuǎn)化效率方面都展現(xiàn)出了誘人的應(yīng)用前景。

然而，近年來miR396-GRF模塊雖然得到了研究者們的更多關(guān)注，有關(guān)miR396-GRF模塊生物學(xué)功能的研究報(bào)道也層出不窮，但在其研究發(fā)展的道路上和真正被開發(fā)應(yīng)用之前，還存在很多值得注意的地方和需要解決的問題。例如，第一，miR396-GRF模塊調(diào)控途徑在植物界的不同物種中保守存在，在每個(gè)植物物種中，miR396和GRF家族基因的成員數(shù)都普遍較多，存在功能冗余情況。第二，miR396-GRF模塊中的同一基因在不同物種中，或同一物種的不同家族基因成員之間，可能存在著顯著的功能差異，甚至相反的影響。例如，TaGRF4 與ZmGRF10因缺少C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，由此它們都抑制葉片的伸長生長［45，48］；miR396轉(zhuǎn)基因煙草抗旱能力增強(qiáng)［49］，而miR396轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱能力降低［50］，這可能與物種之間的差異有關(guān)。第三，目前miR396-GRF模塊基因的功能更多的是在模式植物中異源表達(dá)被證實(shí)，大多缺乏在標(biāo)的物種中的直