趙杰 李安 梁剛 靳欣欣 潘立剛

（1.北京市農(nóng)林科學院質量標準與檢測技術研究所，北京 100097；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室（北京），北京 100097）

環(huán)狀 RNA（circular RNAs，circRNAs）是真核細胞中廣泛存在的一類內(nèi)源性非編碼RNA分子，不具有5′末端帽子和3′末端poly（A）尾巴，以共價鍵形成閉合環(huán)形結構［1-2］。circRNAs于20世紀70年代首次在植物病毒體中發(fā)現(xiàn)［3］。由于較低的表達豐度及非線性的特點，最初circRNAs被視為RNA異常剪接中的副產(chǎn)品或“轉錄噪音”，并未受到足夠的重視［4］。近年來，高通量測序、基因編輯等先進技術的發(fā)展以及生物信息學的進步極大地加速了環(huán)狀RNA研究進展，其在生命活動中的重要作用也逐漸被揭示出來［5-6］。不同于線性RNA，circRNAs獨特的環(huán)形結構使其不容易被核酸外切酶和核糖核酸酶降解，因而較線性RNA穩(wěn)定性更高［7］。另外，研究表明植物circRNAs還具有保守性以及細胞或者組織特異性表達等特點，使其有作為生物標志物的潛在優(yōu)勢［8-10］。目前，研究者們已對擬南芥［11］、番茄［12］、大豆［13］、水稻［14］、玉米［15］、小麥［16］、馬鈴薯［17］、葡萄［18］、沙棘［19］、杜梨［20］、獼猴桃［21］、茶葉［22］等多種植物中的circRNAs進行了鑒定并開展了相關的研究。表1統(tǒng)計了不同植物中已鑒定出的circRNAs數(shù)量。本文簡要介紹植物circRNAs的分類和特征，重點總結植物circRNAs參與的生物學過程及其作為潛在生物標志物的研究進展，最后展望未來circRNAs的研究方向。

表1 不同植物組織中已鑒定出的circRNAs數(shù)量統(tǒng)計（2017-2021）Table 1 Statistics of identified circRNAs in different plant tissues（2017-2021）

1 植物circRNAs的分類和特征

1.1 植物circRNAs的分類

植物circRNAs長度主要介于200-600 bp之間，目前已發(fā)現(xiàn)的circRNAs根據(jù)其在基因組來源區(qū)域可以分為外顯子circRNA（ecircRNA）、外顯子-內(nèi)含子 circRNA（EIciRNA）、內(nèi)含子 circRNA（ciRNA）、轉運RNA 內(nèi)含子circRNA（tricRNA）等，各類circRNA 的形成過程見圖1［23］。

圖1 circRNAs的分類Fig.1 Classification of circular RNAs

1.2 植物circRNAs的特征

（1）植物circRNAs具有較高的穩(wěn)定性。與線性RNA不同，circRNAs無游離的5′端和3′端，特殊的共價閉合環(huán)狀結構使其對核酸酶具有抗性［24-25］。因此，許多研究為從樣本中富集circRNAs，采用核酸外切酶RNase R來處理提取得到的RNA，用于后續(xù)研究［26］。另外，circRNAs的穩(wěn)定性還體現(xiàn)在其較長的半衰期上，與mRNA半衰期只有10 h相比，大部分circRNAs的半衰期超過48 h，較好的穩(wěn)定性更有利于對其進行鑒定和進一步的研究［27-28］。

（2）植物circRNAs具有進化保守性。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在不同物種之間存在一定的保守性。研究人員比較了來自大豆、擬南芥和水稻同源基因的circRNAs發(fā)現(xiàn)，大豆和擬南芥之間有685對circRNAs高度同源，大豆和水稻之間有1 095對circRNAs高度同源，三者之間有551對circRNAs高度同源［13］。但物種間的保守性也具有差別，如Chen等［29］的研究表明，玉米2 804個circRNAs中與擬南芥和水稻間的保守性就非常低，分別為3對和47對。

（3）植物circRNAs具有組織/發(fā)育特異性表達的特點，在特定的組織、細胞類型或發(fā)育階段circRNAs的表達通常存在差異［30］。Zhao等［13］研究了大豆不同組織中circRNAs的表達模式，在大豆中共鑒定出5 372個circRNAs，其中葉、根、莖分別為776個、3 171個和2 165個，3個組織中相同circRNAs比例不足3.0%，而各組織中的特異表達的分別為49.3%、30.6%和9.0%。在沙棘果實形成的3個不同階段，綠熟期、破色期、黃熟期，鑒定得到的2 616個circRNAs中，3個階段檢測到的circRNAs總數(shù)分別為1 580、1 646 和1 340個，其中差異表達有252個，每個階段特異性表達的circRNAs分別為 52、38和 30個［19］。circRNAs的這些特性，有助于其作為潛在的生物標志物進行鑒定和進一步的研究應用。

2 植物circRNAs的生物學功能

盡管研究證明circRNAs在真核生物中是普遍存在的，但其對生命體的功能在很大程度上仍不清楚。不過，越來越多的證據(jù)表明，circRNAs可能在各種生物過程中發(fā)揮重要的功能作用，如與miRNA、蛋白結合，參與轉錄及轉錄后調(diào)控等［31-34］。circRNAs具有的生物學功能如圖2所示［23］。

圖2 circRNA的功能Fig.2 circRNA functions

2.1 作為miRNA的海綿

含有多個miRNA結合位點并抑制miRNA活性的轉錄本被稱為miRNA海綿。根據(jù)之前的動物研究結果，circRNAs最顯著的功能是充當miRNA海綿或參與miRNA相關通路來調(diào)控基因的表達［31，35-36］。雖然植物中的circRNAs大多不具有大量的miRNA結合位點，但也可以作為miRNA海綿，并通過結合miRNA來調(diào)節(jié)基因表達。Lu等［26］對水稻的研究表明，共有235個circRNAs具有miRNA結合位點，其中31個circRNAs具有兩個或更多推定的miRNA結合位點。Zeng等［37］研究了枸橘早花突變體，與野生型相比，共發(fā)現(xiàn)176個差異表達的circRNAs，其中29個circRNAs可以作為16個miRNA的潛在靶標。Capelari等［27］在擬南芥花中鑒定了5個可能具有miRNA海綿功能的circRNAs，并通過PCR和測序技術對其中一個進行了驗證。Zhou等［38］利用CRISPR-Cas9基因編輯工具獲得水稻4種單個circRNA的無效突變體（null mutant），對4種無效突變體植株表型驗證發(fā)現(xiàn)，突變體后代表現(xiàn)出耐鹽性提高或者種子萌發(fā)后生長速度加快、幼苗葉綠素A/B含量較高等特點，通過構建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)突變體通過結合一個重要的保守miRNA發(fā)揮了表型調(diào)控作用，結果表明，circRNA去除可以釋放對應大量的miRNA，進而影響植株的性狀。circRNAs通過與miRNA相互作用，發(fā)揮其在多種生物過程中的調(diào)控作用，包括代謝過程、發(fā)育過程、生殖過程、非生物和生物應激反應，這些功能可通過交聯(lián)免疫沉淀和高通量測序做進一步驗證［39］。

2.2 參與植物應激反應

研究表明，非編碼RNA可直接與DNA、RNA和蛋白質相互作用，調(diào)控環(huán)境應答基因的表達［40-42］。植物circRNAs廣泛參與包括病原入侵、干旱、寒冷、熱、營養(yǎng)缺乏等生物脅迫和非生物脅迫應答過程。在植物circRNAs參與生物脅迫應答中，Wang等［43］研究感染了番茄黃葉卷曲病毒（TYLCV）的植株，在TYLCV感染的樣本鑒定出83個特異性表達的circRNAs，其中約62%的circRNAs來源于蛋白質編碼基因的外顯子，并且發(fā)現(xiàn)這些circRNAs在TYLCV感染中起負調(diào)控作用以降低植株中病毒的積累。研究人員采用RNA測序技術，對接種過丁香假單胞菌的獼猴桃不同類群葉片的circRNAs進行了鑒定，共鑒定出584個差異表達的circRNAs，其中外顯子和內(nèi)含子circRNAs都與親本蛋白編碼基因顯著正相關，而且與外顯子circRNAs相比，內(nèi)含子circRNAs是一類非常顯著的親本基因調(diào)控因子。研究還發(fā)現(xiàn)了一組與植物防御反應密切相關的circRNAs，表明circRNAs在植物免疫應答中發(fā)揮重要作用［21］。Xiang等［44］研究了棉花感染黃萎病后circRNAs的表達情況，在構建的黃萎病抗性植株與易感植株中共鑒定出了280個差異表達的circRNAs，這些差異表達的circRNAs中有247個可以找到其親本基因，NCBI的保守域分析顯示，13個具有非冗余親本基因且與防御反應有關的circRNAs其親本基因中有11個為NBS（nucleotide binding site）家族基因，并含有與抗病相關的NB-ARC結構域，因此推測NBS家族基因可能對棉花黃萎病具有一定的抗性，并且在棉花抗病過程中可能受到circRNAs的調(diào)控。

此外，circRNAs也廣泛參與植物非生物脅迫反應，包括營養(yǎng)缺乏、強光、高溫、寒冷、干旱或鹽等。近年在該方向的研究報道較多。Wang等［45］對低溫脅迫下大豆circRNAs進行了全基因組鑒定，研究結果表明，circRNAs在響應低溫脅迫時表現(xiàn)出特定的表達模式。在鑒定出的749個circRNAs中，對照組（25℃）檢測到451個，實驗組（4℃）檢測到546個，其中特異性表達的數(shù)量分別為203個和298個。另外，顯著差異表達的13個circRNAs與親本基因的表達水平呈顯著正相關，這表明circRNAs可能通過順式調(diào)控親本基因在低溫應答調(diào)控中發(fā)揮關鍵作用。通過GO（gene ontology）分類及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析等繪制了gma_circ_0000569及gma_circ_0000741在冷脅迫下的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡示意圖（圖3）［45］。Liu等［46］鑒定了楊樹在低氮脅迫下circRNAs的表達譜，其中163個（約6.5%）在低氮條件下顯著差異表達，且其表達模式與其宿主蛋白編碼基因之間存在正相關。同時，通過circRNA-microRNA-mRNA網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)上調(diào)的 circRNA1006、circRNA1344、circRNA1941、circRNA901和circRNA146可通過miR5021成員介導使MYB61轉錄水平升高，這與低氮處理楊樹木材中木質素濃度升高相對應。進一步證明circRNAs在調(diào)控楊樹于低氮環(huán)境下的基因表達發(fā)揮了重要作用。番茄葉片在干旱、高溫及二者共同脅迫下，與對照組相比，分別有4、7和9個circRNAs發(fā)生差異表達。這些circRNAs在光合作用、淀粉和蔗糖代謝、RNA轉運、RNA降解等方面發(fā)揮作用［47］。同時，大豆在低磷［48］及干旱［49］、杜梨在干旱［20］、番茄在低溫［50］及高溫［51］、玉米和擬南芥在干旱等環(huán)境脅迫下其circRNAs也存在特異性的變化，且有過表達實驗證實了circRNAs所具有的調(diào)控潛力［52］，因此植物在非生物脅迫下通過調(diào)控circRNAs表達進一步影響宿主基因表達，可能是植物應對非生物脅迫的方式之一。表2列出了近年circRNAs在植物應激反應中的相關研究。

表2 circRNAs在植物應激反應中的研究（2017-2020）Table 2 Studies on plant circRNAs in responding to biotic or abiotic stresses（2017-2020）

圖3 大豆circRNAs-gma_circ_0000569及gma_circ_0000741在冷脅迫下的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡Fig.3 Regulation network of circRNAs-gma_circ_0000569 and gma_circ_0000741 of soybean under cold stress

2.3 調(diào)控親本基因表達

越來越多的研究表明circRNAs可通過影響其線性副本及調(diào)節(jié)其親本基因的轉錄來參與基因表達調(diào)控［53］。Huang等［14］研究了在水稻劍葉衰老過程相關circRNAs的表達情況，通過加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）發(fā)現(xiàn)，有6個連續(xù)下調(diào)表達的circRNAs，18個連續(xù)上調(diào)表達的circRNAs和15個轉折點高表達的circRNAs與葉片衰老高度相關。此外，共有17個與衰老相關的circRNAs被預測具有親本基因，其中3種circRNAs對其親本基因的調(diào)控利用RT-qPCR得以驗證。在擬南芥中，源于SEPALLATA3（SEP3）基因的circSEP3可以與其同源基因座緊密結合，并形成一個RNA∶DNA雜交產(chǎn)物，該產(chǎn)物導致轉錄暫停，并導致具有外顯子跳躍性的選擇性拼接SEP3 mRNA的形成，進而調(diào)控SEP3的表達。研究人員進一步利用轉基因技術過表達SEP3基因第6外顯子形成的1個circRNA，結果導致了花器官表現(xiàn)出更少的雄蕊和更多的花瓣，這與直接過表達SEP3.3（缺少外顯子6）表型一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，來源于SEP3基因第6個外顯子形成的circRNA可與其DNA 座形成R-loop結構，并增加可變剪接體SEP3.3的表達［54］。Xu等［16］對與小麥根系長度相關的circRNAs進行了研究，鑒定了10個與對照組根系顯著差異表達的circRNAs，其中3個circRNAs具有多個推測的miRNA結合位點。通過實時熒光定量PCR進一步驗證表明，具有結合miRNAs的8個circRNA中，有6個在長根小麥和短根小麥之間的表達水平存在顯著差異。Tan等［55］在番茄中過表達來自八氫番茄紅素合成酶1（PSY1）基因的circRNA，考查后代株系中果實顏色的變化情況，結果表明，過表達該circRNA后代果實有一定比例呈現(xiàn)了黃色，且黃色果實中的番茄紅素和β-胡蘿卜素的積累量均顯著下降。同時，該轉基因株系中PSY1的mRNA表達量也呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。這項研究表明過表達circRNA后，對應的線性mRNA表達量下調(diào)，可能是導致轉基因株系出現(xiàn)異常表型的原因。

2.4 circRNAs作為生物標志物

circRNAs在植物不同組織細胞中普遍存在，且在不同的物種中具有進化保守性，并表現(xiàn)出特定的表達模式，同時具有的高穩(wěn)定性、高豐度等特性，使其具有成為生物標志物的潛質。到目前為止，研究表明circRNAs已經(jīng)與多種人類疾病相關，包括糖尿?。?6-57］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?8-59］、心血管疾?。?0］、慢性炎癥疾病［61-62］和癌癥［63-64］等。同時，在多種癌癥診斷［65-67］、癌癥治療效果監(jiān)測［68-70］及預后評估［71-72］等方面有望成為癌癥診斷和分子靶向治療的新分子標志物。

在植物研究中，人們很早就開始探索生物標志物在植物育種中的應用潛能。如Yang等［73］研究了玉米在氮有限、氮充足以及氮匱乏過程中植株的轉錄反應，發(fā)現(xiàn)在玉米轉錄組中有約7%的轉錄組對氮反應敏感，進一步利用復合基因表達評分系統(tǒng)確定了可以定量地評估植物對不同氮條件響應的基因表達譜，這種獨立于基因型、發(fā)育階段、組織類型或環(huán)境的基因表達模式比表型觀察更快速，對于縮短育種周期具有很大幫助。但是，植物研究中以circRNAs作為生物標志物目前處于起步階段。Gao等［18］對一年生的葡萄枝條進行冷脅迫處理，考查了4℃條件下處理0、4、12 h樣本circRNAs的表達情況。采用find_circ、CIRI及CIRCexplorer三種circRNA檢測工具，在葡萄葉片中共鑒定出475個差異表達的circRNAs。對差異表達的circRNAs進行GO分類及KEGG注釋發(fā)現(xiàn)，這些circRNAs的靶基因主要參與對寒冷的響應、光合作用、不飽和脂肪酸生物合成過程以及在光合系統(tǒng)II中參與光合電子傳遞。同時，該研究選取了一個來源于3-磷酸甘油?；D移酶（ATS1）且表達量豐富的circRNA：VvcircATS1并在擬南芥中進行了過表達實驗，結果發(fā)現(xiàn)，過表達植株在應對寒冷脅迫方面的能力明顯增強，并且葉綠素含量也遠高于對照組。進一步對擬南芥進行4℃處理24 h，測序結果表明該circRNA參與調(diào)控多個與耐寒性及刺激相關基因的miRNA的表達。該研究為闡明circRNAs如何調(diào)節(jié)植物冷應激反應及葡萄中circRNAs的生物學功能提供了參考。Zhang等［52］研究了玉米和擬南芥在干旱條件circRNAs的響應情況，研究發(fā)現(xiàn)大量與干旱相關的circRNAs宿主基因在干旱反應中呈現(xiàn)保守的或物種特異性。在玉米幼苗中，與編碼鈣依賴蛋白激酶和細胞分裂素氧化酶/脫氫酶基因有關circRNAs的表達水平與耐旱性密切相關，表明circRNAs在玉米干旱反應中發(fā)揮重要作用，或可能作為耐旱性玉米育種的生物標志物。同時，過表達circGORK（保衛(wèi)細胞外向整流K+通道）的擬南芥植株對脫落酸敏感，但對干旱不敏感，表明circGORK在抗旱中發(fā)揮了積極作用。說明circRNAs可作為作物抗旱性遺傳改良的有效生物標志物。

circRNAs作為植物生物標志物仍是一個新概念，但由于其半衰期長，不易降解，同時檢測也具簡便性和特異性，因此，未來有著廣泛的應用前景。

3 總結與展望

近十年來，在人類疾病及動物研究方面，circRNAs的生物合成和分子功能研究取得了很大的進展，許多circRNAs的生物功能得以明確。circRNAs的表達通常與細胞類型、組織和發(fā)育階段有關，而且在動物和植物中也具有脅迫誘導表達的特性，這表明circRNAs可能代表了轉錄后基因調(diào)控的一個新層面［74］。越來越多的研究已經(jīng)證實circRNAs在真核生物中普遍存在，但是其形成機制、功能特性及相應的作用機制還有待進一步研究。未來植物circRNAs的研究可以從以下幾個方面進一步開展：（1）circRNAs的功能研究。關于circRNAs最新的研究進展已經(jīng)揭示其在生物學功能中的重要作用，但我們需要更多地了解circRNAs在植物生長發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫等過程中circRNAs的調(diào)節(jié)功能?，F(xiàn)有的可用于circRNAs功能驗證的方法，如構建circRNAs無效突變體、circRNAs過表達載體等，未來隨著單細胞測序技術［75］、數(shù)字空間分析（Digital Spatial Profiling）［76］和牛津納米孔測序技術（Oxford NanoporeMinION）［77-78］更多地應用于circRNAs定量及表征上，circRNAs的功能解析將取得更大的進展。（2）circRNAs的降解機制。目前對circRNAs的形成機制了解相對充分，但是circRNAs在生物體內(nèi)是通過何種途徑被降解的還不清楚?，F(xiàn)有的降解組測序技術只適用于線性轉錄本，要想更清楚的解析circRNAs的降解機制，還需要開發(fā)更有針對性的方法。（3）circRNAs作為生物標志物的可行性驗證及應用。在透徹了解circRNAs的基礎上，明晰其作為生物標志物的可行性，將在作物育種、抗逆改良等方面發(fā)揮重要的作用?；谝陨希谥参颿ircRNAs領域還有許多需要探索和解析的問題，期待在眾多研究者的不懈努力下，不久的將來取得更加有意義的研究發(fā)現(xiàn)。