邱小燕， 肖深根，王依清，李自強(qiáng)，陳陽(yáng)峰，向助文

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省瑤茶工程技術(shù)研究中心，湖南溆浦 419300；3.湖南翱康生物科技有限公司，湖南溆浦 419300；4.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化 418000）

隨著生活水平的提升，糖類物質(zhì)過(guò)量攝取所引起的肥胖、糖尿病和齲齒等疾病越來(lái)越普遍，已成為一大社會(huì)問(wèn)題。因而高甜、低熱量、口感好、綠色健康的天然甜味劑受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，是目前甜味劑行業(yè)的熱點(diǎn)，對(duì)特色甜味資源植物進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用，也是促進(jìn)天然甜味劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要舉措[1]。

木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun），俗稱甜茶、溆浦瑤茶，唐代陸羽在茶經(jīng)里記載“辰州溆浦縣蠻俗當(dāng)吉慶之時(shí)，親族聚會(huì)，歌舞于山上，山多茶樹(shù)”，其味甘甜持久、香氣濃郁[2]。木姜葉柯在2017 年被批準(zhǔn)為新食品資源植物，在2019 年被批準(zhǔn)為“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”。木姜葉柯是一種高甜、低熱、無(wú)毒的天然甜味劑植物，其甜味成分為二氫查爾酮類物質(zhì)，甜味成分含量高，主要為三葉苷、根皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮、根皮素、3 -羥基根皮苷，其含有的新橙皮二氫查爾酮，不需要合成，直接可以提取[3-4]。木姜葉柯是適應(yīng)性較強(qiáng)的速生喬木，生物量大，植株萌發(fā)力強(qiáng)，嫩葉被采摘后又從葉腋中生長(zhǎng)出新枝條，即使砍伐整個(gè)植株，又能從根部萌發(fā)出多個(gè)新的枝條，這種生物特性為其作為甜味劑的開(kāi)發(fā)利用提供了資源保證，木姜葉柯作為新型天然甜味劑的開(kāi)發(fā)潛力巨大。

1 木姜葉柯主要甜味成分的性質(zhì)和特征

木姜葉柯甜味成分為二氫查爾酮類物質(zhì)，主要有三葉苷、根皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮、根皮素、3 -羥基根皮苷，是一類具有苯并色原酮母核結(jié)構(gòu)的化合物。木姜葉柯主要甜味成分的性質(zhì)為三葉苷（Trilobatin），分子式為C21H24O10，分子量為436.41，淺黃色結(jié)晶性粉末，無(wú)吸濕性，易溶于熱水、乙醇，微溶于冷水，甜度為蔗糖的300 倍以上，已被世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織，食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（JECFA）收錄（#2171），被美國(guó)食用香料與提取物制造協(xié)會(huì)（FEMA）列為公認(rèn)安全物質(zhì)（GRAS）（＃4674）。根皮苷（Phlorizin），又稱4,6 -二羥基-2 -（6 -葡萄糖酸苷）-6 -（對(duì)羥基苯）苯丙酮，其分子式為C21H28O12，分子量為472.44，微黃色針狀結(jié)晶體，含量低時(shí)水溶性好，含量高時(shí)難溶于水，根皮苷是由根皮素和配糖體為葡糖苷結(jié)合成的苷，甜度為蔗糖的300 倍左右。新橙皮苷二氫查耳酮（Neohesperidin dihydrochalcone），其分子式為C28H36O15，分子量為612.58，白色針狀結(jié)晶性粉末，有很強(qiáng)的甜味，無(wú)吸濕性，熔點(diǎn)152～154 ℃，不溶于乙醚，溶于水，溶于稀堿液，已被收錄于我國(guó)GB 2760—2007 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（I1297），并被美國(guó)FDA 列為公認(rèn)的無(wú)毒化合物，甜味高、熱量小，甜味慢、時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定好、無(wú)毒性，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，甜度為蔗糖的1 500～1 800 倍。根皮素（Phloretin），又名3-（4-羥基苯基）-1-（2、4、6-三羥基苯基）-1 -丙酮，其分子式為C15H14O5，分子量為274.27，淺黃色至純白色粉末，溶于甲醇、乙醇和丙酮，幾乎不溶于水，已被收錄于我國(guó)GB 1886.261—2016 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，甜度為蔗糖的300倍左右。3 -羥基根皮苷，分子式為C21H24O11，分子量為452.41，甜度為蔗糖的300 倍左右。

木姜葉柯中的主要甜味成分見(jiàn)表1。

表1 木姜葉柯中的主要甜味成分

2 木姜葉柯中主要甜味成分積累規(guī)律

2.1 三葉苷的積累規(guī)律

目前，已經(jīng)有不少學(xué)者對(duì)木姜葉柯中三葉苷積累規(guī)律進(jìn)行了研究，但是不同學(xué)者得到的結(jié)果差異較大。游曉瑩[5]研究了華南植物源及羅浮山2 個(gè)不同采摘地點(diǎn)，不同時(shí)間的木姜葉柯嫩葉中三葉苷含量變化和生物積累規(guī)律，結(jié)果表明7 月采收的木姜葉柯中三葉苷含量最高，4 月次之，8 月至10 月均未被檢出，三葉苷含量在0～4.5%變動(dòng)。徐蘭芳[6]研究表明，惠州木姜葉柯中三葉苷的含量在5 月份含量最高達(dá)6.06%。張亞洲等人[7]研究表明，茶葉制品與鮮葉中的三葉苷含量比老葉與枝條中的高，高達(dá)24.35%。何平等人[8]研究表明，四川米易的三葉苷含量最高為2.99%。王坤等人[9]研究表明，三葉苷含量最高的資源為重慶，嫩葉中高達(dá)31.41%。因此，需要從不同種源、不同采收期、不同葉齡、不同樹(shù)齡等角度對(duì)木姜葉柯三葉苷的積累規(guī)律有一個(gè)系統(tǒng)的研究。

2.2 根皮苷的積累規(guī)律

目前，也有不少學(xué)者對(duì)木姜葉柯中根皮苷的積累規(guī)律進(jìn)行了研究，但不同學(xué)者得到的結(jié)果差異較大，甚至得到相反的規(guī)律。何平等人[8]研究表明，木姜葉柯中根皮苷的含量在一年中隨著季節(jié)的推移呈先上升后下降的趨勢(shì)，秋季含量達(dá)到最高，往年生老葉根皮苷含量比當(dāng)年生嫩葉中的根皮苷含量高。而李勝華等人[10]研究則表明，木姜葉柯嫩葉中的根皮苷含量較一年生和兩年生老葉中的含量都高，而且隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，隨之降低。楊旭等人[11]研究了不同種源木姜葉柯中根皮苷含量，表明當(dāng)年生嫩葉根皮苷含量最高為江西安福（3.53%），最低的為湖南溆浦（0.46%），往年生老葉根皮苷含量最高為重慶酉陽(yáng)（20.71%），最低5.92%（湖北利川）。因此，同樣需要從不同種源、不同采收期、不同葉齡、不同樹(shù)齡等角度對(duì)木姜葉柯根皮苷的積累規(guī)律有一個(gè)系統(tǒng)的研究。

2.3 新橙皮苷二氫查爾酮、根皮素及3 -羥基根皮苷的積累規(guī)律

木姜葉柯中新橙皮苷二氫查爾酮、根皮素及3 -羥基根皮苷的積累規(guī)律研究比較少。楊旭等人[11]研究了不同種源、不同葉齡木姜葉柯中的新橙皮苷二氫查爾酮和根皮素含量變化，結(jié)果表明，當(dāng)年生葉片中新橙皮苷含量最高的為江西安福（1.25%）、最低為重慶酉陽(yáng)（0.02%），往年生葉片中新橙皮苷含量最高的為重慶梁平（0.023%）、最低為湖南芷江（0.003%）。柑橘類植物中僅能提取新橙皮苷和柚皮苷，再通過(guò)開(kāi)環(huán)氫化合成新橙皮苷二氫查耳酮，木姜葉柯葉片中新橙皮苷二氫查耳酮不需要化學(xué)合成，可直接提取獲得。當(dāng)年生嫩葉中根皮素含量最高的為湖北利川（4.03%）、最低為四川廬山（0.01%），往年生葉片根皮素含量最高為湖北長(zhǎng)陽(yáng)（0.06%）、最低為四川廬山（0.01%）。徐蘭芳[6]研究表明木姜葉柯中的3-羥基根皮苷在3 月、6 月、10 月達(dá)到峰值，3-羥基根皮苷與根皮苷可能存在一定的生物互相轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)年生葉片中根皮素和新橙皮苷二氫查耳酮含量存在著極大的差異，變異系數(shù)在93.43～325.8，往年生葉片中各有效成分含量的變異系數(shù)有所降低。不同種源木姜葉柯存在著豐富的遺傳變異，可為種源的收集、分類和良種選育提供理論依據(jù)。

3 木姜葉柯主要甜味成分的代謝途徑

木姜葉柯中的主要甜味成分三葉苷、根皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮、根皮素、3 -羥基根皮苷均為二氫查爾酮類化合物。

根皮苷和黃酮類的生物合成途徑[12-13]見(jiàn)圖1。

圖1 根皮苷和黃酮類的生物合成途徑

由圖1 可知，二氫查爾酮是黃酮代謝路徑的分支，在生物體內(nèi)，乙酰輔酶A 首先合成丙二酸單酰輔酶A，莽草酸途徑獲得的苯丙氨酸合成對(duì)香豆酰輔酶A。對(duì)香豆酰輔酶A 合成4 -羥基二氫肉桂酰輔酶A，4 -羥基二氫肉桂酰輔酶A 通過(guò)查爾酮合酶合成根皮素，根皮素通過(guò)糖基化酶作用，在其上2’位上糖基化形成根皮苷[12-13]。根皮素是二氫查爾酮的重要苷元，但是苷元在蘋(píng)果屬植物體內(nèi)通常不會(huì)大量累積，根皮素在各種糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下進(jìn)一步形成二氫查耳酮類的糖苷，如根皮苷、三葉苷，糖苷衍生物進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生羥基化的衍生物，如3 -羥基根皮苷、3 -羥基根皮素[14]。

4 木姜葉柯主要甜味成分的提取方法

目前，已發(fā)現(xiàn)的木姜葉柯甜味成分提取技術(shù)主要包括超聲輔助提取、熱水提取、大孔樹(shù)脂吸附法、堿法等，其中超聲輔助+大孔樹(shù)脂吸附法應(yīng)用的最多。李愛(ài)民等人[15]研究超聲波提取和樹(shù)脂純化多穗柯葉中甜味劑的方法，超聲波最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1 ∶25，超聲時(shí)間35 min；AB-8 型樹(shù)脂最佳純化工藝條件為吸附流速0.5 mL/min，洗 脫乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，洗脫體積1.875 BV，洗脫劑流速1 mL/min。在此提取及純化條件下，得到根皮苷的純度為88.62%，新橙皮苷二氫查爾酮的純度為71.82%。孫印石等人[16]得到一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，通過(guò)將粉碎后的三葉苷原料以料液質(zhì)量比1∶10～1∶50，加入體積分?jǐn)?shù)為30%～90%的乙醇，加熱回流分離，分離液過(guò)濾，分離出濾渣和濾液，將濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，得分離物；將分離物加水溶解，并用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏；將乙酸乙酯浸膏采用高速逆流色譜法分離，得到天然甜味劑。黃志等人[17]研究了多穗石柯天然甜味劑的制作方法，第一步：對(duì)多穗石柯新鮮葉片和枝條經(jīng)清洗、烘干和粉粹操作，得到多穗石柯粉體；第二步：將經(jīng)第一步獲得的多穗石柯粉浸泡于1.6%氫氧化鈣溶液中，多穗石柯粉與氫氧化鈣液體的比例為1∶9，預(yù)煮時(shí)間10 min，在功率為800 W 的微波下處理25 min，將微波提取到的液體置以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心機(jī)中離心處理2 min，得到上清液和沉淀物；第三步：將第二步中得到的沉淀物進(jìn)行超聲波萃取處理，將超聲波萃取處理后的液體置以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心機(jī)中離心處理3～5 min，得到上清液和殘?jiān)坏谒牟剑翰捎么罂孜綐?shù)脂AB-8 型進(jìn)行分離純化處理，最后得到多穗石柯甜味劑，此發(fā)明能夠徹底地提取多穗石柯葉片和枝條中的甜味劑，且甜味劑提取效率高且純度高。

5 木姜葉柯作為新型天然甜味劑開(kāi)發(fā)存在的問(wèn)題

木姜葉柯新型甜味劑開(kāi)發(fā)主要存在以下問(wèn)題：一是分離純化技術(shù)水平落后，精深加工水平低。落后的分離純化技術(shù)導(dǎo)致我國(guó)只能為發(fā)達(dá)國(guó)家食品行業(yè)提供基本原材料，附加值低。二是缺乏基于木姜葉柯新型甜味劑的無(wú)糖健康食品的開(kāi)發(fā)技術(shù)。雖然可口可樂(lè)等食品行業(yè)巨頭紛紛推出了天然代糖新產(chǎn)品，起到減糖不減甜的效果，但是到目前為止，市場(chǎng)上還沒(méi)有一款無(wú)糖新產(chǎn)品能夠完全替代蔗糖，天然無(wú)糖新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)技術(shù)還有待提升。三是木姜葉柯矮化栽培面積不廣。木姜葉柯屬于常綠喬木，自然狀態(tài)下植株高大、散生，采葉不方便，人工矮化栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用在生產(chǎn)上有重要意義。

6 木姜葉柯作為新型天然甜味劑植物開(kāi)發(fā)的優(yōu)勢(shì)

由于天然甜味劑的開(kāi)發(fā)要求較高，產(chǎn)品的安全檢測(cè)較為嚴(yán)格。因此，目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)并應(yīng)用的天然甜味劑產(chǎn)品較少，主要有甜菊糖苷、新橙皮苷、羅漢果甜苷、甘草甜素、甜茶素。其中，羅漢果中的羅漢果甜苷含量只有1%，羅漢果甜苷V 只有0.43%[18]，與羅漢果相比，木姜葉柯中的甜味成分含量高，采摘修剪后可以快速長(zhǎng)出新葉，葉片可以大量獲取，資源優(yōu)勢(shì)明顯。柑橘類植物中僅能提取新橙皮苷和柚皮苷，再通過(guò)開(kāi)環(huán)氫化合成新橙皮苷二氫查耳酮，木姜葉柯葉片中新橙皮苷二氫查耳酮不需要化學(xué)合成，可直接提取獲得[11]，這些都是木姜葉柯作為新型天然甜味劑植物開(kāi)發(fā)的優(yōu)勢(shì)。

幾種天然甜味劑植物的比較見(jiàn)表2。

表2 幾種天然甜味劑植物的比較

7 結(jié)語(yǔ)

中國(guó)是世界上最大的甜味劑生產(chǎn)國(guó)，甜味劑市場(chǎng)巨大，人工合成甜味劑帶來(lái)的健康問(wèn)題逐漸引起人們的重視，天然甜味劑的開(kāi)發(fā)與研究在國(guó)內(nèi)外越來(lái)越受到重視，木姜葉柯是一種發(fā)展前景很大的新型天然甜味劑植物，具有低熱量、高甜度、甜味成分含量高、資源優(yōu)勢(shì)明顯等優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)潛力巨大。