沈 月,欒鳳蘭,邢桂紅,陳麗君

(江蘇省腫瘤醫(yī)院 ,江蘇 南京 210009)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，對(duì)傷口敷料的要求也隨之提高，傳統(tǒng)棉麻和紗布敷料在使用的過程中，受滲透液的影響，可能與傷口發(fā)生粘連，在去除敷料時(shí)，可能對(duì)傷口造成二次傷害。有研究提出將抗菌水凝膠應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的傷口敷料中[1]；通過化學(xué)交聯(lián)方法，制備出一種新型水凝膠傷口敷料[2]。結(jié)果表明：水凝膠傷口敷料，在生物相容性方面優(yōu)于傳統(tǒng)傷口敷料；但制作的水凝膠敷料在抗菌性方面還存在不足；又有研究表明，部分天然多糖具有穩(wěn)定性高、無毒、抗菌性能優(yōu)異、可降解等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛[3]。針對(duì)目前水凝膠敷料的現(xiàn)狀，本文在文獻(xiàn)[3]的研究基礎(chǔ)上，嘗試將白及多糖溶入水凝膠敷料內(nèi)，制備一種具有較好理化性能和生物性能的新型傷口敷料，為傷口敷料的發(fā)展提供一些數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1主要材料

無水乙醇(濟(jì)南豪坤化工有限公司,AR)、聚乙二醇(PEG)(濟(jì)南泉?jiǎng)倩び邢挢?zé)任公司,AR)、白及塊莖(成都拓青農(nóng)業(yè)有限公司,標(biāo)準(zhǔn))、異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)(濟(jì)南云佰匯生物科技有限公司,AR)、二羥甲基丙酸(DMPA)(濟(jì)南匯錦川商貿(mào)有限公司,CP)、一縮二乙二醇(DEG)(濟(jì)寧三石生物科技有限公司,AR)、丙酮(AC)(南京合誠(chéng)化工有限公司,AR)。

1.1.2主要設(shè)備

HH-1恒溫水浴鍋(無錫瑪瑞特科技有限公司)、LM321旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(山東龍煤工礦機(jī)械有限公司)、GT10-2高速離心機(jī)(北京新時(shí)代北利醫(yī)療器械有限公司)、GeminiSEM 560場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(蘇州沃弗本精密機(jī)械有限公司)、TFDH-1冷凍干燥機(jī)(諸城市恒濱機(jī)械有限公司)、DTC-27C超聲清洗機(jī)(湖北鼎泰高科有限公司)、FPOST-IROS-05傅里葉紅外光譜儀(博爾儀器儀表(天津)有限公司)、GL1004C電子天平(南京貝登醫(yī)療股份有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1白及多糖(BSP)的提取

(1)粉碎白及塊莖，得到粗白及粉末。稱取40 g白及粉末，用200 mL無水乙醇浸泡，浸泡時(shí)間為12 h；

(2)過濾后用400 mL去離子水中浸泡過濾產(chǎn)物，并恒溫浸提，浸提溫度和時(shí)間分別為80 ℃和4 h。過濾4次后取出濾液，重復(fù)以上步驟3次，收集所有濾液；

(3)將濾液濃縮至原體積的1/3，蒸發(fā)溫度為55 ℃；然后將五分之一體積的Sevage試劑放入蒸發(fā)后濾液中，充分振蕩使之混合均勻，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心處理10 min，取出上清液加入3倍無水乙醇，靜置沉淀12 h。重復(fù)沖洗沉淀步驟3次，冷凍干燥，得到白及多糖(BSP)。

1.2.2雙鍵封端水性聚氨酯(WBPU)的制備

(1)將15 g脫水后的聚乙二醇和聚己內(nèi)酯(PCL)放入四口燒杯，緩慢加入13.32 g異佛爾酮二異氰酸酯，提高反應(yīng)溫度至90 ℃反應(yīng)3 h；

(2)降低體系溫度至50 ℃，分別將1.69 g二羥甲基丙酸、2.17 g一縮二乙二醇和少量丙酮放入四口燒瓶中，升溫至80 ℃反應(yīng)1 h，降溫至50 ℃；

(3)分別滴入2滴T9和T12，升溫至70 ℃催化反應(yīng)4 h。根據(jù)體系黏度選擇是否加入丙酮，對(duì)體系黏度進(jìn)行調(diào)節(jié)，繼續(xù)將體系溫度降至50 ℃，加入10 mL丙酮和計(jì)量聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMA)剩余異氰酸酯基(—NCO)進(jìn)行封端反應(yīng)，反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為66 ℃和2 h；將體系溫度降至40 ℃，加入1.2 mL三乙醇胺(TEA)進(jìn)行中和，中和時(shí)間為3 min；

(4)在攪拌條件下緩慢加入H2O進(jìn)行乳化，攪拌速度和乳化時(shí)間分別為1 300 r/min和10 min，得到水性聚氨酯(WBPU)乳液。

1.2.3聚氨酯/白及多糖水凝膠(WBPU-BSP)的制備

(1)提前對(duì)WBPU乳液進(jìn)行脫丙酮處理，然后稀釋成固含為15%的乳液；

(2)分別在6個(gè)燒杯中放入13.33 g的WBPU乳液，分別加入10 g的H2O、0.03 g過硫酸鉀 (KPS)、0.08 g的PEGDA、4 g丙烯酰胺(AM)和不同質(zhì)量的BSP，混合均勻后用超聲清洗機(jī)分散0.5 h；

(3)將其置于恒溫水浴鍋中70 ℃反應(yīng)4 h，得到不同白及多糖含量的WBPU-BSP水凝膠；

(4)將WBPU-BSP水凝膠放入去離子水進(jìn)行浸泡7 d，間隔12 h換水；然后冷凍干燥處理，得到WBPU-BSP干凝膠。BSP添加量如表1所示。

表1 WBPU-BSP中BSP添加量Tab.1 BSP addition in wbpu-bsp

1.3 性能測(cè)試

1.3.1掃描電鏡測(cè)試

將經(jīng)過凍干處理凝膠樣品低溫脆斷，在截面噴金后用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡以5 kV的加速電壓對(duì)凝膠樣品形貌進(jìn)行觀察。

1.3.2模擬體液溶脹性能測(cè)試

參照標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0471.1—2004配制模擬體液，將經(jīng)過干燥的大小、質(zhì)量相近的干凝膠塊置于37 ℃溫度的模擬體液中浸泡，間隔t時(shí)刻后取出稱重，繼續(xù)浸泡稱重過程，直至質(zhì)量不發(fā)生變化，即可認(rèn)為達(dá)到溶脹平衡。

溶脹比(S)表達(dá)式[4]：

(1)

式中:m0、mt分別為干凝膠和t時(shí)刻水凝膠的質(zhì)量。

1.3.3水凝膠保水性能試驗(yàn)

將大小、質(zhì)量、達(dá)到溶脹平衡的水凝膠樣品放置在溫度37 ℃環(huán)境中，間隔t時(shí)刻后稱重，直至樣品質(zhì)量不發(fā)生變化。

水凝膠保水率(SR)表達(dá)式[5]：

(2)

式中：me為溶脹平衡時(shí)水凝膠的質(zhì)量。

1.3.4抗菌性能試驗(yàn)

參照 GB/T 20944—2007，測(cè)定水凝膠樣品對(duì)大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌性能進(jìn)行測(cè)定，用瓊脂平皿擴(kuò)散法評(píng)估2種細(xì)菌的活性[6]。

1.4 動(dòng)物試驗(yàn)

選擇體重約為30 g的雌性ICR小鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。在小鼠背部制造8 mm的全層傷口，分別用凡士林紗布和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%BSP的WBPU-BSP水凝膠敷料覆蓋小鼠傷口，并用無菌紗布進(jìn)行包扎；然后將小鼠放入同樣的環(huán)境培養(yǎng)，觀察小鼠傷口愈合情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM分析

圖1為水凝膠樣品的SEM照片。由圖1可知，在WBPU-BSP水凝膠中，加大BCP摻入量，水凝膠樣品逐漸轉(zhuǎn)化成致密均勻的多孔結(jié)構(gòu)，當(dāng)BCP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，樣品孔洞又轉(zhuǎn)變成較為松散不均勻的大孔結(jié)構(gòu)。當(dāng)BCP含量較多時(shí)，WBPU-BSP體系內(nèi)黏度較大，在固化成為水凝膠的過程中，形成了部分孔洞結(jié)構(gòu)；當(dāng)進(jìn)一步冷凍干燥處理時(shí)，又變成了較為松散的大孔洞[10]。當(dāng)WBPU-BSP水凝膠中BSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，水凝膠的多孔結(jié)構(gòu)最致密均勻。

圖1 WBPU-BSP水凝膠樣品的SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM photographs of hydrogel samples

2.2 WBPU-BSP水凝膠在模擬體液中的溶脹

圖2為樣品在模擬體液中的溶脹比隨時(shí)間變化曲線。由圖2可知，WBPU-BSP水凝膠中，隨時(shí)間的增加，凝膠吸水率也表現(xiàn)出先增加，然后趨于平衡的態(tài)勢(shì)。說明本文制備的WBPU-BSP水凝膠在模擬體液中具備較大的吸水能力，能吸收傷口滲出液，可作為傷口敷料使用。

圖2 WBPU-BSP水凝膠在模擬體液中的溶脹比隨時(shí)間變化曲線Fig.2 Curve of swelling ratio of sample in simulated body fluid with time

2.3 WBPU-BSP水凝膠保水性能

圖3為水凝膠的保水曲線。由圖3可知，WBPU-BSP水凝膠在初階段水分流失較快；但在24 h內(nèi)，水分保持率仍在65%以上，直至80 h，失水速率下降，且水分流失趨于平衡。說明WBPU-BSP水凝膠作為傷口敷料使用時(shí)，能維持濕潤(rùn)環(huán)境至少80 h，幫助傷口的愈合。

2.4 WBPU-BSP水凝膠抗菌性能

圖4為WBPU-BSP水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能。由圖4(A)、(C)可知，在經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%BPS的WBPU-BSP水凝膠覆蓋的樣品，有少量細(xì)菌繁殖，證明質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%BPS的WBPU-BSP水凝膠樣品本身具有一定的抗菌性，但抗菌效果一般。在經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%BPS的WBPU-BSP水凝膠覆蓋的樣品，幾乎沒有細(xì)菌繁殖，證明質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%BPS的WBPU-BSP水凝膠樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌效果，將其作為傷口敷料使用時(shí)，可有效防止細(xì)菌對(duì)傷口進(jìn)行二次感染。

圖4 WBPU-BSP水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能Fig.4 Antibacterial activity of WBPU-BSP hydrogel against escherichia coli and staphylococcus aureus

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

圖5為凡士林紗布和BSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%WBPU-BSP水凝膠作為敷料小鼠傷口愈合圖。由圖5可知，在術(shù)后3 d內(nèi)，用凡士林紗布的小鼠傷口結(jié)痂，但傷口大小并沒有任何變化。而質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%BSP的WBPU-BSP水凝膠敷料傷口明顯縮??；在術(shù)后14 d內(nèi)，小鼠傷口愈合皆表現(xiàn)良好。

圖5 小鼠傷口愈合圖Fig.5 Wound healing in mice

圖6為14 d小鼠傷口愈合的組織切片圖，其中圖6(a)為凡士林紗布組，圖6(b)為WBPU-BSP水凝膠中BSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%試驗(yàn)組，箭頭所指部分為小鼠傷口形成的再生表皮。由圖6可知，在14 d后，WBPU-BSP水凝膠中BSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%組再生表皮明顯厚于凡士林紗布組，同時(shí)有新的真皮層和新生血管形成。而凡士林組并未完成角質(zhì)層的新生，且有間質(zhì)水腫出現(xiàn)，新生血管也較少。這表明本文制備的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%BSP的WBPU-BSP水凝膠能有效促進(jìn)傷口愈合，幫助新的真皮層和新生血管形成。

圖6 小鼠傷口愈合組織切片F(xiàn)ig.6 Tissue sections of wound healing in mice

3 結(jié)語(yǔ)

本文在聚氨酯水凝膠中引入BSP ，制備一種新型的聚氨酯/白及多糖水凝膠(WBPU-BSP)，通過對(duì)WBPU-BSP水凝膠理化性能和生物性能進(jìn)行研究，確定WBPU-BSP水凝膠作為傷口敷料應(yīng)用的可行性。

(1)當(dāng)WBPU-BSP水凝膠中BSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，水凝膠表現(xiàn)出較為致密均勻的多孔結(jié)構(gòu)，具有良好的滲透性，對(duì)細(xì)胞的增殖和傷口愈合有促進(jìn)作用；

(2)WBPU-BSP水凝膠在模擬體液中具備較大的吸水能力，能吸收傷口滲出液，具備傷口敷料的使用條件；

(3)WBPU-BSP水凝膠具備較好的保水性能，能維持濕潤(rùn)環(huán)境至少80 h，對(duì)促進(jìn)傷口愈合產(chǎn)生積極的影響；

(4)WBPU-BSP水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌效果，可有效防止細(xì)菌對(duì)傷口進(jìn)行二次感染；

(5)WBPU-BSP水凝膠能有效促進(jìn)傷口愈合，幫助新的真皮層和新生血管形成。