李 純，陳俊妃，熊 穎，謝思敏，顧利紅

（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510160）

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu&Zhi Y.Zhang的干燥果實(shí)［1］，具有清熱潤(rùn)肺、利咽開(kāi)音、滑腸通便的功效，是國(guó)家衛(wèi)生部首批批準(zhǔn)的藥食兩用的品種之一。黃金羅漢果是新鮮羅漢果采摘后采用真空微波工藝脫水處理的成品，表面呈金黃色，故稱(chēng)“黃金羅漢果”。與傳統(tǒng)烘烤干燥的羅漢果相比，黃金羅漢果中更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得以保存，更符合現(xiàn)代健康環(huán)保的理念。

通過(guò)查閱《中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)》數(shù)字平臺(tái)的農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，目前尚未有羅漢果種植中使用的農(nóng)藥登記品種，羅漢果行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 694－2003）［2］僅收載了4種有規(guī)定最大殘留限量的農(nóng)藥?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763－2021）［3］也未規(guī)定羅漢果中農(nóng)藥的最大殘留限量（MRL）。根據(jù)2019年4月“農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于印發(fā)《用藥短缺特色小宗作物名錄》、《特色小宗作物農(nóng)藥登記藥效試驗(yàn)群組名錄》和《特色小宗作物農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)群組名錄》的通知”［4］，“羅漢果”歸類(lèi)在用藥短缺特色小宗作物名錄（2019版）藥用植物的“果實(shí)、種子類(lèi)”，該藥用植物的“果實(shí)、種子類(lèi)”代表作物為枸杞，枸杞目前已登記使用的農(nóng)藥有23種。為控制農(nóng)藥殘留，建立黃金羅漢果中常用農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)方法尤為重要。

與氣相色譜法、液相色譜法相比，QuEChERS技術(shù)結(jié)合色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法具有專(zhuān)屬性好、靈敏度高和適用范圍廣等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于乳制品、中藥、茶葉和蔬果等基質(zhì)中農(nóng)藥的檢測(cè)［5－9］，但目前適用于黃金羅漢果中多類(lèi)別農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。王夢(mèng)月等［10］采用氣相色譜法測(cè)定羅漢果中的有機(jī)氯農(nóng)藥；秦富等［11］采用QuEChERS－高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定羅漢果中55種殺菌劑；陳曉蘭等［12］采用QuEChERS－氣相色譜法測(cè)定羅漢果中的噠螨靈；潘艷坤等［13］采用固相萃取/高效液相色譜檢測(cè)羅漢果及其提取物中的甲基托布津與多菌靈。本研究基于實(shí)地調(diào)研，以改良的QuEChERS技術(shù)結(jié)合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－MS/MS），建立了黃金羅漢果中涵蓋6類(lèi)用途共50種常用農(nóng)藥的檢測(cè)方法，并對(duì)基地收集的28批樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC－30A高效液相色譜儀－8050三重四極桿質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司）；AG245型電子分析天平（瑞士Mettler－Toledo公司），Millipore超純水處理系統(tǒng)（德國(guó)Merck公司），ST 16型高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），Maxi Mix II旋渦儀（美國(guó)Thermo公司），N－EVAP氮吹儀（美國(guó)Oganomation公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；甲酸、甲酸銨、冰乙酸（色譜純，上海安譜有限公司）；無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉的混合粉末鹽包（質(zhì)量比4∶1，7.5 g，美國(guó)Waters公司）；無(wú)水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm）、石墨化炭黑（GCB，30～90 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，50 μm，60?）（農(nóng)殘級(jí)，上海安譜有限公司）。分散型凈化材料管（美國(guó)Dikma公司）。農(nóng)藥化合物標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer、ANPEL、BePure、O2SI公司）。

課題組共收集黃金羅漢果樣品28批，均為2020～2021年采收，產(chǎn)地分別為廣西桂林（16批）、湖南郴州（7批）與貴州黔東南苗族侗族自治州（5批），經(jīng)廣州市藥品檢驗(yàn)所顧利紅主任中藥師鑒定為葫蘆科植物羅漢果的干燥果實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液：精密量取50種農(nóng)藥對(duì)照品溶液（100 mg/L）各1 mL，置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容制備成混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，于-30℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液：精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液25 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容制備成混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。臨用前現(xiàn)配。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取不含待測(cè)農(nóng)藥的羅漢果樣品9份，按“1.2.2”處理至“置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL”，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液20、40、100、200、300、400、600、800、1 000 μL，用乙腈稀釋并定容至2.0 mL，配制系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

分別量取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及經(jīng)“1.2.2”處理的樣品溶液，過(guò)微孔濾膜（0.22 μm），按“1.2.3”條件測(cè)定，以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，以各農(nóng)藥定量離子峰的峰面積響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，權(quán)重系數(shù)選擇1/X，得到50種農(nóng)藥的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.2 樣品前處理取供試品粉末（過(guò)三號(hào)篩）3 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入15 mL水，渦旋使藥粉充分浸潤(rùn)，放置30 min，精密加入1%乙酸乙腈15 mL，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5 min，于冰浴中冷卻10 min，加入無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即搖散，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）3 min，離心（4 000 r/min）5 min。取9 mL上清液，置于分散固相萃取凈化管（裝有無(wú)水硫酸鎂900 mg，PSA 450 mg，C18300 mg，GCB 50 mg）中，渦旋充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5 min使凈化完全，離心（4 000 r/min）5 min，精密吸取5 mL上清液，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至2.0 mL，即得。

1.2.3 分析條件色譜條件：Agilent Poroshell 120 EC－C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；柱溫：35℃；樣品盤(pán)溫度：10℃；流動(dòng)相：A為0.05%甲酸水溶液（含10 mmol/L甲酸銨），B為95%甲醇（含10 mmol/L甲酸銨和0.05%甲酸）。梯度洗脫程序：0～1 min，95%A；1～4 min，95%～40%A；4～8 min，40%～36% A；8～8.5 min，36%～32% A；8.5～9 min，32%～25% A；9～16 min，25%～5% A；16～20 min，5%A；20～20.1 min，5%～95%A；20.1～25 min，95%A。流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）離子源；掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)掃描；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；霧化氣流速：1.5 L/min；加熱氣流速：10 L/min；接口溫度：300℃，脫溶劑溫度：500℃，DL溫度：180℃，加熱塊溫度：400℃；干燥氣流速：10 L/min。50種農(nóng)藥的保留時(shí)間、離子對(duì)、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 50種農(nóng)藥的保留時(shí)間、離子對(duì)及碰撞能量Table 1 Retention times，ion pairs and collision energies of 50 pesticides

（續(xù)表1）

2 結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)藥目標(biāo)物的選擇

本文的50種農(nóng)藥目標(biāo)物主要包括：①實(shí)地調(diào)研中發(fā)現(xiàn)的羅漢果種植基地及周?chē)h(huán)境中可能使用的農(nóng)藥；②枸杞子品種中有登記使用的農(nóng)藥；③羅漢果行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 694－2003）中規(guī)定最大殘留限量的農(nóng)藥；④具有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物及異構(gòu)體。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上分析，主要為有機(jī)磷類(lèi)（13種）、氨基甲酸酯類(lèi)（5種）、三唑類(lèi)（10種）、雜環(huán)類(lèi)（18種）、其他（4種）。從農(nóng)藥用途上分析，包括殺蟲(chóng)劑（25種）、殺菌劑（13種）、殺螨劑（6種）、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（3種）、毒性代謝物（2種）、除草劑（1種）。

2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

50種農(nóng)藥中大多數(shù)化合物適合質(zhì)譜正離子模式檢測(cè)，但部分化合物（虱螨脲、氟蟲(chóng)胺、除蟲(chóng)脲）在負(fù)離子模式下的響應(yīng)更好，因此采用正負(fù)離子同時(shí)掃描的質(zhì)譜檢測(cè)方式。為使溫度敏感型農(nóng)藥化合物（如丁硫克百威）在分析過(guò)程中保持穩(wěn)定，樣品盤(pán)溫度選擇為10℃。

對(duì)50種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/mL）在m/z30～900范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，并調(diào)整目標(biāo)物的母離子、子離子、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，同時(shí)加入羅漢果空白基質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)化合物選擇同時(shí)監(jiān)測(cè)2組MRM離子對(duì)作為定性離子對(duì)，選擇響應(yīng)值高且干擾少的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，并設(shè)定每個(gè)化合物的采集時(shí)間窗為1 min，顯著降低樣品中多組分分析的循環(huán)時(shí)間，增加采集點(diǎn)，提高儀器響應(yīng)值。黃金羅漢果空白基質(zhì)匹配的50種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 ng/mL）的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 黃金羅漢果空白基質(zhì)匹配的50種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 50 pesticide mixed standard solutions matched with blank matrix of golden siraitia grosvenoriis

2.3 前處理方法的優(yōu)化

50種農(nóng)藥的pKa為1.0～14.4，涵蓋酸性、中性及弱堿性農(nóng)藥，理化性質(zhì)差異較大。QuEChERS法通常采用1%乙酸水溶液先對(duì)樣品進(jìn)行浸泡，但部分酸堿度敏感型農(nóng)藥可能容易降解。實(shí)驗(yàn)比較了10 LOQ加標(biāo)水平下，分別采用1%乙酸水溶液－乙腈與水-1%乙酸乙腈作為提取溶劑時(shí)50種農(nóng)藥的回收率。結(jié)果顯示，采用水-1%乙酸乙腈的平均回收率（95%）整體略高于1%乙酸水溶液－乙腈（89%），且部分弱堿性農(nóng)藥的回收率顯著提高，例如乙酰甲胺磷（pKa 11.0）的回收率由47.0%增至80.0%，霜霉威（pKa 12.7）由22.0%增至65.0%，吡蚜酮（pKa 12.9）由45.0%增至67.0%，氧樂(lè)果（pKa 14.4）由55.0%增至81.0%。因此選擇水-1%乙酸乙腈為提取溶劑。

QuEChERS法的凈化材料主要包括PSA、C18、GCB、無(wú)水MgSO4。其中，無(wú)水MgSO4可去除多余的水分。PSA可去除酸性及中性物質(zhì)（例如有機(jī)酸、脂肪酸、酚類(lèi)等），其凈化效果與含水量有關(guān)，含水量越高，凈化效果越差。C18可去除非極性有機(jī)物（如木質(zhì)素、萜類(lèi)等）。GCB去除色素的能力較強(qiáng)，同時(shí)也容易吸附部分平面結(jié)構(gòu)的化合物［8］。羅漢果提取液含有糖類(lèi)、色素、黃酮類(lèi)等，經(jīng)過(guò)液液分層，大部分色素與糖類(lèi)留在水層。參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版［1］，并在前期研究的基礎(chǔ)［14－16］上對(duì)凈化步驟進(jìn)行優(yōu)化。固定無(wú)水MgSO4用量為900 mg，以10 LOQ加標(biāo)水平進(jìn)行考察，對(duì)比了PSA、C18、GCB凈化材料3種用量配比時(shí)的回收率。3種用量配比分別為：①300 mg PSA、300 mg C18、90 mg GCB；②300 mg PSA、450 mg C18、90 mg GCB；③450 mg PSA、300 mg C18、90 mg GCB。結(jié)果顯示，上述3種配比下50種農(nóng)藥的平均回收率分別為85.0%、91.0%、94.0%，總體差異不大，但部分平面結(jié)構(gòu)化合物（如多菌靈、伏殺硫磷等）的回收率低于50.0%，原因可能是GCB含量太高。而采用配比③，再將GCB用量降至50 mg，多菌靈、伏殺硫磷等農(nóng)藥的回收率提高至70.0%以上，95%農(nóng)藥的回收率在70.0%～120%范圍內(nèi)，滿足殘留分析要求。因此凈化劑確定為450 mg PSA、300 mg C18、50 mg GCB。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

質(zhì)譜分析中待測(cè)物不可避免地會(huì)受到基質(zhì)效應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)采用絕對(duì)法［17－18］評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME），計(jì)算公式為ME（%）=100%×B/A，其中A為純?nèi)軇┲写郎y(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均響應(yīng)值，B為空白基質(zhì)中相同濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均響應(yīng)值。當(dāng)ME為85%～115%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱，對(duì)結(jié)果的影響可忽略；當(dāng)ME＞115%或＜85%時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，應(yīng)采用適當(dāng)方法進(jìn)行校準(zhǔn)。比較了質(zhì)量濃度為10 ng/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液與羅漢果基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值。結(jié)果顯示，有44種農(nóng)藥的ME為85%～115%，表明其影響可忽略；氧樂(lè)果受基質(zhì)抑制影響嚴(yán)重（ME＜50%）；吡蟲(chóng)啉、伏殺硫磷、霜霉威、多菌靈受基質(zhì)抑制影響輕微（60%＜ME＜85%）；毒死蜱受基質(zhì)增強(qiáng)影響輕微（ME＞115%）。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2.5 方法學(xué)考察

按照“1.2.1”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，乙酰甲胺磷在10～500 ng/mL，鮮胺酯、氯吡脲、呋蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)嗪、異草松在6～300 ng/mL，丙環(huán)唑在7.5～375 ng/mL，其余43種農(nóng)藥在5～250 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。按照定量離子對(duì)MRM色譜峰的信噪比S/N≥10確定定量下限（LOQ），除乙酰甲胺磷、丙環(huán)唑的LOQ為0.02 mg/kg外，其余48種農(nóng)藥的LOQ均為0.01 mg/kg。

在羅漢果空白樣品中分別添加2 LOQ、5 LOQ、20 LOQ、40 LOQ的50種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置30 min，待農(nóng)藥被樣品充分吸收后，按“1.2.2”方法處理并進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。每個(gè)水平平行處理3份，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，4個(gè)加標(biāo)水平下50種農(nóng)藥的平均回收率為60.7%～115%，90%以上農(nóng)藥的回收率為70.0%～120%，涵蓋全部有檢出值的農(nóng)藥，95%以上農(nóng)藥的RSD（n=3）小于15%，符合農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)要求［19］。

表2 50種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)、定量下限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Correlation coefficients，LOQs，average recoveries and RSDs of 50 pesticides

（續(xù)表2）

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法測(cè)定28批黃金羅漢果，結(jié)果顯示，共有21批次樣品（占75%）檢出10種農(nóng)藥。農(nóng)藥殘留量為0.01～0.27 mg/kg，最高檢出量為吡唑醚菌酯，其殘留量為0.27 mg/kg（1批次），其余檢出量均低于0.1 mg/kg，說(shuō)明黃金羅漢果中農(nóng)藥殘留量總體不高（見(jiàn)表3）。根據(jù)枸杞子已登記的農(nóng)藥范圍，有5種檢出的農(nóng)藥并未進(jìn)行登記，分別為虱螨脲、丙溴磷、毒蟲(chóng)畏、霜霉威、乙拌磷亞砜，表明黃金羅漢果種植中存在超范圍使用農(nóng)藥的現(xiàn)象。

表3 樣品中10種檢出農(nóng)藥的用途、檢出批次及殘留量Table 3 Usages，batches and residual amounts of 10 detected pesticides in samples

（續(xù)表3）

3 結(jié)論

本文采用改良的QuEChERS法結(jié)合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了黃金羅漢果中50種常見(jiàn)農(nóng)藥的測(cè)定方法。該方法具有良好的靈敏度與準(zhǔn)確度，為羅漢果中多類(lèi)別農(nóng)藥殘留提供了可靠的分析手段，為中藥羅漢果農(nóng)藥殘留的日常監(jiān)督、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。