萬一夫，楊瑞琴*，張冠男，徐若淪

（1．中國人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038；2．公安部物證鑒定中心，北京 100038；3．廣東省毒品實(shí)驗技術(shù)中心，廣東 廣州 510230）

氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）是法庭科學(xué)領(lǐng)域中最常用的檢驗技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于爆炸物、毒品、毒物、農(nóng)殘等物質(zhì)的檢驗［1－9］。該技術(shù)包含多種電離源形式，其中，電子轟擊電離源（EI）或化學(xué)電離源（CI）可用于檢測有機(jī)炸藥［10］。EI模式下產(chǎn)物離子的碎片化程度高，種類豐富［11］；CI模式下色譜峰種類較少，背景噪聲小，對梯恩梯（TNT）的檢出限可達(dá)190 pg［12］。在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式下，氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜（GC－TQMS）通過選擇多對特定的母離子和子離子進(jìn)行檢測，可減少其他碎片離子的干擾。GC－TQMS結(jié)合了氣相色譜優(yōu)秀的分離能力和質(zhì)譜技術(shù)強(qiáng)大的定性能力，靈敏度高，受基質(zhì)干擾小，普適性強(qiáng)，分析速度快，與現(xiàn)場復(fù)雜環(huán)境下痕量有機(jī)炸藥殘留物檢驗分析的需求高度契合。

苦味酸（TNP）又稱黃色炸藥，猛度為103%TNT，在第一次世界大戰(zhàn)前被用作彈頭裝藥，是軍用炸藥中的常見成分［13－14］。TNP在當(dāng)今社會中應(yīng)用十分廣泛，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域可用作殺菌劑，在醫(yī)療領(lǐng)域可用于動物標(biāo)記等［15］。然而，TNP是一種十分危險的硝基芳香族有機(jī)化合物，爆炸威力大，且具有強(qiáng)烈的肝毒性和血毒性［16－17］。由于含有酚羥基，TNP易溶于水，極易污染環(huán)境，因此建立TNP的高靈敏檢測方法十分必要。

目前TNP的檢測方法包括熒光分析法［18］、液相色譜－質(zhì)譜法［19］、伏安法［20］、拉曼光譜法等［21］，相比于其他方法，GC－MS是公安基層刑事技術(shù)部門列裝度最高的設(shè)備，利用率高，是檢測TNP的有力手段。但TNP的極性強(qiáng)、沸點(diǎn)高，常規(guī)的GC－MS法難以直接檢測［22］，因此需借助衍生化方法。以往研究中，次氯酸鈉衍生化法最為常用，其原理是次氯酸鈉在水溶液中水解生成次氯酸，隨后將苦味酸氧化生成氯化苦［23］。但次氯酸的氧化性較強(qiáng)，可與多種硝基酚類、甲基酚類化合物反應(yīng)生成氯化苦［24］。Merlet等［25］研究發(fā)現(xiàn)硝基甲烷、甘氨酸、腐殖酸均可與次氯酸反應(yīng)生成氯化苦，此類雜質(zhì)產(chǎn)生的副反應(yīng)可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，需要建立更準(zhǔn)確定性苦味酸的方法。

較為理想的衍生化路徑是：保留苦味酸主體結(jié)構(gòu)，同時提升檢驗靈敏度，從而避免其他硝基酚類化合物和常見有機(jī)炸藥的干擾。根據(jù)文獻(xiàn)報道，烷基原碳酸酯與苯酚反應(yīng)會生成苯基烷基醚，該反應(yīng)的產(chǎn)率和反應(yīng)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，當(dāng)酚羥基鄰位或?qū)ξ淮嬖诮o電子基團(tuán)（如烷基）時，由于屏蔽效應(yīng)，產(chǎn)率下降；存在吸電子基團(tuán)（如硝基）時，產(chǎn)率增至80%～90%，而TNP酚羥基的鄰位和對位均有強(qiáng)吸電子能力的硝基，為建立新的TNP衍生方法提供了思路［26］。原甲酸三甲酯（TMOF）是一種烷基原碳酸酯，常用作有機(jī)反應(yīng)的脫水劑，能溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。同時，TMOF具有良好的反應(yīng)活性，是一種重要的有機(jī)合成中間體，可用于還原芳烴鹵代物［27］；與醛、β酮酯等反應(yīng)生成縮醛和縮酮［28－29］，可用于藥品、染料和香料等的合成［30］，該類物質(zhì)能與酚類在溫和條件下反應(yīng)生成芳基烷基醚，產(chǎn)率可達(dá)80%以上［31］。本文選用活性較高、價格低廉的TMOF對TNP進(jìn)行衍生，得到的衍生產(chǎn)物2，4，6-三硝基苯甲醚（TNA）在GC－MS檢測中具有較高的響應(yīng)，據(jù)此建立了快速檢驗爆炸案件中苦味酸的GC－TQMS方法。

1 實(shí)驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、丙酮、乙腈（色譜純，Supelco公司）；甲苯、乙醚、吡啶（分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；原甲酸三甲酯（純度98%，Aladdin公司）；TNP、TNT、地恩梯（DNT）、黑索金（RDX）、特屈兒（CE）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，AccuStandard公司）；泥土取自某公園，風(fēng)干干燥后過60目篩備用。

Agilent 7890A－7010 GC－TQMS氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，配備CI源和EI源，HP－5MS（8 m×0.25 mm×0.25 μm）、HP－5MS（5 m×0.25 mm×0.10 μm）色譜柱；Gerstel MPS自動進(jìn)樣器（Gerstel公司）；ML204T/02分析天平（Mettler Toledo公司）；移液槍（Eppendorf公司）；有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）；SB25－12DTD型超聲波清洗器（寧波新芝公司）；DHG－9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DZF－6032真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 工作液及衍生方法

工作液：用甲醇將TNP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至10 μg/mL，用于衍生化條件優(yōu)化，并繼續(xù)逐級稀釋，用于實(shí)驗和方法評價；用甲醇將TNP、TNT、DNT、RDX、CE的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合配制為10 μg/mL的混標(biāo)工作液，用于提取回收實(shí)驗。

衍生方法：取苦味酸待測液1 mL，用真空干燥箱處理后加入100 μL TMOF，超聲振蕩溶解2 min后密封，加熱至95℃，保持70 min后取出樣品冷卻，加入1 mL甲醇振蕩溶解，取1 μL上清液進(jìn)樣。

1.3 儀器條件

EI模式：采用HP－5MS毛細(xì)管色譜柱（5 m×0.25 mm×0.10 μm），恒壓：75.84 kPa；進(jìn)樣口溫度：240℃，初始溫度為80℃，保持1 min，以20℃/min升至250℃，保持0.5 min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1 μL；傳輸線溫度：230℃；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；載氣為高純氦氣，碰撞氣為氮?dú)猓|(zhì)量數(shù)掃描范圍35～400 amu，溶劑延遲1 min。

負(fù)化學(xué)電離（NCI）模式：采用HP－5MS毛細(xì)管色譜柱（8 m×0.25 mm×0.25 μm，自行切割），恒流：1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度：220℃，初始溫度為50℃，保持1 min，以20℃/min升至250℃，保持2 min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1 μL；傳輸線溫度：230℃，離子源溫度：150℃，載氣為高純氦氣，反應(yīng)氣為甲烷，質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～400 amu，溶劑延遲3 min。

1.4 回收率實(shí)驗

取公園中泥土，干燥后過60目篩備用。采用外標(biāo)法，進(jìn)行5組平行對照實(shí)驗，實(shí)驗組每份取泥土2 g，添加1 mL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混標(biāo)工作液，自然揮干5 min。加入20 mL丙酮，振蕩提取約30 s，靜置2 min，提取液沿玻璃棒引流至濾紙漏斗中，用50 mL燒杯收集濾液，自然揮干至1 mL左右，過有機(jī)濾膜，取100 μL濾液于進(jìn)樣瓶的內(nèi)襯管中按照“1.2”方法進(jìn)行衍生。對照組為“1.2”制備的混標(biāo)工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化反應(yīng)原理

在加熱條件下，TNP與TMOF發(fā)生甲基化反應(yīng)，生成2，4，6-三硝基苯甲醚、甲醇和甲酸甲酯，反應(yīng)后得到淡黃色溶液。

圖1顯示了苦味酸的衍生化反應(yīng)機(jī)理。反應(yīng)過程中，原甲酸三甲酯與苦味酸發(fā)生親核取代反應(yīng)，脫去1個甲醇分子形成中間體A，由于碳原子同時連接1個芳氧基和2個甲氧基，中間體A結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在加熱條件下A很容易脫去1個甲酸甲酯分子。Smith［26］認(rèn)為這主要是芳氧基引起，另外，由于芳氧基共振，中間體A很可能發(fā)生如圖1所示的電子轉(zhuǎn)移。中間體A脫去甲酸甲酯分子會產(chǎn)生芳氧基自由基、甲基自由基，二者結(jié)合生成TNA。此外，芳氧基苯環(huán)上對位和鄰位的3個硝基使芳氧基的吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)增強(qiáng)，使得中間體A更容易分解，產(chǎn)率提高。

圖1 原甲酸三甲酯與苦味酸的衍生反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Reaction mechanism for derivatization of TNP by TMOF

2.2 產(chǎn)物的確證

EI源是GC－MS最常用的電離源，由于能量較高，檢測有機(jī)炸藥時很難得到分子離子；CI是一種軟電離方法，圖譜噪聲小、分子離子豐度高。苦味酸含有多個硝基，吸電子能力較強(qiáng)，因此在NCI模式下的響應(yīng)效果優(yōu)于正化學(xué)電離（PCI）模式。為得到更好的分析效果，分別采用EI模式和NCI模式，通過保留時間和MRM離子對分析10 mg/L TNP的衍生產(chǎn)物TNA。

EI模式下TNA的譜圖見圖2，保留時間為2.76 min。質(zhì)譜圖中豐度較大的離子峰包括m/z243、213、166、105、75和62，m/z243來自［TNA］+（分子離子峰），該峰說明TNA的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定［11］；m/z213來自［M－CH2O］+和［NO3］+；m/z166可能是［M－CH2O］+繼續(xù)脫去NO2的產(chǎn)物；m/z105來自［M－3NO2］+；m/z75和m/z62分別為［M－CH2O－3NO2］+和［NO3］+。選取豐度較高的離子［TNA］+和［M－CH2O］+作為母離子采集二級質(zhì)譜，得到豐度較高的特征碎片離子m/z213［M－CH2O］+、166［M－CH2O－NO2］+和62［NO3］+。

圖2 EI模式下TNP衍生產(chǎn)物TNA的總離子流圖（A）和質(zhì)譜圖（B）Fig.2 Total ion chromatogram（A）and mass spectrum（B）of TNP-derived product TNA in EI mode

NCI模式下TNA的譜圖見圖3，保留時間為4.98 min。質(zhì)譜圖中TNA的碎片離子較少，無法獲得分子離子峰，豐度較高的離子峰為m/z228、213，其中m/z228來自［M－CH3］-；m/z213為［M－CH2O］-。選取m/z228作為母離子采集二級質(zhì)譜，得到豐度較高的產(chǎn)物離子m/z198、m/z182，其中m/z198為m/z228繼續(xù)脫去NO的產(chǎn)物［M－CH3－NO］-，m/z182則為m/z228繼續(xù)脫去NO2的產(chǎn)物［M－CH3－NO2］-。

圖3 NCI模式下TNP衍生產(chǎn)物TNA的總離子流圖（A）和質(zhì)譜圖（B）Fig.3 Total ion chromatogram（A）and mass spectrum（B）of TNP-derived product TNA in NCI mode

2.3 衍生化條件的優(yōu)化

原甲酸三甲酯接觸水會發(fā)生反應(yīng)，生成甲醇和甲酸甲酯，因此樣品采用丙酮等溶劑進(jìn)行提取。此外，原甲酸三甲酯易揮發(fā)，加熱時，為避免其提前揮發(fā)導(dǎo)致衍生化反應(yīng)無法進(jìn)行，反應(yīng)要在密閉條件下進(jìn)行。

將TNP分別用甲醇、甲苯、乙腈、乙醚、丙酮和吡啶溶解后加入TMOF進(jìn)行衍生，比較了不同溶劑的實(shí)驗效果。結(jié)果表明，以甲醇作溶劑時TNA的響應(yīng)最好，吡啶作溶劑時TNA的響應(yīng)最差。

比較了苦味酸甲醇溶液和苦味酸固體的反應(yīng)效果。實(shí)驗表明，衍生化前對苦味酸進(jìn)行干燥處理可大幅提高衍生化產(chǎn)率，這是因為直接加入TMOF一方面會使反應(yīng)濃度降低，反應(yīng)速率下降，另一方面，溶劑和TMOF會產(chǎn)生短暫的分層，苦味酸從溶劑相轉(zhuǎn)移至TMOF（反應(yīng)相）的過程減緩了反應(yīng)速度。由于TNA的熱穩(wěn)定性強(qiáng)，烘干無明顯影響，因此衍生前先對樣品進(jìn)行干燥處理。

進(jìn)一步對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及TMOF體積進(jìn)行了優(yōu)化（圖4）。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)時間為120 min時，TNA的信號強(qiáng)度達(dá)到最大，但只比70 min時高不到5%；當(dāng)反應(yīng)時間超過120 min，TNA的信號強(qiáng)度隨反應(yīng)時間的增加而快速下降，這是因為產(chǎn)物TNA在長時間加熱過程中隨溶劑揮發(fā)所致。綜合考慮時間成本和實(shí)驗效果，選擇反應(yīng)時間為70 min。當(dāng)反應(yīng)溫度為95℃時，衍生產(chǎn)物的相對信號強(qiáng)度最高，因此選擇95℃為實(shí)驗溫度。此外，原甲酸三甲酯的沸點(diǎn)約104℃，實(shí)驗中應(yīng)防止溫度過高導(dǎo)致液體暴沸。

圖4 不同反應(yīng)時間（A）、反應(yīng)溫度（B）、TMOF體積（C）下衍生產(chǎn)物的信號強(qiáng)度Fig.4 Signal intensities of derivatives under different reaction times（A），reaction temperatures（B）and volumes of TMOF（C）

在100～1 000 μL范圍內(nèi)，隨著TMOF的加入量增加，TNA的信號強(qiáng)度降低，產(chǎn)率下降。這是因為在該范圍內(nèi)，產(chǎn)率和反應(yīng)物的濃度成正比，因此進(jìn)行衍生化反應(yīng)時，TMOF的用量應(yīng)盡可能減少。TMOF加入量進(jìn)一步減少至50 μL時，產(chǎn)率反而下降，這是因為TMOF提前全部受熱揮發(fā)導(dǎo)致反應(yīng)不完全，因此TMOF加入量選擇100 μL。

綜上所述，最優(yōu)衍生化條件為：將苦味酸待測液敞口置于真空干燥箱內(nèi)烘干，加入100 μL原甲酸三甲酯，超聲振蕩溶解2 min。密封，放入烘箱加熱至95℃，保持70 min，取出冷卻，取1 μL上清液進(jìn)樣。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

配制1～10 μg/mL的TNA單標(biāo)溶液，繪制響應(yīng)曲線以確定方法的線性范圍，以信噪比S/N=3和S/N=10分別確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），結(jié)果見表1。實(shí)驗表明，儀器在EI模式下對TNA的靈敏度高于NCI模式，EI模式下的線性范圍為5～1 000 μg/L，檢出限和定量下限分別為1.33、4.78 μg/L，完全滿足一般檢測需要。

表1 GC－EI/TQMS和GC－NCI/TQMS的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 1 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of GC－EI/TQMS and GC－NCI/TQMS

2.5 方法通用性

將本方法用于爆炸案件中有機(jī)炸藥的檢驗，并對常見硝基芳香族有機(jī)炸藥的影響進(jìn)行了考察。分別配制10 μg/mL的TNT、DNT、CE、TNP單標(biāo)甲醇溶液、100 μg/mL RDX的單標(biāo)甲醇溶液，以及100 μg/mL的5種有機(jī)炸藥的甲醇混標(biāo)溶液（100 μg/mL），用“2.3”方法分別對單標(biāo)溶液與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生處理后，取1 μL直接進(jìn)樣。實(shí)驗采用EI源對5種有機(jī)炸藥進(jìn)行GC－TQMS檢測，MRM所選離子對信息見表2。

表2 EI模式下5種有機(jī)炸藥的MRM離子對及碰撞能量Table 2 Precursor and related product ions for analysis of 5 organic explosives in EI mode

實(shí)驗表明，該方法下5種有機(jī)炸藥的MRM特征峰基本不受影響，分離效果良好。對色譜峰進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在對照組和實(shí)驗組中，TNT的保留時間分別為2.37、2.42 min；DNT的保留時間分別為1.29、1.33 min；RDX的保留時間分別為3.28、3.35 min；CE的保留時間分別為4.17、4.15 min；TNP衍生產(chǎn)物TNA的保留時間分別為2.82、2.84 min，說明該方法也可檢測混合物中的TNP、TNT、DNT、RDX和CE。

2.6 實(shí)際應(yīng)用

爆炸案件現(xiàn)場物證種類多樣、分布復(fù)雜，爆炸泥土作為最常見的爆炸現(xiàn)場殘留物，常作為司法鑒定領(lǐng)域判斷炸藥種類的重要依據(jù)。為考察泥土載體雜質(zhì)的干擾，確定本方法的實(shí)戰(zhàn)效能，對模擬爆炸實(shí)驗殘留泥土中的有機(jī)炸藥成分進(jìn)行了檢驗。按照“1.4”方法對模擬爆炸殘留泥土進(jìn)行提取回收實(shí)驗，按照“1.3”中EI模式的條件將提取液和對照品分別檢測，以實(shí)驗組和對照組的色譜峰面積之比確定回收率，實(shí)驗重復(fù)5次。結(jié)果顯示，5次實(shí)驗中均檢出TNP，平均回收率為84.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.6%。以第3次實(shí)驗為例，實(shí)驗組樣品的總離子流圖如圖5，可見該方法對復(fù)雜組分中TNP的檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)。

圖5 爆炸泥土中TNA的總離子流圖Fig.5 TIC for TNA in soil samples from simulating explosion

3 結(jié)論

本文基于TMOF甲基化衍生法，建立了苦味酸的氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜高靈敏檢驗方法，在EI模式下對苦味酸的檢出限達(dá)1.33 μg/L，高于NCI模式（5.02 μg/L），能夠滿足爆炸案件殘留物的檢驗需求。采用靈敏度更高的EI模式，在該方法的基礎(chǔ)上采用浸泡濃縮提取方法，可檢出泥土樣品中混合炸藥的TNP組分，其平均回收率達(dá)84.0%。本方法對TNP具有良好的選擇性，不受4種常見硝基芳香族有機(jī)炸藥的影響，具有推廣應(yīng)用價值。