蔡晶晶，吳金香，羅湘閩

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，福建 泉州 362000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女最常見的內(nèi)分泌疾病，表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、卵巢多囊樣改變、且多伴有持續(xù)性高黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）及高雄激素等典型特征［1］。PCOS患者卵母細胞發(fā)育潛能低下被認為是生育力下降的風(fēng)險因素，卵泡發(fā)育異常和成熟障礙是其重要特征，但其病因及發(fā)病機制仍然不清。以往研究多集中在下丘腦-垂體-卵巢軸對卵泡形成的整個階段的同步化協(xié)調(diào)和反饋作用，包括血清卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、LH、LH/FSH和抗繆勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）反映性軸在PCOS卵泡發(fā)育異常機制中的作用。最近有更多的研究證實卵母細胞自分泌、旁分泌形成的卵泡微環(huán)境對卵母細胞和顆粒細胞的生長發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用。卵泡微環(huán)境是影響卵母細胞發(fā)育的重要因素，卵母細胞和顆粒細胞之間具有雙向聯(lián)系，可進行營養(yǎng)物質(zhì)及信號的交換，其含有各種生物化學(xué)成分、細胞因子和氧化/抗氧化產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)促進卵泡生長，控制卵巢功能的各個方面發(fā)揮重要作用［2］。優(yōu)化卵泡微環(huán)境可以提高卵母細胞質(zhì)量，調(diào)控優(yōu)勢卵泡的形成，改善婦女的妊娠結(jié)局［3］。研究表明GDF9是重要的卵泡發(fā)育調(diào)控因子，在卵泡發(fā)育階段調(diào)節(jié)卵丘細胞及卵泡膜細胞的生長、分化和功能，并在卵母細胞的發(fā)育成熟、排卵、以及黃體功能發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而影響卵巢功能［4-5］。

以往文獻表明GDF9的生物學(xué)功能主要是通過Smad2/3信號通路作用于卵丘細胞引起卵丘的生長分化和卵丘復(fù)合物的擴展［4-5］。也有研究報道在PCOS卵巢中，GDF9表達水平降低抑制著卵泡的生長，可能與激素水平有關(guān)［6-8］。Dewailly等［9］系統(tǒng)闡述了PCOS卵巢內(nèi)分泌紊亂的三角模式，并影響著卵泡的發(fā)育，但由于PCOS病因不清，不能局限于內(nèi)分泌因素，這個模式不能完全解釋PCOS產(chǎn)生的病理生理機制，需要更多探討PCOS卵泡生長發(fā)育的其他環(huán)境的影響，認為內(nèi)分泌激素和卵源性因子的相互聯(lián)系也發(fā)揮著重要作用。然而，GDF9表達與內(nèi)分泌激素在PCOS卵泡發(fā)育的相互關(guān)系鮮見詳細報道和明確解釋。

卵泡液是卵母細胞賴以生存的微環(huán)境［10］，參與調(diào)控生殖功能的重要體液。而卵丘細胞可以通過縫隙連接和卵母細胞進行信號傳遞［11］，將卵母細胞分泌的細胞因子和RNA等物質(zhì)運輸?shù)铰雅菀褐?，豐富了卵泡微環(huán)境的營養(yǎng)物質(zhì)從而提高卵母細胞的質(zhì)量。本實驗收集進行體外受精（in vitrofertilizaion，IVF）周期患者的卵泡液和卵丘細胞以研究PCOS患者成熟卵泡GDF9表達水平，分析PCOS卵巢內(nèi)卵泡微環(huán)境GDF9表達情況，以及GDF9水平和PCOS內(nèi)分泌激素之間相關(guān)性在卵泡發(fā)育中的作用，為PCOS發(fā)病機制提供更多的理論依據(jù)。

材料和方法

1 一般資料

選擇2019年12月～2022年8月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的接受IVF/ICSI治療的115例患者，其中PCOS患者61例和卵巢功能正常的患者54例（對照組）。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書（編號：2019-222）。PCOS的診斷根據(jù)2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［12］。對照組患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)規(guī)律，正常排卵，超聲顯示卵巢形態(tài)正常，為同期輸卵管因素的不孕患者。同時排除合并卵巢功能早衰、內(nèi)異癥、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等；曾接受過卵巢手術(shù)或放化療者。

2 方法

2.1 激素水平檢測采集患者月經(jīng)后第3～5天的空腹靜脈血，離心分離血清。采用Abbott I 2000化學(xué)發(fā)光分析儀檢測基礎(chǔ)內(nèi)分泌值：睪酮（testosterone，T）、FSH、LH、雌二醇（estrodiol，E2）和催乳素（prolactin，PRL）。采用ELISA法檢測AMH水平，試劑盒購自貝克曼二代公司。

2.2 人卵泡液和卵丘細胞的收集根據(jù)患者不孕原因、年齡、卵泡刺激素水平和腔卵泡計數(shù)等臨床資料，主要采用早卵泡期長效長方案和拮抗劑方案，進行促排卵。給予促性腺激素釋放激素激動劑（博福益普生公司）和重組FSH（雪佛蘭公司）刺激卵巢后，當(dāng)至少3枚卵泡直徑達到17 mm左右，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（珠海麗珠制藥廠）5 000～10 000 U，36 h后超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。由于卵母細胞可用于胚胎培養(yǎng)和移植，所以留取相應(yīng)的卵泡液和卵丘細胞來分析GDF9的表達。從穿刺獲得的第一個直徑大于17 mm的卵泡中撿取卵丘-卵母細胞復(fù)合物，收集廢棄的卵泡液。卵泡液樣品置于水平離心機，4℃、300×g離心10 min；取1 mL上清液轉(zhuǎn)移到冷凍管中，保存在-80℃冰箱，用于后續(xù)的GDF9蛋白濃度測定。獲取的每個卵丘-卵母細胞復(fù)合物用16號顯微解剖針［13］機械去除分離部分卵丘細胞，經(jīng)PBS漂洗后均勻涂布于防脫載玻片上制成卵丘細胞涂片，用于免疫組織化學(xué)染色檢測卵丘細胞的GDF9表達水平。

2.3 人類卵泡液GDF9濃度的測定將卵泡液用PBS 1∶5比例稀釋，然后按照生產(chǎn)說明書使用人GDF9 ELISA試劑盒（Elabscience）進行測定。在自動96孔微孔板閱讀器下讀取450 nm波長的吸光度（A）。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算卵泡液GDF9濃度。

2.4 免疫組織化學(xué)染色根據(jù)操作說明書（博士德生物科技有限公司），采用免疫組化染色法檢測GDF9在卵丘細胞的分布。用4%多聚甲醛固定卵丘細胞涂片15 min，然后用3%過氧化氫浸泡以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加山羊血清阻斷非特異性結(jié)合1 h。用兔抗GDF9Ⅰ抗（Abcam；1∶100）4℃孵育過夜，用PBS沖洗3次，室溫下與生物素標(biāo)記的兔抗Ⅱ抗孵育30 min。最后，與過氧化物酶底物DAB在室溫下孵育，直到達到所需的染色強度，用蘇木素輕度染色，覆蓋蓋玻片。涂片通過預(yù)實驗確定最佳染色時間和抗體滴度。空白涂片采用不含Ⅰ抗的卵丘細胞涂片進行孵育。用顯微鏡（Leica MZ16FA）對染色結(jié)果進行檢測和拍照留取圖片。使用ImageJ 6.0軟件對圖片染色進行半定量分析，每張圖片隨機選取3～5個視野，測定平均吸光度（A）。

3 觀察指標(biāo)

對比PCOS組和對照組卵泡液GDF9濃度和卵丘細胞GDF9表達水平。分析成熟卵泡卵泡液GDF9與患者血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH的相關(guān)性。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用軟件SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。Shapiro-Wilk檢驗判斷數(shù)據(jù)的正態(tài)性。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù)）［median（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，使用多變量偏相關(guān)分析非正態(tài)變量間的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組患者基本資料的比較

本研究納入標(biāo)準(zhǔn)的患者共115例，其中對照組54例，PCOS組61例。兩組患者間基礎(chǔ)T、基礎(chǔ)AFC、基礎(chǔ)AMH、基礎(chǔ)LH和LH/FSH比值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），兩組患者間年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、E2、PRL和促排卵Gn總量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者基本資料的比較Table 1.Comparison of general data between the two groups［Mean±SD or median（P25，P75）］

2 兩組患者成熟卵泡卵泡液GDF9蛋白濃度比較

PCOS組患者成熟卵泡卵泡液GDF9蛋白濃度是（6.83±0.53）μg/L，低于對照組的（11.05±0.82）μg/L（P＜0.01），見圖1。

3 兩組患者成熟卵泡卵丘細胞GDF9蛋白水平

PCOS組和對照組的卵丘細胞免疫組化染色顯示，兩組患者卵丘細胞中均存在有GDF9蛋白陽性表達，可見在細胞質(zhì)棕色染色。PCOS組卵丘細胞GDF9蛋白陽性染色平均吸光度值為0.18±0.01，明顯低于對照組的0.28±0.01（P＜0.01），見圖2。

4 成熟卵泡卵泡液中GDF9濃度與血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH水平的相關(guān)性

對PCOS組成熟卵泡卵泡液中GDF9濃度與血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，PCOS組成熟卵泡卵泡液GDF9濃度與T（r=0.303，P＜0.05）和FSH（r=0.309，P＜0.05）呈正相關(guān)；與LH（r=-0.290，P＜0.05）、LH/FSH（r=-0.418，P＜0.01）和AMH（r=-0.281，P＜0.05）呈負相關(guān)，見圖3。而在正常對照組中，GDF9與T、FSH、LH、LH/FSH和AMH無顯著相關(guān)性（P＞0.05），見圖4。

Figure 1.The expression of GDF9 in follicular fluid from the PCOS patients（n=61）and controls（n=54）.Mean±SD.**P＜0.01 vs control group.圖1兩組患者成熟卵泡卵泡液GDF9蛋白濃度

Figure 2.The expression of GDF9 in cumulus cells（×400）of PCOS patients（n=61）and controls（n=54）.Mean±SD.**P＜0.01 vs control group.圖2兩組患者成熟卵泡卵丘細胞GDF9蛋白表達水平

討 論

在卵泡發(fā)育的各個階段，從初級卵泡到次級卵泡的轉(zhuǎn)化，都可以檢測到GDF9的表達，在成熟卵泡表達水平最高，卵母細胞通過GDF9的合成和分泌調(diào)節(jié)顆粒細胞增殖和分化［14-16］。所以本研究收集直徑≥14 mm卵泡的卵泡液和卵丘細胞，即成熟卵泡的卵泡液和卵丘細胞，以分析PCOS患者中卵泡成熟階段GDF9表達水平，對卵母細胞質(zhì)量進行預(yù)測評估。本研究結(jié)果顯示，PCOS組卵泡液GDF9的含量低于對照組，同時還發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵丘細胞的GDF9表達與卵泡液GDF9表達是一致的。魏麗娜等［8］的研究顯示刺激周期PCOS組成熟卵母細胞和正常卵巢對照組比較，卵母細胞GDF9 mRNA表達水平明顯降低。隨后她們用免疫組化驗證GDF9在PCOS婦女的卵巢組織中的表達，也發(fā)現(xiàn)組織中GDF9表達也是呈低水平狀態(tài)［7］。另有國外學(xué)者研究顯示在行控制性促排卵的PCOS患者，卵丘細胞GDF9的mRNA表達降低［17］。本實驗結(jié)果和這些已報道研究一致，用不同的實驗方法進一步驗證了控制性卵巢刺激可以促進正常排卵婦女卵泡GDF9的表達，但對于PCOS患者的成熟卵泡GDF9表達仍未能達到正常水平。近年，GDF9在誘導(dǎo)卵母細胞與顆粒細胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進卵母細胞的成熟和排卵發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用不斷被認知［7，18-19］。PCOS患者中低表達的GDF9導(dǎo)致卵泡發(fā)育的促進作用受到抑制，可能會引起卵母細胞的質(zhì)量低下。PCOS患者雖然經(jīng)過外源性Gn促排刺激以及LH峰的扳機作用，卵母細胞發(fā)生核成熟并排出第一極體，但減弱的GDF9表達水平可能會引起胞質(zhì)發(fā)育不成熟，核質(zhì)發(fā)育不平衡，減弱本身的減數(shù)分裂能力、抑制正確的受精和形成的早期胚胎發(fā)育能力［20-21］。

近期有文獻報道首次用ELISA方法定量檢測無促排刺激卵巢中的小竇卵泡GDF9濃度［22］，但國內(nèi)目前尚缺乏此類的數(shù)據(jù)分析。本研究也應(yīng)用ELISA方法觀察到GDF9濃度在PCOS患者個體間差異較大，甚至部分患者的GDF9表達水平并不比正常對照低，與此文獻報道的一致。這可能與PCOS疾病的臨床特點和高度異質(zhì)性有關(guān)系，說明有些溫和的PCOS表型可能有不同的致病途徑，它們的生殖能力和卵母細胞質(zhì)量并不比正常婦女差，治療也應(yīng)該個體化處理［23］。PCOS不僅影響女性生殖功能，而且是一種多系統(tǒng)、復(fù)雜的慢性疾病?；颊咧g個體差異大，具有不同的臨床表現(xiàn)，涉及輕微癥狀到伴有嚴重的代謝紊亂疾病，如肥胖、高胰島素血癥、胰島素抵抗以及持續(xù)的低度慢性炎癥。這些并發(fā)癥或多或少伴隨著PCOS疾病的發(fā)生，增加PCOS的嚴重性，而且影響著PCOS的生殖能力和卵母細胞的質(zhì)量［5］。所以本研究通過定量檢測多樣本的GDF9濃度，在評估PCOS患者群體生殖能力方面，更能體現(xiàn)PCOS臨床的多變性和特異性。

Figure 3.Correlations of GDF9 concentration in follicular fluid of mature follicles and serum T，F(xiàn)SH，LH，LH/FSH and AMH levels in PCOS patients.圖3 PCOS組成熟卵泡卵泡液GDF9濃度與血清FSH、LH、LH/FSH和AMH水平的相關(guān)性

Figure 4.Correlations of GDF9 concentration in follicular fluid of mature follicles and serum T，F(xiàn)SH，LH，LH/FSH and AMH levels in control patients.圖4對照組成熟卵泡卵泡液GDF9濃度與血清T、FSH、LH、LH/FSH和AMH水平的相關(guān)性

卵母細胞的生長發(fā)育受到內(nèi)分泌環(huán)境和卵泡微環(huán)境的共同調(diào)控，深入了解這一復(fù)雜的卵泡生長環(huán)境的相互作用為探索PCOS的發(fā)生發(fā)展提供更多的理論依據(jù)。PCOS患者內(nèi)分泌紊亂是其主要特征之一［24-26］。有研究指出卵源性因子的表達受到內(nèi)分泌激素的調(diào)控，過度分泌的AMH可能直接抑制或者阻斷FSH對卵源性因子的產(chǎn)生，使PCOS患者卵母細胞中卵源性因子的表達處于較低水平［9］。也有文獻報道，GDF9在原始卵泡階段就開始表達，通過非性腺激素依賴途徑調(diào)控卵泡生長發(fā)育的微環(huán)境，卵泡的生長狀況必定會影響各種內(nèi)分泌激素產(chǎn)生和受體的表達［27］?？傊琍COS出現(xiàn)多指標(biāo)的異常表達，但因果關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液GDF9水平與T和FSH呈正相關(guān)；與LH、LH/FSH和AMH呈負相關(guān)，而在對照組中不存在任何相關(guān)性，實驗中兩組結(jié)果對比表明PCOS患者GDF9的產(chǎn)生與T、FSH、LH、LH/FSH和AMH表達可能存在某種相互調(diào)節(jié)或相互作用的機制，如果這種正常的平衡狀態(tài)被某種因素打破就可能發(fā)生的一系列連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致各種生物指標(biāo)的異常表達［28］。雖然有文獻表明雄激素水平過高可抑制卵泡發(fā)育［29］，但也有研究顯示雄激素在卵泡發(fā)生的早期和排卵前階段是必不可少的［30］。本研究中PCOS患者的GDF9表達水平與睪酮成正相關(guān)，它們可能在PCOS原始卵泡階段就開始共同決定著卵泡的命運。

本文從卵源性因子的角度以及內(nèi)分泌激素水平探索PCOS患者在控制性卵巢刺激排卵周期的卵泡生長調(diào)節(jié)過程，確定兩者之間的相關(guān)性，進一步研究影響PCOS卵母細胞質(zhì)量和PCOS患者生育力的因素和內(nèi)在聯(lián)系，或許將GDF9與T、FSH、LH、LH/FSH、AMH聯(lián)合檢測，以監(jiān)測控制性卵巢刺激促排卵中卵泡的生長情況，為指導(dǎo)PCOS患者的IVF臨床治療提供更多的實驗室數(shù)據(jù)依據(jù)，為PCOS的治療提供新思路。