陳明麗，趙曉麗，馮偉華，夏天

卵泡的發(fā)育是涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌等多種因素的高度協(xié)調(diào)過程，其發(fā)育異常參與了多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等生殖內(nèi)分泌疾病的發(fā)生[1-2]。近年來卵巢局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子對卵巢功能的調(diào)節(jié)作用逐漸受到關(guān)注，這些細(xì)胞因子通過自分泌和（或）旁分泌的形式介導(dǎo)卵泡微環(huán)境中顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的交流對話，促進(jìn)卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖分化，尤其在卵泡生長早期起著重要的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）作為卵母細(xì)胞分泌因子（oocytesecreted factor，OSF）以旁分泌的形式廣泛參與卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖與凋亡、類固醇生成、排卵以及黃體化等過程[3-4]。BMP15可促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和分化，調(diào)控卵泡閉鎖，并參與多種生殖內(nèi)分泌疾病的發(fā)生。因此，現(xiàn)對BMP15調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的機(jī)制及與相關(guān)生殖內(nèi)分泌疾病的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BMP15的結(jié)構(gòu)與表達(dá)

BMP15又稱為生長分化因子9B（growth differentiation factor 9B，GDF9B），屬于BMP家族（BMPs）的一員。BMP15基因（OMIM 300247）定位于人X染色體的Xp11.2，由2個編碼蛋白的外顯子和1個非編碼的內(nèi)含子構(gòu)成，被認(rèn)為是首個卵巢決定基因。BMP15蛋白以前肽前體的方式合成，隨后以同源或異源二聚體的形式加工和分泌。BMP15先被翻譯為包含1個氨基（N）端信號肽，1個前結(jié)構(gòu)域和1個羧基（C）端成熟結(jié)構(gòu)域的前體蛋白，在去除信號肽后，前體蛋白發(fā)生二聚化并在保守的蛋白酶水解位點（RXXR）被前轉(zhuǎn)化酶進(jìn)一步切割，最終形成成熟的二聚化功能蛋白并分泌至卵泡液中。由于缺乏共價鍵連接的半胱氨酸殘基，BMP15主要以同二聚體或異二聚體的形式發(fā)揮作用。研究表明，BMP15與其高度同源的GDF9以非共價鍵連接的形式形成異二聚體“cumulin”，在調(diào)控顆粒細(xì)胞功能與改善卵母細(xì)胞質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用[5]。

BMP15高表達(dá)于生長期的卵母細(xì)胞，其表達(dá)量有物種和時空差異。在人類，BMP15在胚胎時期的始基卵泡階段即開始表達(dá)，并一直持續(xù)到排卵前。此外，BMP還表達(dá)于顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞[6]。

2 BMP15參與的信號通路

BMP15主要依賴于經(jīng)典的Smad信號通路發(fā)揮功能。BMP15以成熟的二聚體形式首先在顆粒細(xì)胞膜表面與2種特定組合的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，即Ⅱ型受體骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2）與Ⅰ型受體激活素受體樣激酶6（activin receptor-like kinase 6，ALK6），隨即磷酸化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Smad1/5/8，并最終與Smad4形成一個三聚體復(fù)合物易位至細(xì)胞核，通過與特定轉(zhuǎn)錄因子相互作用共同活化或抑制下游基因的表達(dá)。除了經(jīng)典的Smad信號通路，許多非Smad依賴性通路也參與BMP15信號的活化。如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路，主要涉及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38/MAPK等信號分子，不同信號通路之間的串?dāng)_共同形成一個BMPs信號網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育與閉鎖。

3 BMP15的生理功能

3.1 促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育BMP15促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟，并改善后續(xù)胚胎發(fā)育。研究表明，在牛卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）期間，添加BMP15可顯著提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛能，增加成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量，并能提高后續(xù)卵裂率及囊胚質(zhì)量，促進(jìn)胚胎發(fā)育[7-9]。Dey等[10]認(rèn)為BMP15協(xié)同GDF9不僅能促進(jìn)卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟，還能防止透明帶硬化，促進(jìn)正常受精并改善胚胎發(fā)育。

BMP15通過協(xié)同雙調(diào)蛋白（amphiregulin）、上調(diào)卵丘擴(kuò)張相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)卵母細(xì)胞代謝及營養(yǎng)供應(yīng)，提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。雙調(diào)蛋白作為表皮生長因子樣肽的一種，能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。卵母細(xì)胞的發(fā)育離不開擴(kuò)張卵丘細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，卵丘細(xì)胞由顆粒細(xì)胞分化而來，其包繞在卵母細(xì)胞周圍并與卵母細(xì)胞緊密接觸，調(diào)控卵母細(xì)胞的生長發(fā)育。研究表明，BMP15與雙調(diào)蛋白相互作用，可促進(jìn)代謝物從卵丘細(xì)胞的間隙連接轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞，從而增強(qiáng)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能[11]。此外，BMP15還可通過上調(diào)透明質(zhì)酸酶2（hyaluronan synthase 2，HAS2）、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6（tumor necrosis factor alpha-induced protein 6，TNFAIP6）與前列腺素合成酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）等基因的表達(dá)促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)張，擴(kuò)張的卵丘細(xì)胞通過增強(qiáng)卵母細(xì)胞所需的營養(yǎng)供應(yīng)，促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量[12]。此外，BMP15可作為預(yù)測卵母細(xì)胞成熟的指標(biāo)[13]。

3.2 促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖分化體外實驗已證實BMP15可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖分化，具有促有絲分裂的作用[14]。BMP15可通過Smad和非Smad途徑上調(diào)卵泡刺激素受體（follicle -stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）的表達(dá)，增加顆粒細(xì)胞對卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）的敏感性，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖分化。一方面，BMP15通過磷酸化Smad1/5/8，增加FSHR啟動子區(qū)域的組蛋白乙?；{(diào)控其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使其更易被轉(zhuǎn)錄因子上游刺激因子1/2（upstream stimulatory factors 1 and 2，USF1/2）結(jié)合；另一方面，BMP15還可通過激活非經(jīng)典的p38/MAPK通路直接上調(diào)FSHR的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子USF1/2[15]。

此外，BMP15可通過Kit配體及其受體（Kit ligand receptor，c-kit）信號介導(dǎo)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的交流，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。BMP15可直接刺激顆粒細(xì)胞中Kit配體的表達(dá)，同時與卵母細(xì)胞表達(dá)的c-kit信號相互作用，通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞的有絲分裂促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。顆粒細(xì)胞表達(dá)的Kit配體可與卵母細(xì)胞表面的c-kit結(jié)合，以抑制卵母細(xì)胞中BMP15的分泌。因此BMP15與Kit配體的負(fù)反饋系統(tǒng)可介導(dǎo)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的交流，并能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖分化，在卵泡發(fā)生早期起著重要的作用[16]。

3.3 抑制卵泡凋亡卵泡凋亡是卵泡閉鎖的內(nèi)在機(jī)制，卵泡閉鎖在卵泡發(fā)育的任何階段均可發(fā)生，是卵泡的一種退化過程，對維持和調(diào)控卵泡內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。在哺乳動物中，絕大部分的卵泡均會發(fā)生閉鎖，只有不到1%的卵泡發(fā)育為優(yōu)勢卵泡并最終排卵。一般認(rèn)為，卵泡閉鎖始于顆粒細(xì)胞凋亡，促凋亡因子與促生存因子之間的微妙平衡決定著卵泡最終的命運。

體外實驗證明，BMP15具有抗卵丘細(xì)胞凋亡的作用[17]。卵丘細(xì)胞是一種特殊的顆粒細(xì)胞，其圍繞在卵母細(xì)胞周圍并向其輸送生存所需營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物，卵丘細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵母細(xì)胞代謝受損、發(fā)育停滯和卵泡閉鎖。BMP15可以通過上調(diào)抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、下調(diào)促凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)，抑制卵丘細(xì)胞凋亡，促進(jìn)顆粒細(xì)胞生存[17]。自殺相關(guān)因子（factor associated suicide，F(xiàn)as）/Fas配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）是介導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡的主要信號通路，BMP15能通過趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）介導(dǎo)的Fas/FasL通路抑制豬卵丘細(xì)胞的凋亡，其還可通過抑制凋亡相關(guān)基因原纖維蛋白1（fibrillin1，F(xiàn)BN1）的表達(dá)促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖[18]。叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）作為顆粒細(xì)胞凋亡效應(yīng)物，在氧化應(yīng)激條件下可顯著增強(qiáng)顆粒細(xì)胞凋亡率。研究表明，BMP15可能通過下游Smad4信號抑制顆粒細(xì)胞中FOXO1的表達(dá)，從而起到抗顆粒細(xì)胞凋亡的作用[19]。

3.4 調(diào)節(jié)類固醇激素生成BMP15可抑制孕酮的過早產(chǎn)生，預(yù)防卵泡過早黃體化。過早黃體化是輔助生殖領(lǐng)域中的熱點問題。臨床上為了實現(xiàn)多卵泡發(fā)育，高劑量FSH的使用可通過刺激相關(guān)酶的活性，如3β-羥基類固醇脫氫酶（3 β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD/HSD3B1），促進(jìn)孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮，造成孕酮的過早升高[20]，導(dǎo)致過早黃體化的發(fā)生。BMP15可通過下調(diào)FSHR，阻礙相關(guān)FSH依賴性基因，如P450側(cè)鏈裂解酶（P450 side chain cleavage enzyme，P450scc/CYP11A1）、3β-HSD/HSD3B1 和LH受體（luteinizing hormone receptor，LHR）的表達(dá)，從而抑制FSH誘導(dǎo)的孕酮過早產(chǎn)生[21]，有利于防止種植窗前移，保證胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜容受性的同步，促進(jìn)胚胎植入和妊娠維持。類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）作為膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮的關(guān)鍵酶，是黃體化的重要標(biāo)志。Chang等[22]認(rèn)為BMP15可以通過ALK3介導(dǎo)的Smad1/5/8通路下調(diào)StAR的表達(dá)，降低孕酮的產(chǎn)生，在卵泡發(fā)育的晚期階段抑制卵泡過早黃體化。

此外，BMP15還參與雌激素的調(diào)節(jié)。BMP15可通過下游Smad4信號，促進(jìn)FSH誘導(dǎo)的類固醇生成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子CYP11A1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)雌二醇（estradiol，E2）的產(chǎn)生[23]。CYP19A1是將雄烯二酮轉(zhuǎn)化為E2的關(guān)鍵芳香化酶，是E2合成中關(guān)鍵的類固醇調(diào)節(jié)因子，參與FSH誘導(dǎo)的卵泡中E2的產(chǎn)生。Shimizu等[15]研究表明，BMP15可通過增加FSHR上調(diào)CYP19A1的表達(dá)，從而提高E2的水平。

4 BMP15與生殖內(nèi)分泌疾病的關(guān)系

4.1 PCOSPCOS是一種涉及生殖、內(nèi)分泌和代謝的終身性疾病，影響多達(dá)17%的育齡期女性，是無排卵性不孕的主要原因[24]。近年研究表明PCOS患者卵泡液中BMP15的表達(dá)降低，可能通過誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致PCOS患者的卵泡發(fā)育不良，推測PCOS的發(fā)病與遺傳和環(huán)境因素關(guān)系密切，卵泡微環(huán)境異?？赡苡绊懧雅莅l(fā)育[1]。

卵泡異常閉鎖尤其是早卵泡期卵泡的發(fā)育停滯是PCOS患者卵泡發(fā)育的典型特征[25]。Wei等[26]采用免疫組織化學(xué)方法分析PCOS女性與正常排卵女性卵巢組織中BMP15蛋白表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)與正常排卵女性相比，PCOS女性卵巢組織中始基卵泡、初級卵泡和次級卵泡的顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的BMP15含量顯著降低，而排卵前卵泡的BMP15含量卻與正常排卵女性相當(dāng)，鑒于BMP15具有調(diào)節(jié)早卵泡期卵泡發(fā)育及閉鎖的作用，認(rèn)為BMP15表達(dá)下降可能參與介導(dǎo)PCOS患者早卵泡期卵泡發(fā)育不良。上調(diào)BMP15的表達(dá)可通過增加促生存因子Bcl-2、降低促凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表達(dá)，防止卵泡過度凋亡，從而對PCOS患者具有潛在治療作用[1]。

已有研究表明，BMP15的基因突變參與PCOS發(fā)病。Liu等[27]對216例中國PCOS患者進(jìn)行BMP15的編碼區(qū)突變分析發(fā)現(xiàn)，與200例生育力正常的健康對照組女性相比，PCOS患者的BMP15中顯示了5個新的錯義突變（c.34C＞G、c.109G＞C、c.169C＞G、c.288G＞C和c.598C＞T）。Mehdizadeh等[28]對70例伊朗PCOS患者的BMP15基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），基因測序發(fā)現(xiàn)PCOS患者BMP15基因的外顯子1存在2種突變體（BMP15基因5′非編碼區(qū)啟動子區(qū)域中的c.-9C＞G和BMP15基因外顯子編碼區(qū)中的c.A308G）。因此認(rèn)為BMP15與PCOS的發(fā)病密切相關(guān)，其表達(dá)下降可能通過影響早卵泡期的卵泡發(fā)育參與PCOS的發(fā)生。

4.2 POIPOI是一種女性在40歲之前出現(xiàn)的卵巢功能減退現(xiàn)象，影響1%～2%的女性。POI患者卵巢中卵子的質(zhì)量與數(shù)量顯著降低，臨床多表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)，伴隨FSH升高和雌激素不足。POI病因復(fù)雜，可歸因于自身免疫、病毒感染、遺傳和醫(yī)源性因素等，遺傳變異在POI的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[29]。BMP15作為卵泡微環(huán)境中重要的生長因子，其突變與POI的發(fā)生密切相關(guān)，其可通過調(diào)節(jié)卵泡凋亡及始基卵泡的激活改善女性卵巢儲備力。

BMP15的基因突變介導(dǎo)POI的發(fā)生。母豬基因敲除實驗表明，敲低BMP15基因可導(dǎo)致卵巢大小及卵泡數(shù)量顯著減少，導(dǎo)致卵巢功能減退[30]。Di Pasquale等[31]運用PCR技術(shù)對患有卵巢功能衰竭的兩姐妹進(jìn)行候選基因篩查，首次報道了BMP15基因（p.Y235C）的雜合錯義突變可能介導(dǎo)POI的發(fā)生。這種位于BMP15第2個外顯子上的基因突變可導(dǎo)致前體蛋白的異常加工，并可能通過損害BMP15對顆粒細(xì)胞的促有絲分裂作用，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞增殖減退，介導(dǎo)POI的發(fā)病。Rossetti等[32]認(rèn)為BMP15基因前區(qū)和成熟肽中的雜合錯義突變可能干擾BMP15與GDF9形成的異二聚體“cumulin”的活性，導(dǎo)致卵泡耗竭率增加，從而誘發(fā)POI。Afkhami等[33]采用直接測序法對24例伊朗POI婦女進(jìn)行BMP15基因檢測，篩選發(fā)現(xiàn)了新的p.N103K 和p.M184T突變，這2種突變均編碼BMP15的前結(jié)構(gòu)域，與繼發(fā)性閉經(jīng)、FSH升高和卵巢萎縮等表現(xiàn)密切相關(guān)。此外，還有研究揭示了POI與BMP15基因突變的相關(guān)性。Ferrarini等[34]在1例POI女性中篩選出了BMP15基因的新雜合突變c.406G＞C（V136L）。Santos等[35]發(fā)現(xiàn)BMP15:c.852C＞T中變異的基因型CT和TT可能是POI發(fā)生的危險因素。

卵子發(fā)生障礙、凋亡加速和始基卵泡的加速耗竭是POI發(fā)生的根本原因。顆粒細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致卵母細(xì)胞賴以生存的生長因子、營養(yǎng)及代謝物質(zhì)減少，阻滯卵母細(xì)胞發(fā)育，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡。BMP15可通過抑制顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵子發(fā)育成熟，調(diào)控卵巢儲備。在哺乳動物中，始基卵泡的數(shù)量決定卵巢儲備力，始基卵泡的過度激活或加速丟失可能加快原始卵泡池的耗竭，導(dǎo)致卵巢儲備功能下降。BMP15可通過調(diào)節(jié)始基卵泡激活所需的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號調(diào)控卵巢儲備功能。此外，Park等[36]的研究表明，卵巢內(nèi)BMP15的表達(dá)與女性年齡呈負(fù)相關(guān)，是預(yù)測卵巢儲備功能和生殖衰老的潛在分子。因此基于BMP15與POI的相關(guān)性，BMP15有望作為臨床上診治POI的相關(guān)生物靶點。

5 結(jié)語

BMP15對卵母細(xì)胞發(fā)育成熟、顆粒細(xì)胞增殖分化、卵泡閉鎖以及類固醇激素的調(diào)節(jié)具有重要的作用。BMP15的表達(dá)降低或基因突變與PCOS、POI等多種生殖內(nèi)分泌疾病密切相關(guān)。然而PCOS、POI等均為多基因影響的疾病，單一靶點突變尚不能充分解釋所有的臨床病理改變，因此未來可采用全外顯子測序等方法，以篩選BMP15與相關(guān)其他基因突變共同介導(dǎo)疾病發(fā)生的可能性。此外，現(xiàn)有的針對BMP15基因突變的臨床研究存在樣本量小、缺乏可重復(fù)性及通用性的問題。未來可進(jìn)一步開展大樣本量及多中心的隨機(jī)對照研究，以明確BMP15在相關(guān)生殖疾病中的確切作用機(jī)制?？傊?，了解BMP15在卵泡發(fā)生過程中的作用及參與相關(guān)生殖內(nèi)分泌疾病的發(fā)生機(jī)制不僅有利于促進(jìn)其成為相關(guān)診療靶點，還能為臨床上一些高危人群的遺傳咨詢以及生育力保存提供重要理論依據(jù)。