張海情 陳艷萍 張 瑾

1.湖南省兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科（湖南長(zhǎng)沙 410007）；2.南華大學(xué)兒科學(xué)院(湖南長(zhǎng)沙 410007)

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae,MP）是社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的主要病原體之一，結(jié)構(gòu)上分3層，分別為內(nèi)外層的蛋白質(zhì)層及中間層的脂質(zhì)層，依賴與宿主細(xì)胞的緊密結(jié)合而生存，因此細(xì)胞膜一端向外延伸形成一種復(fù)雜而特殊的黏附細(xì)胞器來(lái)促進(jìn)其寄生生存[1]。MP肺炎(Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP)是由MP感染引起的肺部炎癥，常引起呼吸系統(tǒng)癥狀，以發(fā)熱、咳嗽為主要臨床表現(xiàn)，可引起肺外系統(tǒng)的嚴(yán)重表現(xiàn)。MPP 在我國(guó)有較高的發(fā)病率，占兒童CAP的10%～40%[2]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是治療MP 感染的首選藥物。自2000 年以來(lái)，耐大環(huán)內(nèi)酯類MP感染率在全球迅速增加[3]，以亞洲國(guó)家尤為嚴(yán)重，其中中國(guó)耐藥率可達(dá)69%～95%[4]。因此，在合理使用抗生素的同時(shí)，需加大對(duì)新藥的研發(fā)及新型預(yù)防措施的研究。

疫苗是預(yù)防與控制病原菌流行、感染及致病的最佳手段。自疫苗問(wèn)世以來(lái)，多種疾病發(fā)病率明顯降低。流感疫苗預(yù)防率可達(dá)59%[5]，兒童接種肺炎鏈球菌疫苗后可降低肺炎住院率[6]，新生兒期接種卡介苗，不僅可預(yù)防結(jié)核病，還可幫助新生兒免受其他非特異性感染[7]。由此可見，疫苗接種可有效阻斷病原菌傳播，降低人群感染和發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。迄今為止，獸用MP疫苗已在國(guó)內(nèi)外上市，并取得了良好的保護(hù)效果，而針對(duì)人的MP疫苗仍處于研發(fā)階段。目前關(guān)注的重點(diǎn)主要集中于MP相關(guān)的亞單位疫苗、表位肽疫苗、DNA 疫苗及活載體疫苗等。本文就現(xiàn)有MP疫苗的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 全菌體疫苗

全菌體疫苗包括滅活疫苗和減毒活疫苗，滅活疫苗又稱死疫苗，是指利用理化方法將人工培養(yǎng)的完整的病原微物殺死，使其喪失感染性和毒性而保持免疫原性。減毒活疫苗是指病原體經(jīng)過(guò)各種處理后發(fā)生變異，毒性減弱，但仍保留其免疫原性。接種后病原體可在機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，從而獲得長(zhǎng)期或終生保護(hù)。滅活疫苗可誘導(dǎo)以體液免疫為主的免疫反應(yīng)，它產(chǎn)生的抗體有中和、清除病原微生物及其產(chǎn)生的毒素的作用。

1.1 滅活疫苗

在一項(xiàng)關(guān)于MP 疫苗的保護(hù)效果和不良反應(yīng)的meta分析中，作者對(duì)20世紀(jì)60～70年代開展的關(guān)于滅活肺炎支原體疫苗的保護(hù)效果及不良反應(yīng)進(jìn)行分析和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)MP 滅活疫苗對(duì)MPP 的預(yù)防率維持在29%～74%，同時(shí)可使MP所致肺炎及呼吸道感染發(fā)病率下降40%[8]。然而Smith等[9]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MP滅活疫苗對(duì)免疫后能產(chǎn)生有效抗體的志愿者具有免疫保護(hù)作用，但可致免疫后未產(chǎn)生有效抗體者易感性增加，使MP滅活疫苗進(jìn)一步研發(fā)受到了限制。

1.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗可誘導(dǎo)體液和細(xì)胞兩種免疫反應(yīng)，部分制品可誘導(dǎo)黏膜免疫，使機(jī)體獲得較廣泛的免疫保護(hù)。減毒活疫苗通常由體外連續(xù)傳代和/或溫度敏感突變體產(chǎn)生。目前，MP減毒活疫苗已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得一定的成果，但由于其存在較大的安全隱患，因此至今尚未開展以人為對(duì)象的臨床試驗(yàn)。

2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是通過(guò)化學(xué)分解或有控制性的蛋白質(zhì)水解方法，提取病原菌的特殊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，篩選出具有免疫活性的片段制成疫苗[10]。MP 的黏附細(xì)胞器分布有各種黏附蛋白，這些黏附輔助蛋白和黏附分子共同形成黏附復(fù)合物，宿主細(xì)胞的吸附能力取決于黏附蛋白的定位和蛋白質(zhì)復(fù)合物組分之間的相互作用。P1、P30、P116 等蛋白作為黏附復(fù)合物的主要成分在MP的黏附和滑動(dòng)過(guò)程中起了關(guān)鍵作用,這些蛋白的缺失及突變可導(dǎo)致MP黏附功能的喪失，滑動(dòng)能力降低，形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，是潛在的疫苗靶點(diǎn)[1]。

2.1 P1蛋白

P1蛋白是MP的主要黏附蛋白，由MPN141基因編碼形成，主要附著于細(xì)胞器頂端，根據(jù)DNA 序列可分為1型(MP1)和2型(MP2)，它們具有不同的致病潛力。最新研究表明MP 2 株感染可能比MP 1株感染的毒性更強(qiáng)，更易引起神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病[11]，因此有學(xué)者推測(cè)基因分型對(duì)于未來(lái)疫苗的研究或許有至關(guān)重要的作用。

P 1 蛋白在MP 黏附、滑動(dòng)過(guò)程中有重要作用，通過(guò)與呼吸道上皮細(xì)胞表面的唾液酸化寡糖受體結(jié)合，破壞氣道黏膜的完整性，抑制纖毛運(yùn)動(dòng)、消耗上皮細(xì)胞周圍的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步影響細(xì)胞代謝[12]，針對(duì)P1黏附素的抗體可以特異性地阻斷MP與宿主的結(jié)合，并降低其滑動(dòng)速度[13]。近來(lái)Widjaja等[14]研究發(fā)現(xiàn)了P 1 蛋白與宿主結(jié)合的新結(jié)構(gòu)域，將P 1黏附素從17個(gè)切割位點(diǎn)形成22種不同蛋白質(zhì)形態(tài)，模擬了不同蛋白質(zhì)形態(tài)與纖溶酶原、纖維連接蛋白、肌動(dòng)蛋白等宿主蛋白區(qū)域的結(jié)合，表明每一種蛋白質(zhì)都保留了與宿主分子或其模擬結(jié)構(gòu)結(jié)合的能力，可通過(guò)免疫機(jī)制誘導(dǎo)MP 的定植。另一方面，P 1 蛋白可在MP感染患者血清中檢測(cè)到，研究表明P1蛋白C端具有高度免疫原性，并出現(xiàn)在各種抗MP重組疫苗中，是極具價(jià)值的疫苗候選抗原[15]。為了識(shí)別P1內(nèi)被宿主體液免疫反應(yīng)識(shí)別的區(qū)域，Schurwanz等[16]合成了15個(gè)跨P1分子的重組片段，一個(gè)在N端，兩個(gè)跨越C端區(qū)域，將其暴露于MP感染患者的血清中，超過(guò)90%患者的血清具有強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性。

P1蛋白作為目前最有潛力的疫苗候選抗原，有不少研究者對(duì)其進(jìn)行了研究。賈飛勇等[17]研究用P1蛋白免疫動(dòng)物小鼠后感染MP，發(fā)現(xiàn)免疫組支氣管肺泡灌洗液sIgA明顯高于未免疫組，且其肺炎支原體培養(yǎng)均為陰性；未免疫組出現(xiàn)肺炎的小鼠數(shù)遠(yuǎn)高于免疫組，且病變較免疫組重，這表明P1蛋白對(duì)MP感染有預(yù)防作用。Meng等[18]研究發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D可通過(guò)降低P1和P30蛋白的mRNA的表達(dá)來(lái)抑制MP對(duì)上皮細(xì)胞的黏附，以達(dá)到治療和預(yù)防MPP的效果，雖然其為中藥成分，但對(duì)于疫苗的研究有極大的參考價(jià)值。Kenri等[19]通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了具有折疊結(jié)構(gòu)的重組P1蛋白，其結(jié)構(gòu)與生殖支原體P1蛋白的結(jié)構(gòu)相似，此發(fā)現(xiàn)有助于P1蛋白結(jié)構(gòu)、功能及抗體制備的研究。Drasbek等[20]研究發(fā)現(xiàn)P1蛋白可阻斷MP對(duì)HEp-2細(xì)胞的黏附，從而使黏附在宿主細(xì)胞上的MP微菌落數(shù)量顯著減少，發(fā)揮保護(hù)作用。朱翠明等[21]構(gòu)建了重組P1C片段(rP1C)，發(fā)現(xiàn)其能黏附HeLa細(xì)胞，而抗-rP1C抗體可阻斷MP對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附，說(shuō)明P1C具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。Chourasia等[15]通過(guò)密碼子優(yōu)化技術(shù)將P1基因合成為4個(gè)不同的片段，并將其克隆在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該P(yáng)1基因多個(gè)位點(diǎn)均含有免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域，且針對(duì)N 端區(qū)域和C 端區(qū)域的抗體能阻止MP黏附，是潛在的疫苗靶點(diǎn)。

2.2 P30蛋白

P30是大小約為30-kDa的跨膜蛋白，位于MP黏附器的遠(yuǎn)端，具有免疫原性。P 30 參與MP 黏附、滑行運(yùn)動(dòng)，是MP 重要的毒力因子[22]。Schurwanz等[16]通過(guò)對(duì)MP P1和P30中的關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，獲得了新型重組蛋白，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，針對(duì)該蛋白的抗體可顯著減少M(fèi)P 在人支氣管上皮細(xì)胞的黏附率，具有減少甚至預(yù)防MP 在呼吸道定植的作用。Hausner等[23]利用嵌合重組蛋白HP14/30，將P1和P30表面定位、黏附相關(guān)的區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)鼻內(nèi)接種方式免疫豚鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組疫苗可誘導(dǎo)豚鼠持久穩(wěn)定的IgA相關(guān)免疫應(yīng)答，且攻毒后，免疫組豚鼠MP特異性基因拷貝數(shù)量明顯減少。

2.3 P116蛋白

P 116 是MP 重要的黏附素分子之一。在MP 致病過(guò)程中，P116同樣具有免疫原性，可獨(dú)立于其他兩種黏附素P1、P30而發(fā)揮作用[24]。Svenstrup等[25]成功合成了P116特異性抗體，將其與MP進(jìn)行反應(yīng)，隨后通過(guò)熒光顯微鏡觀察MP 對(duì)HEp-2 細(xì)胞的黏附活動(dòng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗P116特異性抗體可阻斷MP對(duì)HEp-2細(xì)胞的黏附，發(fā)揮保護(hù)作用。

2.4 P1 -P40/P90

P1與作為輔助蛋白的P40、P90組成跨膜黏附復(fù)合體，在MP黏附過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Vizarraga等[26]對(duì)P1、P40/P90結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者在胞外區(qū)整體結(jié)構(gòu)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似。另外針對(duì)P 1 C 端結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的多克隆抗體可抑制MP 的黏附，同時(shí)P40/P90對(duì)MP感染后人血清也表現(xiàn)出強(qiáng)反應(yīng)性，這也為將來(lái)MP疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

2.5 MP559蛋白

Chen等[27]成功合成了P116N蛋白（P116的 N端跨膜蛋白）、P1C蛋白（P1的C端跨膜蛋白）、P30蛋白及嵌合蛋白P116N-P1C-P30(簡(jiǎn)稱MP559)。用純化的4 個(gè)蛋白分別免疫新西蘭大白兔，通過(guò)ELISA法評(píng)估其免疫原性。結(jié)果表明，4種重組蛋白均能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，且MP559蛋白同時(shí)含有上述3種抗原表位，可作為疫苗候選抗原。

P 1、P 30 及其他黏附相關(guān)蛋白作為MP 黏附因子的重要組成部分，具有良好的免疫原性及免疫反應(yīng)性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，是有希望在將來(lái)獲得成功的疫苗靶點(diǎn)。但亞單位疫苗的研發(fā)仍面臨著較多的挑戰(zhàn)：①蛋白體外表達(dá)率低，且純化過(guò)程較復(fù)雜；②與減毒疫苗及DNA 疫苗相比，亞單位疫苗無(wú)法進(jìn)行自我復(fù)制，因此需要多次免疫；③當(dāng)在不同的體系進(jìn)行表達(dá)時(shí)，亞單位天然構(gòu)象可能遭到破壞。這些都是在未來(lái)的研究中需要解決的問(wèn)題。

3 表位肽疫苗

表位肽疫苗是用抗原表位氨基酸序列制備的疫苗，包括合成肽疫苗、重組表位疫苗及表位核酸疫苗，是目前研制感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的方向。Chen等[28]通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)P1C T-B細(xì)胞表位進(jìn)行分析，并合成了相應(yīng)的表位肽疫苗。通過(guò)皮下注射方式免疫小鼠，隨后用MP菌株進(jìn)行攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P1C T-B表位肽(P1C103-117,P1C155-169,P1C224-238 及 P1C244-258) 可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的IgG 及IgA 抗體。與對(duì)照組相比，表位肽疫苗組小鼠體內(nèi)MP 定植量及炎性因子水平明顯降低。Vilela Rodrigues等[29]基于比較基因組學(xué)和反向疫苗學(xué)，對(duì)88個(gè)MP基因組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了7種可用于疫苗研發(fā)的蛋白質(zhì)。并對(duì)上述蛋白的氨基酸序列的B 細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些表位能被免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。Unni等[10]通過(guò)免疫信息學(xué)技術(shù)，從MP 的12個(gè)膜相關(guān)蛋白、5個(gè)細(xì)胞黏附蛋白中篩選出3 個(gè)表位肽疫苗：WIHGLILLF、VILLFLLLF 及LLAWMLVLF。上述表位肽疫苗具有較多T 細(xì)胞、B 細(xì)胞表位，與HLA 分子親和性高，可為機(jī)體在抗MP感染中提供良好的免疫保護(hù)效果。

表位肽疫苗在MP 感染中具有免疫保護(hù)效果，目前已在體外水平及動(dòng)物水平中獲得了成功，但尚無(wú)人體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，仍需進(jìn)一步深入研究。

4 CARDS毒素疫苗

社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征（communityacquired respiratory distress syndrome，CARDS）毒素是由MP 產(chǎn)生的具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞空泡化活性的外毒素，在MP致病過(guò)程中起重要作用。CARDS毒素首先與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的途徑被內(nèi)化，然后運(yùn)輸?shù)教囟ǖ募?xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)特征性空泡化，最終引起細(xì)胞死亡[30]。在BALB/c小鼠模型中，小鼠感染MP后，其肺泡灌洗液和肺組織中可檢測(cè)到CARDS 毒素，且濃度與MP 菌量、肺部炎癥程度密切相關(guān)。同時(shí)急性期和恢復(fù)期MP 感染血清中均檢測(cè)到CARDS 毒素抗體，而對(duì)照血清中CARDS 毒素抗體水平較低[31]。為了進(jìn)一步研究CARDS毒素在人體內(nèi)的免疫學(xué)特點(diǎn)，Kannan等[32]對(duì)9例MP感染患者急性期及恢復(fù)期體內(nèi)抗CARDS抗體水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在MP感染急性期，患者體內(nèi)抗CARDS毒素抗體水平呈輕度升高，然而恢復(fù)期患者體內(nèi)抗CARDS 毒素抗體水平顯著升高。表明CARDS毒素具有較好的免疫原性。

動(dòng)物水平及人體水平體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)MP 感染后抗CARDS 毒素抗體水平會(huì)顯著上升，且有報(bào)道CARDS毒素的C端區(qū)域可誘導(dǎo)相應(yīng)抗體產(chǎn)生[33]，表明減毒CARDS疫苗有望成為新的研究方向。

5 DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA 疫苗結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，抗原相關(guān)表位比較穩(wěn)定；其次，由于DNA 序列編碼的病毒基因單一，基本沒(méi)有毒性逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，DNA 疫苗的生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸成本低于傳統(tǒng)疫苗。這使得MP DNA疫苗成了近年來(lái)研發(fā)的熱點(diǎn)。Zhu等[34]將P1C與大腸桿菌不耐熱毒素B亞基(LTB)進(jìn)行融合，構(gòu)建了LTB-P1C 融合DNA疫苗。通過(guò)鼻腔接種方式免疫BALB/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組對(duì)比，接種融合DNA疫苗的小鼠抗MP抗體、IgA和IgG水平顯著升高，表明LTB-P1C融合DNA疫苗能在小鼠抗MP感染中發(fā)揮免疫保護(hù)作用。

MP DNA疫苗優(yōu)勢(shì)在于毒性低、性質(zhì)穩(wěn)定、可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答，但與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA 疫苗無(wú)法在哺乳動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，誘導(dǎo)的抗體水平較低，并且如何選擇靶基因、如何控制免疫耐受、如何避免DNA與人類染色體異常結(jié)合并表達(dá)等，都是DNA疫苗的研發(fā)中亟待解決的問(wèn)題。

6 其他疫苗

6.1 多糖疫苗

病原菌表面存在多種糖類物質(zhì)，它們?cè)谧R(shí)別、信號(hào)傳遞、黏附、感染及防御等方面發(fā)揮著重要作用。由于多糖的免疫原性，可將特異性的多糖純化后制成多糖疫苗為機(jī)體提供免疫保護(hù)作用[35]。目前，已成功研制出肺炎球菌和腦膜炎球菌多糖疫苗，這為其他病原菌多糖疫苗的研究提供了參考。Brunner等[36]用MP 多糖疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)MP 多糖疫苗可誘導(dǎo)免疫組動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體。為了驗(yàn)證疫苗的保護(hù)效果，研究者對(duì)免疫組進(jìn)行了攻毒實(shí)驗(yàn)，并于攻毒后10天進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組肺損傷病理評(píng)分和肺內(nèi)活菌數(shù)量顯著減少。

6.2 糖脂疫苗

MP 表面由富含抗原蛋白和糖脂的細(xì)胞膜所覆蓋，MP表面糖脂已被證明在小鼠和人體內(nèi)具有高度的免疫原性，是潛在的疫苗候選抗原[37]。目前認(rèn)為，針對(duì)糖脂的免疫反應(yīng)是由B-1a細(xì)胞等驅(qū)動(dòng)，而布魯頓酪氨酸激酶(Btk)缺陷小鼠因缺乏B-1 a 細(xì)胞，無(wú)法進(jìn)行由糖脂誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

為了評(píng)估抗糖脂抗體在MP 感染及免疫中的作用，研究者對(duì)MP感染后的小鼠血清進(jìn)行了檢測(cè)，并在其中檢測(cè)到抗MP 蛋白抗體及抗MP 糖脂抗體。隨后，研究者用MP感染Btk缺陷小鼠發(fā)現(xiàn)，感染后的Btk小鼠可產(chǎn)生抗MP蛋白的特異性IgG抗體，但無(wú)法產(chǎn)生抗MP 糖脂的特異性抗體。接著，通過(guò)對(duì)Bkt 缺陷小鼠及野生型小鼠肺部MP 清除率來(lái)評(píng)估小鼠感染后恢復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)二者感染后恢復(fù)程度相當(dāng)，表明針對(duì)蛋白質(zhì)而非糖脂結(jié)構(gòu)的抗體，在宿主抗MP感染發(fā)揮重要保護(hù)作用[38]。因此，以多糖、糖脂類為抗原的疫苗可能無(wú)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答，且分子擬態(tài)誘導(dǎo)的交叉反應(yīng)性可引起多器官損傷，使得MP 多糖及糖脂疫苗的研發(fā)變得更為復(fù)雜。

6.3 活載體疫苗

活載體疫苗(live vector vaccine，LVV)是以細(xì)菌或病毒作為外源抗原和治療因子的載體系統(tǒng)，將免疫原基因通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)重組到載體基因上，隨后接種動(dòng)物表達(dá)重組蛋白，以產(chǎn)生抗原，刺激特定的免疫反應(yīng)。LVVs 所選擇的多是無(wú)毒細(xì)菌菌株（如枯草芽孢桿菌），益生菌（如乳酸桿菌）或減毒菌株（如減毒李斯特菌）。LVVs 有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如安全性高，可長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液及黏膜免疫，且可制成多價(jià)疫苗，是潛在的候選疫苗，也是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ幕蚬こ桃呙缰?。以減毒微生物，如沙門菌、李斯特菌、痘病毒和流感病毒作為活載體的疫苗現(xiàn)已廣泛應(yīng)用[39-41]。目前，尚無(wú)人用MP活載體疫苗問(wèn)世，但已成功研發(fā)出針對(duì)豬MP的疫苗。

目前研究表明利用其他毒力因子（如多糖類、脂質(zhì)類、糖脂類等）研發(fā)的疫苗可能無(wú)法誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生持久的免疫保護(hù)作用，而且分子擬態(tài)效應(yīng)可誘導(dǎo)免疫交叉反應(yīng)，有進(jìn)一步加重臟器損害的風(fēng)險(xiǎn)。LVV可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，然而LVVs 的研發(fā)同樣存在著許多困難，如何使外源基因穩(wěn)定表達(dá)、如何避免LVVs從減毒株轉(zhuǎn)化成毒性株等都是在研發(fā)過(guò)程中需要解決的問(wèn)題。

7 疫苗增強(qiáng)性疾病

疫苗增強(qiáng)性疾病(VED)常發(fā)生于接種疫苗后再次感染相應(yīng)病原體。迄今為止，尚無(wú)人用MP疫苗問(wèn)世，免疫后再次感染所引發(fā)的疫苗增強(qiáng)性疾病是原因之一。MP 缺乏細(xì)胞壁,其所引起的一系列炎癥反應(yīng)很大程度上是其細(xì)胞膜上脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipidassociated membrane proteins，LAMP)所致，而脂蛋白是LAMP 中的主要成分。脂蛋白中的脂質(zhì)成分具有免疫原性，在被Toll 樣受體識(shí)別后可誘導(dǎo)機(jī)體分泌TNF-α、IL-6 及IL-1 β 等炎性因子。Mara 等[42]利用MP脂相關(guān)膜蛋白免疫BALB/c小鼠，隨后用致病性MP菌株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比免疫后小鼠在MP定植量上無(wú)減少，且出現(xiàn)了嚴(yán)重的肺損傷。而在接種前去除LAMP 上的脂質(zhì)部分可以消除上述情況。表明脂蛋白中的脂質(zhì)部分是MP的VED 發(fā)生的原因。這為將來(lái)人用MP 疫苗研發(fā)提供了一定的借鑒。

總之，MP 在所有人群中普遍易感。近年來(lái)，對(duì)于MP 耐藥菌株或多重耐藥菌的感染率逐年上升，其臨床治療非常困難，因此研發(fā)MP疫苗迫在眉睫。目前，有多種MP疫苗正在研發(fā)中，包括全菌體疫苗、亞單位疫苗、表位肽疫苗及DNA 疫苗等。這些疫苗多通過(guò)鼻內(nèi)免疫及皮下注射免疫。全菌體疫苗可被滅活或制成減毒活疫苗，其中滅活疫苗在免疫功能正常的患者中可誘導(dǎo)針對(duì)終端細(xì)胞器相關(guān)蛋白的特異性抗體產(chǎn)生，但對(duì)于免疫后未產(chǎn)生有效抗體的個(gè)體，當(dāng)MP 再感染時(shí)，可出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫損傷。以黏附因子為靶點(diǎn)的疫苗具有較好的免疫原性及免疫反應(yīng)性，可通過(guò)阻止MP 對(duì)宿主呼吸道上皮的粘附發(fā)揮保護(hù)作用，但是由于蛋白體外表達(dá)率低、天然構(gòu)象易遭到破壞，使其進(jìn)一步研發(fā)受到了限制。MP本身無(wú)法誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，因此輔以佐劑（如鋁佐劑）可能是未來(lái)一個(gè)新的研究方向。另外，LVVs目前尚處于研發(fā)階段，其前景值得期待，并且以益生菌為表達(dá)載體的LVVs有望通過(guò)氧氣霧化和/或口服方式進(jìn)行免疫，這較傳統(tǒng)的免疫方式有了極大的改進(jìn)。當(dāng)前，MP疫苗研究所面臨的挑戰(zhàn)主要包括以下兩個(gè)方面：一是如何使疫苗誘發(fā)持久有效的免疫應(yīng)答，并在保證免疫效果的同時(shí)提高疫苗的穩(wěn)定性；另外，疫苗的安全性也是研發(fā)需要關(guān)注的重點(diǎn)，免疫后出現(xiàn)的疫苗增強(qiáng)性疾病可對(duì)宿主造成的不可逆的損害。綜上所述，篩選更合適的疫苗靶點(diǎn)，研發(fā)新的免疫策略，將是今后研究的重點(diǎn)方向。相信隨著研究的深入，在不久的將來(lái)MP 疫苗研發(fā)技術(shù)會(huì)更加成熟，新型疫苗也將更安全、高效、價(jià)廉。